Microglia als een surrogaat Biosensor om te bepalen nanodeeltjes Neurotoxiciteit

Het algemene doel van dit protocol is om een in vitro surrogaat biosensor te beschrijven voor het testen van de microglia-respons op nanodeeltjes. We zullen vervolgens de neurotoxiciteit bepalen na blootstelling aan geconditioneerd medium van door nanodeeltjes gestimuleerde microglia. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het neurowetenschapsveld, zoals hoe actief nanodeeltjes gescreend worden op neurotoxiciteit.

Het grote voordeel van deze techniek is dat ons model de mogelijkheid biedt om direct microglia te activeren en te bepalen of geheime factoren neurotoxinen zijn zonder het gebruik van dure langetermijnstudies met knaagdieren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in microglia-geïnduceerde celdood na blootstelling aan microdeeltjes. Het kan ook worden toegepast op andere modellen van neurodegeneratieve ziekten in de context van het testen van potentieel neurotoxische milieuverontreinigingen.

Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen met de filterfase van het conditiemedium. Omdat de filterefficiëntie kan verschillen afhankelijk van de grootte, vorm en de concentratie van de nanodeeltjes. Ter voorbereiding verwarm je het DMEM aangevuld met 10%FBS en 1%PSN tot 37 graden Celsius.

Neem vervolgens bevroren BV2 microgliale cellen verkregen uit passages 18 25 en ontdooi ze snel bij 37 graden Celsius. Breng de ontdooide cellen vervolgens voorzichtig over in een 75 vierkante centimeter geventileerde fles met 10 milliliters medium en incubeer de fles. Na 24 uur vervang je het medium en laat je de cellen verder groeien tot ze een confluïteit van 70-80% bereiken. Op dit punt aspirieer je het medium en voeg je 500 microliters warme 1 ex trypsine EDTA-oplossing toe.

Laat de fles een paar minuten incuberen en gebruik vervolgens een schraper om de cellen te verzamelen in 5 milliliters warm DMEM. Filtreer vervolgens de cellen uit de fles met een 70 micron zeef. Herhaal deze filtratie drie keer met dezelfde zeef en verzamel de cellen in een 50 milliliters buis.

Na het filteren, tel je de cellen en zaai je een zwart-wandige heldere bodemplaat met 8000 cellen per putje in 200 microliters aangevuld DMEM. Na 24 uur incubatie, vervang je het medium in de putjes door serumvrij DMEM om de microglia te hongeren. Na nog eens 24 uur incubatie, ga je verder met het activeren van de microglia.

Om dit te doen, verdun je eerst zilveren nanodeeltjes in serumvrij DMEM tot de gewenste werkconcentratie. Vervolgens vervang je 100 microliters medium door de behandelingsverbinding. Zorg ervoor dat je een negatieve controle van verdunde voertuigoplossing zonder de nanodeeltjes opneemt.

Ga verder met de incubatie gedurende 24 uur en ga door met de analyse. Om te beginnen verzamel je 200 microliters supernatant medium uit elke put van de plaat en laad je het op een filter die de nanodeeltjes zal verwijderen die boven een microcentrifugebuis wordt geplaatst. Het is belangrijk om te onthouden dat bij het filteren van de nanodeeltjes hun grootte, vorm en de concentratie een factor zijn voor de fusie-efficiëntie.

Daarom is het raadzaam om de filtratie vooraf te testen. Spin de buizen vervolgens 15 minuten op 14000g bij kamertemperatuur. Gooi vervolgens de flow-through weg die de nanodeeltjes bevat en plaats de filters ondersteboven in nieuwe opvangbuizen.

Spin de filters ondersteboven gedurende twee minuten bij 1000g om geconcentreerd geconditioneerd medium met cytokinen te verzamelen. Verhoog vervolgens het volume van de opvang tot 400 microliters met vers gemaakt aanvullend DMEM en bewaar de buizen op ijs. Om ervoor te zorgen dat resterende zwavelnanodeeltjes worden verwijderd uit het gefilterde medium, bereid je ongefilterde nanodeeltjesstandaarden voor op een reeks concentraties van een blanco tot 0,2 microgram per milliliter in serumvrij DMEM.

Deel vervolgens 50 milliliter van de gefilterde monsters en van elke standaard in een zwart-wandige heldere bodemplaat en meet de absorptie van 390 tot 410 nanometer. Om de concentratie van TNF-alfa in de monsters te meten, gebruik je de helft van hun resterende volume in een commercieel verkrijgbaar kit. Voor deze assay stel je hypothalamuscellen op uit bevroren voorraden.

Gebruik dezelfde methoden die zijn beschreven voor het opzetten van microgliale culturen. Uiteindelijk gebruik je ze om zwart-wandige heldere bodemplaatjes te zaaien met 5000 cellen per putje in 200 microliters aangevuld DMEM. Na 24 uur kweken, verwijder je 100 microliters medium en vervang je het door 100 microliters gefilterd en geconcentreerd medium verzameld uit de geactiveerde microgliale celculturen en incubeer je de plaat vervolgens 24 uur onder standaardcondities.

De volgende dag voeg je 22 microliters resazurin reagens toe aan elke put en ga je verder met de incubatie gedurende 20 minuten. Neem vervolgens met een multi-mode spectrofotometer een fluorescentiemeting om de levensvatbaarheid van de cellen te schatten in termen van relatieve fluorescentie-eenheden. Met het beschreven protocol kan microgliafunctie worden gebruikt als een surrogaat biosensor voor de respons van de hersenen op nanodeeltjes.

TNF-alfa secretie door microglia werd significant verhoogd na blootstelling aan zilveren nanodeeltjes. Toen hypothalamusneuronen werden blootgesteld aan geconditioneerd medium van door zilveren nanodeeltjes geactiveerde microglia, was de levensvatbaarheid van de neuronen significant verminderd. In principe activeerde blootstelling aan de zilveren nanodeeltjes de microglia tot een M1 pro-inflammatoire toestand.

Vervolgens dragen de vrijgekomen pro-inflammatoire cytokinen bij aan de dood van omliggende cellen. Na het bekijken van deze video zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je microglia kunt gebruiken als een surrogaat biosensor voor het testen van de respons op nanodeeltjes en of deze respons neurotoxisch is. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in drie of vier dagen worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd.

Volgend op deze procedure kunnen andere methoden, zoals het profileren van andere uitgescheiden cytokinen na microglia-activatie, worden uitgevoerd om de activeringsto