Name: Microglia als een surrogaat Biosensor om te bepalen nanodeeltjes Neurotoxiciteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Ontdek hoe microglia als surrogaatbiosensor nanodeeltjesneurotoxiciteit bepaalt via geconditioneerd medium. Deze in vitro-methode biedt een kosteneffectief alternatief voor dierproeven in neurotoxicologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door het Amerikaanse Department of Veterans Affairs BLR&D IK2 BX001686 (aan TAB), en subsidies van het University of Minnesota Healthy Foods, Healthy Lives Institute (aan CMD, JPN, en TAB) en de Minnesota Veterans Medical Research & Education Foundation (aan TAB). We danken Drs. Philippe Marambaud (Feinstein Institute for Medical Research, Manhasset, NY) en Weihua Zhao (Methodist Hospital, Houston, TX) voor het verstrekken van de BV2 cellijn.

1. Microgliale Cell Culture Onderhoud <ol><li> Warme celkweekmedium (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium; DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine / neomycine (PSN) tot 37 ° C. </li><li> Verkrijgen bevroren voorraad van BV2 microglia cellen bij passage 18-25 uit de opslag bij -80 ° C. Snel ontdooien cellen in 37 ° C waterbad. </li><li> Voorzichtig cellen overbrengen naar een 75 cm2 kolf ontlucht met 10 ml celkweekmedium. </li><li> Incubeer kolf in 5% CO2 bij 37 ° C. Zuig media na 24 uur en te vervangen door vers medium. Grow cellen tot ongeveer 70 - 80% samenvloeiing. </li></ol> 2. Tellen en Plating Cellen <ol><li> In een 37 ° C waterbad, warm DMEM en 1x-trypsine-EDTA-oplossing. </li><li> Aspireren media van cellen en voeg 500 ul van trypsine. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2-5 min. </li><li> Met behulp van een schraper, verwijdert cellen uit de kolf en op te schorten in 5 mlDMEM. Cellen passeren door een 70 urn zeef in een 50 ml buisje driemaal. </li><li> Aantal cellen met een hemocytometer en zaden 8000 cellen / putje in een ommuurde zwarte heldere bodem plaat in een eindvolume van 200 ul DMEM gesupplementeerd met 10% FBS en 1% PSN. Incubeer plaat in 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 24 uur. </li><li> Verwijderen oude DMEM en vervangen door 200 ui DMEM aangevuld verwarmd met 1% PSN serum verhongeren microglia. Incubeer plaat in 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 24 uur. </li></ol> 3. Activeren Microglia <ol><li> In afzonderlijke buisjes verdund AgNPs (0,01, 0,05 of 0,1 ug / ml) en voertuig / neutraal sturingspunt (natriumcitraat, 0,04 mM) in serumvrij DMEM aangevuld met 1% PSN uiteindelijke werkende concentraties. </li><li> Verwijder 100 ul van de media uit elk putje en te vervangen door 100 ul van een passende behandeling verbinding. </li><li> Incubeer plaat in 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 24 uur. </li></ol> 4. Filtering geconditioneerde media <ol><li> Verzamel 200 pl medium supernatant uit elk putje en over in een filter (molecuulgewicht cutoff van 10 kDa) met verzamelbuis (1,5-2 ml). </li><li> Centrifugeer bij 14.000 xg bij kamertemperatuur gedurende 15 min. </li><li> Gooi het doorstroomkanaal (supernatant met deeltjes) en plaats de filter omgekeerd in een nieuwe verzamelbuis. </li><li> Centrifugeer bij 1000 xg bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Opmerking: Het verkregen gefiltreerde medium (bevattende uitgescheiden cytokinen) wordt geconcentreerd door zesvoudige. </li><li> Breng het volume van het concentraat tot 400 ul vers DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% PSN en bewaar op ijs. OPMERKING: Om ervoor te zorgen resterende AgNPs zijn van een gefilterde media verwijderd, wordt een AgNP concentratie op basis van de karakteristieke piek bij ongeveer 390-420 nm 10. Kort samengevat, aliquots van ongefilterde AgNPs (0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1 en 0,2 ug / ml zoals beschreven in stap 3,1) en gefiltreerdmediumcontrole (natriumcitraat, 0,04 mM) in serumvrij DMEM. Aliquot 50 pi gefilterde monsters en standaarden in een zwart ommuurde duidelijk bodemplaat. Met behulp van een spectrofotometer, meet absorptie bij 390-410 nm en vergelijken lezingen aan de AgNP concentratie curve. Indien gefilterde monsters dezelfde absorptiewaarde als het voertuig controle monster, kan worden aangenomen resterende AgNPs verwijderd. </li><li> Gebruik de helft van de gefiltreerde media TNF-α secretie volgende instructies bepalen van een commercieel verkrijgbare kit. </li></ol> 5. hypothalamus Cell Culture Onderhoud <ol><li> Warme DMEM kweekmedium aangevuld met 10% FBS en 1% PSN tot 37 ° C. </li><li> Verkrijgen bevroren voorraad van de hypothalamus (mHypo-A1 / 2) cellen bij passage 18-25 opgeslagen bij 80 ° C. Snel ontdooien cellen in 37 ° C waterbad. </li><li> Voorzichtig cellen overbrengen naar een 75 cm2 kolf ontlucht met 10 ml celkweekmedium. </li><li> Incubeer kolf in 5% CO 2 </sub&gt; bij 37 ° C. Zuig media na 24 uur en te vervangen door vers medium. Cellen groeien tot ongeveer 70 - 80% confluentie. </li></ol> 6. Het bepalen van de hypothalamus Cell Toxicity <ol><li> Warme DMEM en 1 x trypsine-EDTA-oplossing in een 37 ° C waterbad. </li><li> Aspireren media van de hypothalamus cellen en voeg 500 ul van trypsine. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2-5 min. Verwijderen cellen van kolf met een schraper zoals hierboven in stap 2. </li><li> Aantal cellen met een hemocytometer en plaat hypothalamus cellen bij 5000 cellen / putje in een zwarte wanden heldere bodemplaat in een eindvolume van 200 ul DMEM gesupplementeerd met 10% FBS en 1% PSN en overnacht incuberen in 5% CO2 bij 37 ° C . </li><li> Verwijder 100 pl oude media met een multichannel pipet en voeg 100 gl gefiltreerd geconcentreerd geconditioneerd medium tot een uiteindelijke concentratie van 1x. </li><li> Incubeer plaat in 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 24 uur. </li><li> Voeg 221, l Resazurin reagens en incubeer dienblad 20 min in 5% CO2 bij 37 ° C. </li><li> Met behulp van een multimode spectrofotometer, opnemen fluorescentie (560 nm EX / 590 nm EM) levensvatbaarheid van de cellen te meten. Rapporteren resultaten als relatieve fluorescentie-eenheden (RFU). </li></ol>

<ol><li>Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution%3A+mechanisms+of+neuroinflammation+and+CNS+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease.</a> Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).</li>
<li>Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+daily+inhalation+rates+for+health+risk+assessment+in+overweight%2Fobese+children%2C+adults%2C+and+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Risk+Anal%22%5BJournal%5D)">Physiological daily inhalation rates for health risk assessment in overweight/obese children, adults, and elderly.</a> Risk Anal. 34, 567-582 (2014).</li>
<li>Jerrett, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic-related+air+pollution+and+obesity+formation+in+children%3A+a+longitudinal%2C+multilevel+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health%22%5BJournal%5D)">Traffic-related air pollution and obesity formation in children: a longitudinal, multilevel analysis.</a> Environ Health. 13, 49(2014).</li>
<li>Kraft, A. D., Harry, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+microglia+and+neuroinflammation+relevant+to+environmental+exposure+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Environ+Res+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity.</a> Int J Environ Res Public Health. 8, 2980-3018 (2011).</li>
<li>Duffy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+orexin+A+signaling+in+dietary+palmitic+acid-activated+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Role of orexin A signaling in dietary palmitic acid-activated microglial cells.</a> Neurosci Lett. 606, 140-144 (2015).</li>
<li>Butterick, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+caspase+multiplexing+assay+to+determine+apoptosis+in+a+hypothalamic+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+cell+viability+and+proliferation+in+hydrogel-encapsulated+system+by+resazurin+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay.</a> Appl Biochem Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).</li>
<li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf%2Fv-myc+carrying+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus.</a> J Neuroimmunol. 27, 229-237 (1990).</li>
<li>Belsham, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+recruitment+of+glucagon-like+peptide-1+mediates+neurogenesis%2C+allowing+immortalization+of+adult+murine+hypothalamic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor recruitment of glucagon-like peptide-1 mediates neurogenesis, allowing immortalization of adult murine hypothalamic neurons.</a> FASEB J. 23, 4256-4265 (2009).</li>
<li>Paramelle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+to+estimate+the+concentration+of+citrate+capped+silver+nanoparticles+from+UV-visible+light+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A rapid method to estimate the concentration of citrate capped silver nanoparticles from UV-visible light spectra.</a> Analyst. 139, 4855-4861 (2014).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+air+pollution+particles+increases+the+risk+of+obesity+and+metabolic+syndrome%3A+findings+from+a+natural+experiment+in+Beijing%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to air pollution particles increases the risk of obesity and metabolic syndrome: findings from a natural experiment in Beijing.</a> FASEB J. , (2016).</li>
<li>Levesque, S., Surace, M. J., McDonald, J., Block, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution+%26+the+brain%3A+Subchronic+diesel+exhaust+exposure+causes+neuroinflammation+and+elevates+early+markers+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Air pollution & the brain: Subchronic diesel exhaust exposure causes neuroinflammation and elevates early markers of neurodegenerative disease.</a> J Neuroinflammation. 8, 105(2011).</li>
<li>Block, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outdoor+air+pollution+and+brain+health+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">The outdoor air pollution and brain health workshop.</a> Neurotoxicology. 33, 972-984 (2012).</li>
<li>Carson, M. J., Crane, J., Xie, A. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+CNS+microglia%3A+the+quest+to+identify+predictive+models%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Dis+Models%22%5BJournal%5D)">Modeling CNS microglia: the quest to identify predictive models.</a> Drug Discov Today Dis Models. 5, 19-25 (2008).</li>
<li>Valdearcos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+dictate+the+impact+of+saturated+fat+consumption+on+hypothalamic+inflammation+and+neuronal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Microglia dictate the impact of saturated fat consumption on hypothalamic inflammation and neuronal function.</a> Cell Rep. 9, 2124-2138 (2014).</li>
<li>Perry, V. H., Holmes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+priming+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Microglial priming in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurol. 10, 217-224 (2014).</li>
<li>Block, M. L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+microglial+activation+and+progressive+dopaminergic+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity.</a> Biochem Soc Trans. 35, 1127-1132 (2007).</li>
<li>Vincenti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Microglia+Response+during+the+Time+Course+of+Chronic+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Defining the Microglia Response during the Time Course of Chronic Neurodegeneration.</a> J Virol. 90, 3003-3017 (2015).</li>
<li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+brain+region-dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nat Neurosci. 19, 504-516 (2016).</li>
<li>Lull, M. E., Block, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+and+chronic+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Microglial activation and chronic neurodegeneration.</a> Neurotherapeutics. 7, 354-365 (2010).</li>
<li>Oeckinghaus, A., Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+in+NF-kappaB+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Crosstalk in NF-kappaB signaling pathways.</a> Nat Immunol. 12, 695-708 (2011).</li>
<li>Gifford, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-modified+gold+nanoparticles+for+the+inhibition+of+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Thiol-modified gold nanoparticles for the inhibition of Mycobacterium smegmatis.</a> Chem Commun (Camb). 50, 15860-15863 (2014).</li>
<li>Colella, M., Lobasso, S., Babudri, F., Corcelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid+is+associated+with+halorhodopsin+as+a+free+fatty+acid.+Radiolabeling+of+halorhodopsin+with+3H-palmitic+acid+and+chemical+analysis+of+the+reaction+products+of+purified+halorhodopsin+with+thiols+and+NaBH4%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid is associated with halorhodopsin as a free fatty acid. Radiolabeling of halorhodopsin with 3H-palmitic acid and chemical analysis of the reaction products of purified halorhodopsin with thiols and NaBH4.</a> Biochim Biophys Acta. 1370, 273-279 (1998).</li>
<li>Sherry, B., Jue, D. M., Zentella, A., Cerami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+high+molecular+weight+glycosylated+forms+of+murine+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Characterization of high molecular weight glycosylated forms of murine tumor necrosis factor.</a> Biochem Biophys Res Commun. 173, 1072-1078 (1990).</li>
<li>PubChem Compound Database. , National Center for Biotechnology Information. 
 <a target="_blank" href="https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755">https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755</a> (2004).</li>
<li>Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+induced+by+fibrillar+beta-amyloid+and+IgGs+are+differentially+regulated+by+proinflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines.</a> J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).</li>
<li>McCarthy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+adult+murine+immortalized+microglial+cell+line+and+its+activation+by+amyloid-beta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel adult murine immortalized microglial cell line and its activation by amyloid-beta.</a> J Neuroinflammation. 13, (2016).</li>
<li>Schauer, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+apportionment+of+airborne+particulate+matter+using+organic+compounds+as+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos+Environ%22%5BJournal%5D)">Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers.</a> Atmos Environ. 30, 3837-3855 (1996).</li>
<li>Kleeman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+apportionment+of+fine+%28PM1.8%29+and+ultrafine+%28PM0.1%29+airborne+particulate+matter+during+a+severe+winter+pollution+episode%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Source apportionment of fine (PM1.8) and ultrafine (PM0.1) airborne particulate matter during a severe winter pollution episode.</a> Environ Sci Technol. 43, 272-279 (2009).</li>
<li>Borm, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+risks+of+nanomaterials%3A+a+review+carried+out+for+ECETOC%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC.</a> Part Fibre Toxicol. 3, (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Recente studies ondersteunen dat blootstelling aan het milieu bijdraagt aan obesitas en andere neurodegeneratieve ziekten 11,12. Echter, technieken die in eerdere studies werden gebruikt, zijn tijdrovend en duur. Economische overwegingen, fysiologisch relevante afleveringssystemen, ethische kwesties met uitgebreid gebruik van in vivo diermodellen en de moeilijkheid om bevindingen te vertalen in zinvolle gezondheidsadviezen zijn enkele van de grote uitdagingen die de vooruitgang in het onderzoek naar N...

Milieuverontreinigingen, bijzonder diegenen van de nanodeeltjes (NP) range (1-20 nm diameter), zijn gekoppeld aan obesitas en andere neurodegeneratieve ziekten als gevolg van het vermogen om de bloed-hersenbarrière passeren 1-3. Verhoogde blootstelling aan verontreiniging kan ontsteking veroorzaken in het centrale zenuwstelsel waaronder de hypothalamus 1. Een mogelijk mechanisme waarop dit gebeurt kunnen plaatsvinden door middel nanodeeltjes activatie van microglia (hersenen immuuncellen) 4. Voorafgaande studies die in vivo modellen om de effecten van NPs gezondheid hersenen die tijdrovend, kostbaar zijn bestuderen, en niet direct de vraag hoe NPs beïnvloeden microglia beantwoorden. Microglia spelen een veelzijdige rol in het centrale zenuwstelsel, zoals het onderhoud van de hersenen en micro communiceren met omgeving neuronen via de afgifte van uitgescheiden factoren en cytokinen. Afhankelijk van de stimuli, kan microglia worden geactiveerd om een ​​M1 pro-inflammatoire of een M2 anti-inflammatoire toestand. Bijvoorbeeld M1 geactiveerde microglia vrijgeven pro-inflammatoire cytokines zoals tumor necrose factor alpha (TNF-α), terwijl M2 microglia afgifte anti-inflammatoire cytokinen geactiveerd zoals interleukine-4 (IL-4). Om onze surrogaat in vitro biosensor te valideren voor het bepalen van neurotoxiciteit van luchtverontreinigende stoffen, we gemeten microglia respons op 20 nm zilver nanodeeltjes (AgNPs). Het doel van dit artikel wordt beschreven hoe een in vitro microgliacellen cellijn kan worden gebruikt als een surrogaat marker voor biosensor testen muizen microgliale reactie op NPs en hoe microgliale activering beïnvloedt hypothalamus cellen. De lange termijn beoogde toepassing van deze gevalideerd model is om de effecten van real-world stoffen op de gezondheid van de hersenen en neurodegeneratieve ziekte te testen. Wij een gedetailleerde beschrijving van een in vitro 96 putjes format assay voor het meten van microgliale activering en hypothalamus celoverleving na blootstelling van mic<html> roglial geconditioneerde media. Microgliale activering werd bepaald na AgNP blootstelling door TNF-α enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA). Om het effect van geactiveerde microglia op hypothalamus cellen te bepalen werden de AgNPs uit microglia supernatant (geconditioneerde media) met een filtreerinrichting. De filtratie-apparaat behoudt cytokines met uitsluiting van de AgNPs op basis van grootte. In het kort supernatans van microglia behandeld met of zonder AgNPs werd verzameld, toegevoegd aan de filters en gecentrifugeerd bij 14.000 xg gedurende 15 min. We konden vervolgens de invloed van microgliale uitgescheiden cytokines op hypothalamus cellevensvatbaarheid te bepalen. Cel toxiciteit na blootstelling aan geconditioneerde media (bevattende cytokines) werd bepaald via een resazurin gebaseerde assay zoals eerder beschreven 5,6. Metabool actieve cellen reduceren resazurin en produceren een fluorescentiesignaal evenredig met het aantal levensvatbare cellen 7. nt &quot;&gt; Er zijn verschillende voordelen van het gebruik van deze techniek anderen (zoals co-cultuur, trans-well opstellingen of in vivo). Ons model biedt de mogelijkheid om direct activeren microglia en bepalen of uitgescheiden factoren toxisch voor neuronen 8 . het huidige protocol gebruikt geïmmortaliseerde BV2 microglia gestimuleerd met 20 nm diameter nanodeeltjes en geïmmortaliseerde muizen hypothalamus cellen (aangeduid mHypo-A1 / 2) 9 voor het bepalen van verdere reactie. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor deze specifieke omstandigheden, de werkwijzen kunnen worden veranderd te worden gebruikt in andere modellen van microgliale geïnduceerde celdood of andere celtypen waaronder primaire microglia en neuronen.

<table><tbody><tr><td>Cellen/Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse microgliale cellijn (BV2)</td><td>Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italië)</td><td>ATL03001</td><td></td></tr><tr><td>Volwassen muis hypothalamus cellijn mHypoA-1/2&nbsp;</td><td>Cellutions Biosystems Inc.</td><td>CLU172</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Gemodificeerd Eagle&rsquo;s Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum&nbsp;</td><td>PAA Labs</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine/Neomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15640-055</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Zilveren nanodeeltjes (20 nm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>730793</td><td></td></tr><tr><td> PrestoBlue Celviabiliteitsreagens</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td></td></tr><tr><td>Muis TNF-&alpha; ELISA Max Delux</td><td>Biolegend</td><td>430904</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 W Optische Bodemplaat, Zwart Polystyreen, Voor Celcultuur Behandeld, met deksel, Sterile</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugaalfiltereenheid met Ultracel-10 membraan</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC501008</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate</td><td>Molecular Devices</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Conische Centrifugeerbuizen</td><td>Corning, Inc</td><td> 14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Celzeevers 70 &mu;m</td><td>Corning, Inc</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Tabelcentrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>22620560</td><td></td></tr></tbody></table>

microglia als een surrogaat biosensor om te bepalen nanodeeltjes neurotoxiciteit

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

Nanodeeltjes die in luchtvervuilende stoffen worden aangetroffen, kunnen neurotransmitterprofielen veranderen, neuro-inflammatie verhogen en de hersenfunctie veranderen. Daarom zal de hier beschreven test helpen bij het verduidelijken van de rol van microglia bij neuro-inflammatie en neurodegeneratieve ziekten. Het gebruik van microglia, residente immuuncellen van de hersenen, als een surrogaat biosensor biedt nieuwe inzichten in hoe inflammatoire reacties neuronale beschadigingen mediëren. Hier gebruiken we een geïmmortaliseerde muis-microgliale cellijn, aangeduid als BV2, en beschrijven een methode voor blootstelling aan nanodeeltjes met behulp van zilveren nanodeeltjes (AgNP's) als standaard. We beschrijven hoe microglia aan nanodeeltjes kunnen worden blootgesteld, hoe nanodeeltjes uit het supernatant kunnen worden verwijderd, en hoe supernatant van geactiveerde microglia kan worden gebruikt om toxiciteit te bepalen, waarbij de overleving van hypothalamuscellen als maatstaf wordt gebruikt. Na blootstelling aan AgNP's werd de activering van BV2-microglia gevalideerd met behulp van een tumornecrosefactor alfa (TNF-α) enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA). Het supernatant werd vervolgens gefilterd om de AgNP te verwijderen en om cytokinen en andere uitgescheiden factoren in het geconditioneerde medium te laten blijven. Hypothalamuscellen werden vervolgens blootgesteld aan supernatant van AgNP-geactiveerde microglia en de overleving van neuronen werd bepaald met behulp van een resazurin-gebaseerde fluorescentie-assay. Deze techniek is nuttig voor het gebruik van microglia als een surrogaat biomarker van neuro-inflammatie en het bepalen van het effect van neuro-inflammatie op andere celtypen.

We laten zien dat microglia fungeren als surrogaat biosensor voor hersenen reactie op nanodeeltjes met het bovenstaande protocol. Onze resultaten zijn onder andere meting van de toxische effecten van microglia activatie op downstream neuronale celdood. Figuur 1 toont een workflow van het protocol bij microglia activeren en bepalen of uitgescheiden cytokines levensvatbaarheid van de hypothalamus neuronen te verminderen. TNF-α secretie was significant toegenomen na blootst...

Microglia (immuuncellen van de hersenen), worden gebruikt als een surrogaat biosensor om te bepalen hoe nanodeeltjes neurotoxiciteit beïnvloeden. We beschrijven een reeks experimenten die zijn ontworpen om de microgliale respons op nanodeeltjes te meten en de blootstelling van hypothalamusneuronen aan supernatant van geactiveerde microglia om neurotoxiciteit te bepalen.

Microglia als een surrogaat Biosensor om te bepalen nanodeeltjes Neurotoxiciteit

Nanoparticles found in air pollutants can alter neurotransmitter profiles, increase neuroinflammation, and alter brain function. Therefore, the assay ...

Het algemene doel van dit protocol is om een in vitro surrogaat-biosensor te beschrijven voor het testen van de microgliële respons op nanodeeltjes. Vervolgens bepalen we de neurotoxiciteit na blootstelling aan geconditioneerde media van microglia die zijn gestimuleerd met nanodeeltjes. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied van de neurowetenschappen, zoals de actieve screening van nanodeeltjes op neurotoxiciteit.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat ons model de mogelijkheid biedt om microglia direct te activeren en vast te stellen of secretieproducten neurotoxines zijn, zonder het gebruik van kostbare langetermijnstudies bij knaagdieren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in microglia-geïnduceerde celdood na blootstelling aan microdeeltjes, kan ze ook worden toegepast op andere modellen van neurodegeneratieve ziekten in de context van het testen van potentiële neurotoxische milieuverontreinigingen.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met de filtratiestap van het geconditioneerde medium. Dit komt omdat de filtratie-efficiëntie kan variëren afhankelijk van de grootte, vorm en concentratie van de nanodeeltjes. Verwarm ter voorbereiding het DMEM, aangevuld met 10% FBS en 1% PSN, tot 37 °C.Neem vervolgens bevroren BV2 microgliacellen verkregen uit passages 18-25 en ontdooi deze snel bij 37 °C. Breng de ontdooide cellen daarna voorzichtig over naar een geventileerde kolf van 75 cm² met 10 mL medium en incubeer de kolf. Vervang na 24 uur het medium en kweek de cellen verder tot ze een confluentie van 70-80% bereiken. Aspireer op dit punt het medium en voeg 500 µL warme 1x trypsin EDTA-oplossing toe.Nadat de kolf nog enkele minuten heeft geïncubeerd, gebruikt u een scraper om de cellen te verzamelen in 5 milliliters warme DMEM. Filter vervolgens de cellen uit de kolf met een 70 micron zeef. Herhaal deze filtratie drie keer met dezelfde zeef en verzamel de cellen in een 50 milliliter buis.Tel na het filteren de cellen en zaai vervolgens een plaat met zwarte wanden en een transparante bodem met 8000 cellen per put in 200 microliters aangevuld DMEM. Vervang na 24 uur incubatie het medium in de putten door serumvrij DMEM om de microglia te uithongeren. Ga na nog eens 24 uur incubatie over tot het activeren van de microglia.Om dit te doen, verdunt u eerst zilvernanodeeltjes in serumvrij DMEM tot de gewenste werkconcentratie. Vervang vervolgens 100 µL medium door de behandelingsverbinding. Zorg ervoor dat u een negatieve controle opneemt van de verdunde oplosmiddeloplossing zonder de nanodeeltjes.Zet de incubatie nu voort gedurende 24 uur en ga over tot de analyse. Begin met het verzamelen van 200 µL supernatantmedium uit elke put van de plaat en breng dit over op een filter dat de nanodeeltjes verwijdert, geplaatst boven een microcentrifugebuisje. Het is belangrijk om te onthouden dat bij het filteren van de nanodeeltjes hun grootte, vorm en concentratie factoren zijn voor de fusie-efficiëntie.Het is daarom raadzaam om de filtratie vooraf te testen. Centrifugeer de buizen nu 15 minuten bij 14000g op kamertemperatuur. Gooi vervolgens het filtraat, dat de nanodeeltjes bevat, weg en plaats de filters ondersteboven in nieuwe opvangbuisjes.Centrifugeer de filters ondersteboven bij 1000g gedurende twee minuten om het geconcentreerde geconditioneerde medium dat cytokinen bevat op te vangen. Verhoog vervolgens het opvangvolume naar 400 µL met vers bereid supplementair DMEM en bewaar de buisjes op ijs. Om er zeker van te zijn dat resterende zwavelnanodeeltjes uit de gefiltreerde media zijn verwijderd, dienen ongefilterde nanodeeltjesstandaarden te worden bereid in een concentratiebereik van een blanco tot 0,2 µg/mL in serumvrij DMEM. Verdeel vervolgens aliquots van 50 milliliters van de gefiltreerde monsters en van elke standaard in een plaat met zwarte wanden en een transparante bodem en meet de absorbantie van 390 tot 410 nanometers. Om de concentratie van TNF-alpha in de monsters te meten, gebruikt u de helft van hun resterende volume in een commercieel verkrijgbare kit. Bereid voor deze assay hypothalamische cellen uit bevroren stocks.Gebruik dezelfde methoden zoals beschreven voor het opzetten van microgliacultures. Gebruik deze uiteindelijk om zwartwandige platen met een transparante bodem te zaaien met 5000 cellen per put in 200 µL aangevuld DMEM. Verwijder na 24 uur cultiveren 100 µL medium en vervang dit door 100 µL gefiltreerd en geconcentreerd medium dat is verzameld uit de geactiveerde microgliacellcultures; incubeer de plaat vervolgens 24 uur onder standaardcondities.Voeg de volgende dag 22 µL resazurine-reagens toe aan elke put en zet de incubatie voort gedurende 20 minuten. Voer vervolgens met een multi-mode spectrofotometer een fluorescentiemeting uit om de levensvatbaarheid van de cellen te schatten in termen van relatieve fluorescentie-eenheden. Met het beschreven protocol kan de microgliafunctie worden gebruikt als een surrogaat-biosensor voor de respons van de hersenen op nanodeeltjes.De secretie van TNF-alfa door microglia was significant verhoogd na blootstelling aan zilvernanodeeltjes. Wanneer hypothalamische neuronen werden blootgesteld aan geconditioneerd medium van de door zilvernanodeeltjes geactiveerde microglia, was de levensvatbaarheid van de neuronen significant verminderd. In principe activeerde blootstelling aan de zilvernanodeeltjes de microglia naar een pro-inflammatoire M1-status.Vervolgens dragen de vrijgekomen pro-inflammatoire cytokinen bij aan de dood van omliggende cellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe microglia kunnen worden gebruikt als surrogaat-biosensor om de respons op nanodeeltjes te testen en of deze respons neurotoxisch is. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in drie of vier dagen worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals het profileren van andere uitgescheiden cytokinen na microgliële activatie, worden uitgevoerd om de fenotypen van microgliële activatietoestanden te bepalen.

microglia-as-surrogate-biosensor-to-determine-nanoparticle

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

BioImaging methoden die worden gebruikt om cellen biodistributie van nanodeeltjes te beoordelen zijn van toepassing voor therapeutische en diagnostische controle van nanoformulated verbindingen. De werkwijzen die hierin beschreven zijn gevoelig en specifiek wanneer beoordeeld door histologische coregistration. De methodieken voor een translationeel weg van knaagdier voor de menselijke toepassingen.

Geregistreerd BioImaging van nanomaterialen voor diagnostische en therapeutische monitoring

Microglia zijn gevestigd macrofagen dat de eerste lijn van verdediging en het immuunsysteem de bewaking van het centrale zenuwstelsel te bieden. MicroRNA zijn moleculen die een belangrijke rol spelen in tal van fysiologische processen, zoals activatie en differentiatie van macrofagen. In dit artikel beschrijven we de methode voor het meten van microRNA's in de microglia.

Detectie van microRNA&#39;s in Microglia door Real-time PCR in Normal CNS en tijdens ontstekingsprocessen

This video demonstrates a method to assess the neurotoxic effects of nanoparticles using microglia. It outlines the steps for activating microglia with nanoparticles, filtering conditioned media to isolate microglia-derived pro-inflammatory cytokines, and testing hypothalamic neuron toxicity with the conditioned media.

Determining Nanoparticle-Induced Toxicity in Neurons Using Microglia as a Surrogate Biosensor

Een sleutel tot succesvolle onderzoek van microglia biologie is het behoud van microglia immunofunction ex vivo tijdens isolatie van CZS-weefsel. Isoleren microglia via roterende schudden resulteert in zeer zuivere en immunofunctional celculturen zoals beoordeeld door fluorescerende beeldvorming, immunocytochemie, en ELISA na microglia-activatie met de pro-inflammatoire stimuli lipopolysaccharide (LPS) en Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolatie van corticale Microglia met Conserven immunofenotype en functionaliteit van Muriene Pasgeborenen

Microglia vormen de bewoner immuuncellen van het centrale zenuwstelsel (CZS) met een hoge capaciteit te fagocyteren of overspoelen materiaal in hun extracellulaire omgeving. Hier wordt een breed toepasbare, betrouwbaar en zeer kwantitatieve assay voor het visualiseren en meten-gemedieerde microglia afblazen van synaptische componenten beschreven.

Een Engulfment Assay: Een protocol bij interacties tussen CNS Fagocyten en Neuronen Assess

Microglia-activatie en microgliose zijn de belangrijkste reacties op chronische neurodegeneratie. Hier presenteren we werkwijzen voor in vivo visualisatietechnieken retinale CX3CR1-GFP + cellen door microgliale confocale Ophthalmoscopie, en drempel en morfometrische analyses worden geïdentificeerd en gekwantificeerd hun activering. We monitoren microglia veranderingen tijdens de vroege stadia van leeftijdsgebonden glaucoom.

In Vivo Dynamiek van retinale Microgliale Activering Tijdens Neurodegeneratie: Confocal oftalmoscopisch Imaging en Cell Morphometry in Mouse Glaucoom

Microgliale fagocytose is essentieel voor het behoud van weefselhomeostase en onvoldoende fagocytosefunctietesten is betrokken bij pathologie. Echter, het beoordelen van microglia functie in vivo is technisch uitdagend. We hebben een eenvoudige maar robuuste techniek ontwikkeld voor het nauwkeurig bewaken en kwantificeren van de fagocytische potentieel van microglia in een fysiologische omgeving.

Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten<em&gt; In Vivo</em&gt; Met behulp van een flowcytometrie-gebaseerde test

Hier presenteren we een protocol microglia van postnatale muizen pups isolaat (dag 1) voor in vitro experimenten. Deze geïmproviseerde winmethode genereert zowel hoge opbrengst en zuiverheid, een significant voordeel boven alternatieve werkwijzen die breed experimenten met het oog op toelichting van microgliale biologie maakt.

Snelle en Geraffineerde CD11b magnetische Isolatie van Primary Microglia met verbeterde zuiverheid en veelzijdigheid

Een protocol voor de isolatie van primaire microglia vanuit lymfkliertest brains wordt gepresenteerd. Deze techniek helpt bij het bevorderen van het huidige begrip van neurologische aandoeningen. Dichtheid kleurovergang centrifugeren en magnetische scheiding worden gecombineerd om voldoende opbrengst van een zeer zuivere monster. Voorts schetsen we de stappen voor de karakterisering van microglia.

Karakterisering en isolatie van de primaire Microglia muis door dichtheid kleurovergang centrifugeren

Dit artikel demonstreert een methode om microglia-motiliteit en contact met postsynaptische puncta in het netvlies te visualiseren en te kwantificeren met behulp van spinning disk confocale microscopie.

Live beeldvorming en karakterisering van microglia-dynamica en interacties met synapsen in een zieke muisnetvlies

Mapping Microglial Parameters Software (MMPS) is een gebruiksvriendelijke analysepijplijn die geen codeerexpertise vereist en semi-automatiseert single-cel microgliale morfologieanalyse op basis van immunofluorescentiebeelden. Gevalideerd in een door knaagdieren geïnduceerd neuro-inflammatiemodel, detecteert MMPS reproductief activatie-geassocieerde morfologische veranderingen en maakt gestandaardiseerde, schaalbare microgliale fenotypering mogelijk.

Mapping Microglial Parameters Software (MMPS): Een open-source, gebruiksvriendelijke tool voor kwantitatieve microglia-morfologieanalyse

Ontdek hoe microglia als surrogaatbiosensor nanodeeltjesneurotoxiciteit bepaalt via geconditioneerd medium. Deze in vitro-methode biedt een kosteneffectief alternatief voor dierproeven in neurotoxicologisch onderzoek.

Microglia als een surrogaat Biosensor om te bepalen nanodeeltjes Neurotoxiciteit

Meer video's verkennen