Aanhoudende toediening van β-cel mitogenen om Intact Mouse Islets

Het algemene doel van dit protocol is het gebruik van Poly(melkzuur-co-glycolzuur) of PLGA-microsferen om verbindingen van belang af te leveren aan gecultiveerde intacte pancreaseilandjes, om zo de effecten van individuele verbindingen op de proliferatie van volwassen pancreatische bètacellen te bestuderen. Deze methode kan worden gebruikt om diverse verbindingen te testen die op een lokale, vertraagde manier aan intacte eilandjes worden toegediend. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat deze gemakkelijk kan worden aangepast voor alternatieve biomaterialen voor toediening, andere verbindingen van belang en verschillende eindpuntanalyses.

Deze methode biedt ook de mogelijkheid om interessante verbindingen toe te dienen in combinatie met de gekozen overdracht van eilandjes in vivo. Taylor Kavanaugh, de promovendus in mijn laboratorium, zal demonstreren hoe de PLGA-microsferen worden gemaakt. Begin met het toevoegen van 1 mg van de fluorescentie-gelabelde verbinding van belang aan 100 µL gedeïoniseerd water om de eerste waterfase te vormen.

Los vervolgens 65 milligrams PLGA op in 750 microliters dichloormethaan in een scintillatiebuisje en behandel het mengsel gedurende 10 tot 30 seconden met ultrasoon geluid bij 160 watts om de PLGA volledig op te lossen. Dit vormt de oliefase. Voeg al het eerste waterfase druppelsgewijs toe aan de oliefase.

Gebruik vervolgens een handhomogenisator om de oplossing gedurende 30 seconden bij 20.000 rpm te emulgeren, zodat de eerste water-olie-fase wordt gevormd. Voeg daarna de gehele eerste water-olie-fase druppelsgewijs toe aan 15 milliliter 1% PVA-oplossing en emulgeer deze zoals zojuist gedemonstreerd. Draag vervolgens het volledige volume van de emulsie over naar een rondbodemkolf van 200 milliliter en gebruik een rotatieverdamper om het oplosmiddel te verwijderen voor de generatie van de waterige fase bij een vacuüm van 635 millimeter kwik gedurende één uur.

Verdeel één milliliter van de waterige fase over 14 microcentrifugebuisjes en pellet de microsferen door centrifugatie. Verwijder na afloop van de centrifugatie met een micropipet 900 microliter van de waterige oplossing uit elk buisje, waarbij u er zorg voor draagt de pellets niet te verstoren. Was de microsferen in één milliliter gedeïoniseerd water, gevolgd door de zorgvuldige verwijdering van 900 microliter van het supernatant.

Voeg vervolgens 900 microliters gedeïoniseerd water toe aan de resterende 100 microliters van de supernatanten. Vortex en soniceer daarna kortstondig om de pellets opnieuw te suspenderen. Nadat de eilandjes zijn geïsoleerd uit de betreffende experimentele dieren, worden 40 visueel qua grootte overeenkomende eilandjes in 200 microliters eilandjeskweekmedium in één well van een 96-well weefselkweekplaat gezaaid.

Resuspendeer de volgende ochtend één aliquot microsferen in pre-assay medium, zodanig dat de uiteindelijke concentratie van de betreffende verbinding in de buis 10 nanograms per microliter is, en sonicize de microsferen in een ijswaterbad gedurende 10 minuten bij 160 watts met pulsen van 10 seconden bij vier degrees Celsius. Verwijder vervolgens voorzichtig 100 microliters islet-kweekmedium uit elke well zonder de eilandjes te verplaatsen, en incubeer de culturen met 100 microliters van het assay medium dat de microsferen bevat. Verwijder na drie dagen voorzichtig het assay medium uit alle wells zonder de eilandjes te verstoren, en was de eilandjes vervolgens voorzichtig twee keer in 200 microliters PBS.

Eilandjes hechten slechts losjes aan een 96-wells plaat. Daarom is het essentieel dat het medium en de PBS voorzichtig uit elke well worden verwijderd, zodat de eilandjes niet per ongeluk worden losgemaakt en weggegooid. Dompel de eilandjes na de tweede wasbeurt voorzichtig onder in 100 µL trypsine EDTA-oplossing gedurende drie minuten bij kamertemperatuur, waarbij na twee minuten voorzichtig wordt gepipetteerd.

Breng het volledige volume van elke put over naar individuele microcentrifugebuisjes en voeg 400 µL eilandjes-kweekmedium toe aan elk buisje om de dissociatie te stoppen. Nadat de met microsferen behandelde eilandjes door centrifugatie zijn verzameld, wordt met een micropipet voorzichtig het supernatant verwijderd en worden de pellets geresuspendeerd in 200 µL vers eilandjes-kweekmedium. Centrifugeer vervolgens de gedissocieerde eilandjes met een cytocentrifuge op geladen microscoopglaasjes.

Teken na het luchtdrogen met een hydrofobe marker een kader rond de eilandjes en fixeer de cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in 75 µL vier procent paraformaldehyde, gevolgd door twee wasbeurten met 75 µL PBS. Permeabiliseer de cellen na de tweede wasbeurt gedurende 10 minuten met 75 µL 0,2% Triton X-100 in PBS, gevolgd door een laatste wasbeurt met alleen 75 µL PBS. Om de eilandjes immunolabelen, plaatst u de objectglazen met de cellen naar boven in een bevochtigingskamer en verwijdert u de PBS.

Blok vervolgens de aspecifieke binding met 75 µL normaal ezelserum bij kamertemperatuur. Vervang na één uur het serum door 75 µL van het gewenste primaire antilichaam en laat dit nog een uur inwerken bij kamertemperatuur. Aspireer na afloop van de incubatie voorzichtig de primaire antilichaamoplossing en was de monsters met 375 µL PBS-wasbuffer.

Incubeer vervolgens de eilandjes met 75 µL van het juiste immunofluorescente gelabelde secundaire antilichaam gedurende één uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Vervang na afloop van de incubatie de secundaire antilichaamoplossing door 75 µL Dappy gedurende drie minuten, gevolgd door een spoeling van vijf minuten in gedeïoniseerd water. Breng na het wassen een druppel van 100 µL sneldrogende monteeroplossing met anti-fade-reagens aan op een glazen dekglas en plaats een microscoopglaasje, met de monsterzijde naar beneden, omgekeerd op de monteeroplossing.

Het grootste deel van de microsferen zal een diameter hebben tussen 1-10 microns, hoewel sommige microsferen groter kunnen zijn. Na de dispersie van de intacte met PLGA-microsferen behandelde eilandjes en de daaropvolgende immunolabeling, is het gebruikelijk om regio's in het monster te observeren die tussen de cellen geen labeling vertonen, veroorzaakt door intacte microsferen die tijdens de wasstappen niet volledig zijn verwijderd. Na de beeldvorming kan het percentage Ki67-insuline-positieve cellen worden gekwantificeerd met behulp van software voor beeldanalyse, of door handmatig het totale aantal gelabelde cellen te tellen.

Het behandelen van de intacte eilandjes gedurende drie dagen met PLGA-microsferen met recombinant humaan bindweefselgroeifactor, zoals zojuist gedemonstreerd, resulteert in een verhoogde bètacelproliferatie, wat aantoont dat het eiwit geen functionaliteit verliest tijdens de generatie van de microsferen. Zodra deze techniek onder de knie is, kunnen er binnen minder dan een week resultaten worden behaald mits deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de impact op de bètacelproliferatie in uw experiment zal variëren afhankelijk van de betreffende verbinding en de exacte afgiftekinetiek van de gegenereerde microsferen.

Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals cotransplantatie van met verbindingen geladen microsferen met intacte pancreaseilandjes, om andere vragen te beantwoorden, zoals of de betreffende verbinding in vivo bètacelproliferatie kan induceren. PLGA heeft een geschiedenis van gebruik in apparaten en drug-delivery-systemen die door de FDA zijn goedgekeurd, waardoor het een goede keuze is voor onderzoekers en clinici die therapeutische lading over een langere periode naar specifieke weefsels willen transporteren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u met verbindingen geladen PLGA-microsferen genereert en deze toediend aan gekweekte intacte eilandjes.

Vergeet niet dat het werken met paraformaldehyde extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, bij het uitvoeren van deze procedure.