Name: Technieken voor Imaging prometaphase metafase van de meiose I in Fixed Drosophila Eicellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Leer hoe je Drosophila-eicellen prepareert voor cytologisch onderzoek naar spindelassemblage en chromosoomoriëntatie tijdens meiose I. Deze methode maakt immunofluorescentie-imaging mogelijk door effectieve verwijdering van eicelmembranen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Christian Lehner voor het verstrekken van het CENP-C-antilichaam en Eric Joyce voor aanbevelingen over FISH. Het werk in het McKim-lab werd gefinancierd door een subsidie van NIH (GM101955).

Noot: Procedures worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld. Temperatuur gecontroleerde incubators worden gebruikt om de temperaturen voor vlieg opfok te behouden en kruisen, tenzij anders vermeld. 1. Voorbereidingen <ol><li> Bereid Flies. <ol><li> Prometafase verrijkt eicel collecties. <ol><li> Clear volwassen vliegt van gezonde, jongvee of cross culturen. Leeftijd flessen gedurende twee dagen bij 25 ° C. OPMERKING: algemeen twee gezonde flessen worden volstaan, hoewel meer nodig kunnen zijn voor sommige kruis culturen. </li><li> Na twee dagen, laat ~ 100 tot 300 vrouwen (die 0-2 dagen op dit punt) van de flessen. De vrouwtjes hoeven geen maagd te zijn. Voeg een schar van gistpasta aan de zijkant van een flesje en plaats 30 vrouwen en 10 tot 15 mannetjes elk in de gegiste flesjes. Leeftijd flesjes gedurende twee dagen bij 25 ° C. </li></ol></li><li> Metaphase verrijkt Oocyte Collecties. <ol><li> Verzamel ~ 100 tot 300 vrouwen uit voorraad of cross cultures. Voeg een schar van gist plakken aan de zijkant van een flacon en plaats 30 vrouwen per stuk (zonder mannetjes toegevoegd) in de gegiste flesjes. Leeftijd flesjes voor 3-5 dagen bij 25 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Bereid Solutions. Opmerking: Oplossingen kunnen onbeperkt worden bewaard bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld. <ol><li> Prepare Gemodificeerd Robb Buffer (5x): 500 mM HEPES, 500 mM sucrose, 275 mM natriumacetaat, 200 mM kaliumacetaat, 50 mM glucose, 6 mM magnesiumchloride en 5 mM calciumchloride. Gebruik 10 N 11: 8 natriumhydroxide: kaliumhydroxide om de pH op 7,4 te brengen. Steriliseren door filtratie; niet autoclaaf. Bewaar bij -20 ° C. Ontdooien als nodig is om voor te bereiden ~ 200 ml 1x Robb&#39;s per eicel prep. </li><li> Fixatie Solutions. <ol><li> Optie # 1: Bereid formaldehyde / heptaan fixatie. Bereid Fixatie buffer: 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) plus 150 mM sucrose. Om gebruik te maken, maken fris met 687,5 ul Fixatie Buffer en 312,5 ul 16% formaldehydeper eicel prep. LET OP: Draag handschoenen tijdens het gebruik van formaldehyde oplossingen in een zuurkast. Verwijdering van afval volgens de institutionele richtlijnen. </li><li> Optie # 2: Bereid formaldehyde / cacodylate fixatie. Bereid Fix Mix: 250 mM sucrose, 100 mM kaliumacetaat (pH 7,5), 25 mM natriumacetaat (pH 7,0) en 25 mM EGTA (pH 8,0). Om gebruik te maken, maken fris met 400 ul Fix Mix, 100 ul kalium cacodylate (1 M, pH 7,2) en 500 ul 16% formaldehyde per eicel prep. LET OP: Kalium cacodylate bevat arsenicum. </li></ol></li><li> Bereid PBS / Triton X-100: 1x PBS plus 1% of 0,05% Triton X-100. Bewaren bij 4 ° C. </li><li> Bereid PBS-Tween 20-runderserumalbumine (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w / v) en 0,1% Tween-20. Kan ongeveer één week bewaard bij 4 ° C. </li><li> Fluorescentie In Situ Hybridisatie (FISH) Solutions. <ol><li> Bereid 20X natriumchloride-natriumcitraat (SSC): 3 M natriumchloride en 0,3 M natriumcitraat. </li><li> Bereid 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2x SSC plus 0,1% Tween-20. Maak verse, ~ 20 ml per eicel prep. </li><li> Bereid formamide oplossingen: 2x SSC, 0,1% Tween-20, plus formamide. Voeg vers, 1 ml 20% formamide, 0,5 ml 40% formamide en 2 ml 50% formamide per oöcyt prep. LET OP: Draag handschoenen tijdens het gebruik van formamide oplossingen in een zuurkast. Verwijdering van afval volgens de institutionele richtlijnen. </li><li> Bereid hybridisatieoplossing: 2x SSC, 50% formamide en 10% dextraansulfaat (w / v). Bewaren bij 4 ° C. </li></ol></li><li> FISH Probes. <ol><li> Order oligonucleotiden (zie Tabel 1 voor sequenties) met HPLC zuivering en gewenste 5 &#39;fluorescerende modificatie (bijvoorbeeld Cy3 en Cy5). Resuspendeer in Tris-EDTA (TE) bij 50 ng / ul. OPMERKING: Bescherm oligo&#39;s van blootstelling aan licht te allen tijde. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Het verzamelen van een laat stadium Drosophila Eicellen <ol><li> Als <em&gt; Drosophila oöcyten met membranen intact zal vasthouden aan plastic en glas, pre-coat de binnenkant van een 5 ml buisje en een Pasteur pipet per eicel prep met PTB. </li><li> Verdoven alle ~ 100 tot 300 gegist vliegen met kooldioxide en toe te voegen aan een blender met ~ 100 ml 1x Robb&#39;s Buffer. Pols drie keer (~ 1 sec elk). Houd eicellen in Robb voor &lt;20 min om de activering te vermijden. LET OP: Als alternatief, eicellen kan worden met de hand ontleed van vrouwtjes. Het voordeel van deze methode is dat het minder vrouwtjes. Wel moet erop worden genomen om de blootstelling aan kooldioxide te beperken tot slechts een paar minuten naar artefacten geassocieerd worden met hypoxie 7 te vermijden. </li><li> Filteren door middel van grote mazen (~ 1500 pm) in 250 ml beker om grote delen van het lichaam te verwijderen. Als veel intact abdomens blijven mesh, re-grind materiaal met behulp van extra Robb&#39;s Buffer en filter weer. Laat bezinken ~ 2 min, dan zuigen off bovenste laag, het verwijderen van zoveel mogelijk van de grote delen van het lichaam mogelijk te maken. </li><li> Filter via kleine mesh (~ 300 micrometer) in een bekerglas van 250 ml. Spoel de resterende eicellen uit de eerste beker met behulp van extra Robb&#39;s en gecoat Pasteur pipet. Laten bezinken ~ 3 min; eicellen zullen bezinken. Zuig uit alle, maar ~ 10 ml. </li><li> Giet zoveel van 10 ml en past in 5 ml gecoate buis. Laten bezinken, te verwijderen vloeistof, en herhaal met de rest. Spoel de resterende eicellen uit de beker met behulp van extra Robb&#39;s en gecoat Pasteur pipet. Laat vestigen in 5 ml buis ~ 3-5 min. </li></ol> 3. Drug Behandelingen (optioneel) <ol><li> Coat een tweede 5 ml buis met PTB voor elke eicel prep. Voeg geschikt oplosmiddel (controle) of geneesmiddel aan 1 ml Robb elk voor elke oöcyt prep (tabel 2). </li><li> Split eicellen naar de tweede gecoat 5 ml buis. Laten bezinken, te verwijderen vloeistof, en voeg 1 ml Robb plus oplosmiddel in één buis en 1 ml Robb&#39;s plus geneesmiddel in tweede buis. Nutate voor de juiste hoeveelheid tijd voor de behandeling met geneesmiddelen (tabel 2). Let vestigen. </li></ol> 4. fixatie <ol><li> Aspireren uit alle vloeibare en onmiddellijk voeg 1 ml Fix. </li><li> Optie # 1: Formaldehyde / heptaan fixatie (Fixation Buffer plus 5% formaldehyde). <ol><li> Fix voor 2,5 min op een nutator. Voeg 1 ml heptaan en vortex 1 min. Laten bezinken ~ 1 min. </li><li> Verwijder alle vloeibare en voeg daarna 1 ml 1x PBS. Vortex 30 sec. Laten bezinken ~ 1 min. </li><li> Verwijder alle vloeibare, en vul buis met 1x PBS. OPMERKING: Eicellen kunnen onmiddellijk worden gebruikt of gehandhaafd nutator verscheidene uren bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Optie # 2: Formaldehyde / cacodylate fixatie (Fix Mix plus 8% formaldehyde en 100 mm cacodylate). <ol><li> Fix voor 6 min op een nutator. Laat bezinken 2 min. Verwijder vloeistof, en vul buis met 1x PBS. OPMERKING: Eicellen kunnen onmiddellijk worden gebruikt of gehandhaafd nutator verscheidene uren bij kamertemperatuur. </li></ol></li></ol> 5. Het verwijderen van Membranen ( &quot;Rolling&quot;) <ol><li> Gebruik van gecoat Pasteur pipet, voeg ~ 500 tot 1000 oöcyten aan de mat (gezandstraald) van een glasplaatje. Verwijder alle lichaamsdelen en vreemde materiaal met behulp van een tang. Laat geen eicellen uitdrogen; voeg 1x PBS als dat nodig is. </li><li> Plaats een dekglaasje op de top van de eicellen en zachtjes &quot;roll&quot; eicellen tot alle membranen worden verwijderd (het slepen van de rand van het dekglaasje over de eicellen het beste werkt.) Controleer regelmatig de vooruitgang onder de microscoop, voor zover nodig het toevoegen van meer 1x PBS. Wees voorzichtig als te veel druk zal de eicellen te vernietigen. LET OP: Voor immunofluorescentie alleen verder met stap 6. Voor FISH (met of zonder immunofluorescentie), verder met stap 7. </li></ol> 6. Antilichaam kleuring van Drosophila Eicellen <ol><li> Extractie en blokkeren <ol><li> Spoel gerold eicellen in een 15 ml conische buis met ~ 15 ml PBS / 1% Triton X-100. Nutate oöcyten in deze oplossing gedurende ten minste 1,5 uur en niet meer dan 2 uur.Deze stap maakt antilichaam penetratie. </li><li> Laat eicellen af ​​te wikkelen ~ 2 min. Verwijder vloeistof samen met zoveel membranen mogelijk, dan voeg PBS / 0,05% Triton X-100. LET OP: Membranen zullen vestigen langzamer dan gerold eicellen. </li><li> Laat eicellen af ​​te wikkelen ~ 2 min, verwijder alles behalve ~ 1 ml vloeistof. Transfer eicellen te afgestudeerd 1,5 ml tube en verwijder de resterende vloeistof. Voeg 1 ml PTB voor het blokkeren en nutate gedurende 1 uur. </li></ol></li><li> antilichaam kleuring <ol><li> Pre-opname van secundaire antilichamen tegen embryo&#39;s. LET OP: Deze stap elimineert achtergrond kleuring van niet-specifiek antilichaam interacties met Drosophila eiwitten. <ol><li> Verzamelen en lossen Drosophila embryo&#39;s (~ 25 pi) per typische procedure 8. Bewaar in methanol bij -20 ° C. </li><li> Verwijder methanol uit embryo&#39;s, voeg 800 ul methanol plus 200 pl 1x PBS en nutate gedurende 15 min. Verwijder 500 pl supernatant en vervangen door 500 pl 1x PBS. Vervolgens nutate gedurende 15 min. Herhaal dit twee keer (voor een totaal van ~ 1 uur wasbeurten), en dan eindigen in PTB. OPMERKING: Embryo&#39;s kunnen direct worden gebruikt of gehandhaafd nutator een aantal uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Verwijder vloeistof, vullen met PTB tot 200 ul per eicel prep, en voeg fluorescent-gelabelde secundaire antilichamen op geschikte verdunningen (in gedachten houden dat het uiteindelijke volume 300 pi zal zijn;. Zie stap 7.4) Nutate bij 4 ° C gedurende de nacht (bij voorkeur) of bij kamertemperatuur gedurende 3-4 uur. OPMERKING: De pre-geabsorbeerde antilichamen worden gebruikt in stap 6.2.4. OPMERKING: Houd monsters in het donker zoveel mogelijk na fluorescerende antilichamen zijn toegevoegd. </li></ol></li><li> Verwijder vloeistof uit eicellen, vul met PTB tot 300 ui en voeg primaire antilichamen op de juiste verdunningen. Nutate bij 4 ° C overnacht (bij voorkeur) of bij kamertemperatuur voor 3 tot 4 uur. </li><li> Wassen oöcyten viermaal gedurende 15 min elk met 1 ml PTB. </li><li> Verwijderenvloeistof van oöcyten, voeg 200 pl supernatant van embryo&#39;s (pre-geabsorbeerd secundaire antilichamen). Dan vullen met PTB tot 300 pi. Nutate bij kamertemperatuur gedurende 3-4 uur (bij voorkeur) of bij 4 ° C overnacht. </li><li> Was eicellen eenmaal gedurende 15 minuten met 1 ml PTB, verwijder vloeistof. Voeg vervolgens 0,5 ul Hoechst 33342 en 500 pl PTB en nutate gedurende 7 min. </li><li> Wassen eicellen tweemaal gedurende 15 min elk met 1 ml PTB. OPMERKING: Eicellen kunnen direct op een slede gemonteerd of kan worden opgeslagen in PTB bij 4 ° C tot klaar voor beeldvorming. </li></ol></li></ol> 7. FISH (verder vanaf stap 5 hierboven) <ol><li> Spoel gerold eicellen in een 15 ml conische buis met ~ 15 ml 2x SSCT. Laat eicellen af ​​te wikkelen ~ 2 min. Verwijder alles behalve ~ 0,5 ml vloeistof met zoveel membranen mogelijk. LET OP: Membranen zullen vestigen langzamer dan gerold eicellen. </li><li> Transfer eicellen tot 0,5 ml tube en verwijder de resterende vloeistof. Achtereenvolgens toevoegen en verwijderen 500 ul20%, 40% en 50% formamide oplossingen, nutatiepomp gedurende 10 minuten in elke oplossing. LET OP: Eicellen zal vestigen trager met hogere percentages formamide. </li><li> Verwijderen vloeistof, voeg 500 ul 50% formamide oplossing en nutate bij 37 ° C gedurende 1-5 uur. OPMERKING: Langere incubaties van betere penetratie probe. </li><li> Verwijderen vloeistof, met achterlating van niet meer dan ~ 100 ul eicellen en voeg 36 ul hybridisatieoplossing plus 2 pl probe (50 ng / ul) en 2 pl water of 2 pi van een 2 tweede probe (Tabel 1). </li><li> Incubeer bij 91 ° C gedurende 3 min (FISH) of 80 ° C gedurende 20 min (FISH plus immunofluorescentie), gevolgd door incubatie in een 37 ° C waterbad gedurende de nacht. Opmerking: Deze stappen kunnen worden uitgevoerd in een thermocycler. </li><li> Geen vloeistof te verwijderen. Voeg 500 ul 50% formamide oplossing en nutate bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Laten bezinken, verwijderen vloeistof, voeg 500 ul 50% formamide-oplossing, eend nutate bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Laten bezinken verwijderen vloeistof, voeg 500 ul 20% formamide oplossing en nutate bij kamertemperatuur gedurende 10 min. </li><li> Voer drie snelle wassingen in 500 pi 2x SSCT (laten bezinken, verwijder vervolgens toe te voegen vloeistof, omkeren meerdere malen herhalen.) Laten bezinken, verwijderen vloeistof, voeg dan 500 pi PTB en nutate voor 4 uur. </li></ol> 8. Antilichaam kleuring na FISH <ol><li> Verwijder vloeistof uit eicellen, vul met PTB tot 300 ui en voeg 10 ul anti-α-tubuline antilichaam geconjugeerd aan FITC. Als alternatief kunnen andere antilichamen worden gebruikt, na bovenstaande protocol. Nutate overnacht bij kamertemperatuur. </li><li> Was eicellen eenmaal voor 15 min met 500 ul PTB, verwijderen vloeistof, voeg dan 0,5 ul Hoechst 33342 en 500 ui PTB en nutate gedurende 7 min. </li><li> Wassen eicellen tweemaal gedurende 15 min elk met 500 pi PTB. OPMERKING: Eicellen kunnen direct worden aangebracht op een objectglaasje of kan worden opgeslagen in PTB bij 4 ° C tot klaar voorbeeldvorming. Houd eicellen in het donker zo veel mogelijk eenmaal fluorescerende antilichamen zijn toegevoegd. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Herhaal Naam </td><td fo:width="1in"> chromosome </td><td> Oligo Sequence * </td></tr><tr><td> 359 </td><td> X </td><td> GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC </td></tr><tr><td> AACAC </td><td> 2 </td><td> AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC </td></tr><tr><td> dodeca </td><td> 3 </td><td> CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT </td></tr><tr><td> 1.686 </td><td> 2 + 3 </td><td> AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG </td></tr><tr><td> AATAT </td><td> 4 (+ Y) </td><td> AATATAATATAATATAATATAATATAATAT </td></tr><tr><td colspan="3"> * 359 sequentie van Eric Joyce, persoonlijke mededeling, andere sequenties van Sullivan et al. 8 </td&gt; </tr></tbody></table> Tabel 1: FISH probes voor Drosophila centromere herhalingen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> drug </td><td> solvent </td><td> voorraadconcentratie </td><td> eindconcentratie </td><td> De tijd van de behandeling </td><td> Effect </td></tr><tr><td> colchicine </td><td> ethanol </td><td> 125 mM </td><td> 150 uM </td><td> 10 min of 30 min </td><td> destabiliseren non-kinetochoor (10 min) 9 of alle (30 min) microtubules </td></tr><tr><td> paclitaxel </td><td> DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 10 uM </td><td> 10 minuten </td><td> stabiliseren microtubules </td></tr><tr><td> Binucleine 2 </td><td> DMSO </td><td> 25 mM </td><td> 25 uM </td><td> 20 min </td><td> remmen Aurora B kinase 10 </td></tr></tbody></table> Tabel 2: Drug behandeling.

<ol><li>Bridges, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-disjunction+as+proof+of+the+chromosome+theory+of+heredity%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity.</a> Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Theurkauf, W. E., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+spindle+assembly+in+Drosophila+females%3A+behavior+of+nonexchange+chromosomes+and+the+effects+of+mutations+in+the+nod+kinesin-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Meiotic spindle assembly in Drosophila females: behavior of nonexchange chromosomes and the effects of mutations in the nod kinesin-like protein.</a> J Cell Biol. 116 (5), 1167-1180 (1992).</li>
<li>Zou, J., Hallen, M. A., Yankel, C. D., Endow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microtubule-destabilizing+kinesin+motor+regulates+spindle+length+and+anchoring+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microtubule-destabilizing kinesin motor regulates spindle length and anchoring in oocytes.</a> J Cell Biol. 180 (3), 459-466 (2008).</li>
<li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+a+role+for+heterochromatin+in+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation.</a> Cell. 86 (1), 135-146 (1996).</li>
<li>Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congression+of+achiasmate+chromosomes+to+the+metaphase+plate+in+Drosophila+melanogaster+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes.</a> Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).</li>
<li>Gilliland, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+transiently+sequesters+mps1+and+polo+to+collagenase-sensitive+filaments+in+Drosophila+prometaphase+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hypoxia transiently sequesters mps1 and polo to collagenase-sensitive filaments in Drosophila prometaphase oocytes.</a> PLoS One. 4 (10), e7544(2009).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Radford, S. J., Hoang, T. L., Głuszek, A. A., Ohkura, H., McKim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+and+End-On+Kinetochore+Attachments+Are+Coordinated+to+Achieve+Bi-orientation+in+Drosophila+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Lateral and End-On Kinetochore Attachments Are Coordinated to Achieve Bi-orientation in Drosophila Oocytes.</a> PLoS Genet. 11 (10), e1005605(2015).</li>
<li>Smurnyy, Y., Toms, A. V., Hickson, G. R., Eck, M. J., Eggert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binucleine+2%2C+an+isoform-specific+inhibitor+of+Drosophila+Aurora+B+kinase%2C+provides+insights+into+the+mechanism+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Binucleine 2, an isoform-specific inhibitor of Drosophila Aurora B kinase, provides insights into the mechanism of cytokinesis.</a> ACS Chem Biol. 5 (11), 1015-1020 (2010).</li>
<li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li>
<li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li>
<li>Tavosanis, G., Llamazares, S., Goulielmos, G., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+gamma-tubulin+in+the+acentriolar+female+meiotic+spindle+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Essential role for gamma-tubulin in the acentriolar female meiotic spindle of Drosophila.</a> EMBO J. 16 (8), 1809-1819 (1997).</li>
<li>Endow, S. A., Komma, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+dynamics+during+meiosis+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spindle dynamics during meiosis in Drosophila oocytes.</a> J Cell Biol. 137 (6), 1321-1336 (1997).</li>
<li>Matthies, H. J., Clarkson, M., Saint, R. B., Namba, R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatthies%2C+HJ+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 67-85 (2000).</li>
<li>Colombié, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+of+Incenp+crucial+to+the+assembly+of+the+acentrosomal+metaphase+spindle+in+female+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dual roles of Incenp crucial to the assembly of the acentrosomal metaphase spindle in female meiosis.</a> Development. 135 (19), 3239-3246 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Staging Drosophila Eicellen Hoewel een langwerpig karyosome vaak wordt gezien in prometaphase oöcyten, met behulp van karyosome vorm prometafase onderscheiden van metafase eicellen kan problematisch zijn. Tijdens prometafase, de karyosome begint als een ronde vorm, verlengt, en dan trekt om een ​​ronde vorm als de eicel bereikt de metafase arrestatie. Dit betekent dat veel prometaphase oöcyten niet een langwerpige karyosome hebben. Bovendien, als mutant of met genee...

De studie van meiose wordt soms beschreven als de "genetica van genetica". Dit komt omdat de fundamentele eigenschappen van chromosoombeslag en onafhankelijke sorteerder worden uitgevoerd door de segregatie van chromosomen tijdens gameetproductie. Een belangrijke demonstratie van de chromosoombeslagtheorie kwam in 1916 uit het werk van Calvin Bridges in Drosophila melanogaster1. Dit en andere klassieke geneticastudies in Drosophila hebben sterk bijgedragen aan ons begrip van genetica. Cytologische onderzoek van meiotische chromosomen in Drosophila eicellen, is echter een uitdaging. Dit komt voornamelijk doordat immunofluorescentie van late-stadium Drosophila eicellen, wanneer de spindle samenstelt en chromosomen worden georiënteerd voor segregatie, wordt belemmerd door de aanwezigheid van membranen die de eicel ondoordringbaar maken voor antilichamen.
Ondanks deze uitdaging, blijven Drosophila eicellen een aantrekkelijk model voor het onderzoek naar chromosoombeweging en spindle-samenstelling. Dit komt door de krachtige genetische tools die beschikbaar zijn in Drosophila, maar ook omdat de eicellen in de metafase I aanhouden, wanneer de chromosomen georiënteerd zijn en de spindle volledig gevormd is. Dit vergemakkelijkt de verzameling en onderzoek van grote aantallen eicellen in dit belangrijke stadium van celdeling. Bovendien kan een eenvoudig modelorganisme dat vatbaar is voor genetische manipulatie voor het onderzoek naar chromosoombeslag in eicellen een belangrijke bijdrage leveren aan ons begrip van de menselijke reproductieve gezondheid. Fouten in chromosoombeslag zijn de belangrijkste genetische oorzaak van miskramen en geboorteafwijkingen bij mensen2. Een meerderheid van deze fouten kunnen worden herleid tot de eicel en correleren met een toenemende leeftijd van de moeder. De gemiddelde leeftijd van moeders in de VS is aan het stijgen, waardoor dit een belangrijke publieke gezondheidszorgkwestie is.
We beschrijven hier methoden voor het cytologische onderzoek van Drosophila eicellen, inclusief een demonstratie van hoe de eicelmembranen kunnen worden verwijderd. Deze methoden zijn aanpassingen van protocollen die voor het eerst werden beschreven door Theurkauf en Hawley3, Zou et al.4, en Dernburg et al.5. We nemen ook methoden op voor het verrijken van verschillende stadia van eicellen, gebaseerd op een protocol dat voor het eerst werd beschreven door Gilliland et al.6. Ten slotte voegen we instructies toe voor de medicamenteuze behandeling van Drosophila eicellen. Samen maken deze methoden het cytologische onderzoek van chromosoombeslag en spindle-samenstelling in Drosophila mogelijk.

<table><tbody><tr><td>15 ml conische buizen</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% formaldehyde</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>18505</td><td>GEVAARLIJK; na opening, weggooien na één maand</td></tr><tr><td>250 ml bekers</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml buizen</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>actieve droge gist</td><td>Verschillende</td><td></td><td>mengen met water om een pasta met de consistentie van pindakaas te maken</td></tr><tr><td>anti-&amp ;alpha;-tubuline antilichaam geconjugeerd aan FITC</td><td>Sigma</td><td>F2168</td><td>clone DM1A</td></tr><tr><td>Binucleine 2</td><td>Sigma</td><td>B1186</td><td>GEVAARLIJK</td></tr><tr><td>blender</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bovijn serum albumine</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>calciumchloride</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>colchicine</td><td>Sigma</td><td>C-9754</td><td>GEVAARLIJK</td></tr><tr><td>dekglazen</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>No. 1 1/2</td></tr><tr><td>dextransulfaat</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tang</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>5622</td><td>Dumont pincetten hoge precisie stijl 5</td></tr><tr><td>formamide</td><td>Sigma</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>glasplaten</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gegradueerde 1,5 ml buizen</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>EM-5330</td><td>beschikbaar bij verschillende verkopers</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>magnesiumchloride</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>groot gaas (~1.500 µm)</td><td>VWR</td><td>AA43657-NK</td><td>variëteit van formaten en andere leveranciers, 12 of 14 gaas</td></tr><tr><td>klein gaas (~300 µm)</td><td>Spectrum labs</td><td>146 424</td><td>variëteit van formaten, bijv. 146 422 of 146 486</td></tr><tr><td>nutator</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipetten</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kaliumacetaat</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cacodylic zuur</td><td>Sigma</td><td>C0125</td><td>GEVAARLIJK; alternatief kan natriumcacodylat worden gebruikt</td></tr><tr><td>kaliumhydroxide</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>natriumacetaat</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>natriumchloride</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>natriumcitraat</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>natriumhydroxide</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>taxol (paclitaxel)</td><td>Sigma</td><td>T1912</td><td>GEVAARLIJK</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>PI-28314</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>PI-28320</td><td></td></tr><tr><td>vortex</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

technieken voor imaging prometaphase metafase van de meiose i in fixed<em&gt; drosophila</em&gt; eicellen

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosoombaan in menselijke eicellen is foutgevoelig, wat resulteert in aneuploïdie, wat de belangrijkste genetische oorzaak is van miskraam en aangeboren afwijkingen. De studie van chromosoombaan in eicellen van modelorganismen belooft veel om de moleculaire basis van de gevoeligheid van menselijke eicellen voor aneuploïdie te onthullen. Drosophila melanogaster is geschikt voor genetische manipulatie, met meer dan 100 jaar onderzoek, gemeenschap en ontwikkeling van technieken. Het visualiseren van chromosoombaan en spindelvorming in Drosophila eicellen heeft echter specifieke uitdagingen, voornamelijk vanwege de aanwezigheid van membranen rond de eicel die ondoordringbaar zijn voor antilichamen. We beschrijven hier protocollen voor het verzamelen, voorbereiden en afbeelden van meiose I spindelvorming en chromosoombaan in Drosophila eicellen, die de moleculaire dissectie van chromosooombaan in dit belangrijke modelorganisme mogelijk maken.

De methoden die we hier beschreven leidt tot de verzameling van laat-stadium Drosophila oöcyten die drie stadia van de meiose (figuur 1). Eicellen in profase onderscheiden zich door de aanwezigheid van de nucleaire envelop, die zichtbaar is door het gebrek aan tubuline signaal in het gebied rond de karyosome (Figuur 1A). Prometafase is de periode na de nucleaire envelop afbraak gedurende welke de spil assembleert. Tijdens prometafase, de karyoso...

We presenteren protocollen voor het verzamelen, voorbereiden en beeldvorming van volwassen Drosophila eicellen. Deze methoden maken de visualisatie van chromosoomgedrag en spindelassemblage en -functie tijdens meiose mogelijk.

Technieken voor Imaging prometaphase metafase van de meiose I in Fixed<em&gt; Drosophila</em&gt; Eicellen

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van Drosophila-oocyten voor cytologisch onderzoek naar de spoelfiguurvorming en chromosoomoriëntatie tijdens meiose I. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de meiose, zoals de wijze waarop de bipolariteit van de spoelfiguur wordt gevestigd en hoe chromosomen bi-georiënteerd raken in de afwezigheid van centrosomen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de oocytmembranen die de penetratie van antilichamen blokkeren effectief worden verwijderd, wat immunofluorescentie mogelijk maakt. Begin met het voorbehandelen van de binnenkant van een buisje van vijf millimeter en een Pasteurpipet met PTB om te voorkomen dat oocyten aan de oppervlakken kleven.Voeg 100 milliliters ROB-buffer toe aan een blender, voeg vervolgens 100 tot 300 genarceerde vliegen toe en pulseer drie keer gedurende één seconde. Filtreer het resulterende mengsel door een groot gaas met poriën van ongeveer 1.500 micrometers in een bekerglas van 250 milliliters. Laat het filtraat ongeveer twee minuten bezinken en aspireer vervolgens de bovenlaag, waarbij zoveel mogelijk grote lichaamsdelen worden verwijderd.F

techniques-for-imaging-prometaphase-metaphase-meiosis-i-fixed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft het gebruik van micro-injectie en een hoge resolutie beeldvorming in...

Micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de Drosophila melanogaster Syncytieel Embryo

Eicellen zijn gevoelig voor te wijten aan fouten in chromosoom segregatie aneuploïdie tijdens de meiotische rijping. Aneuploïde eieren kan leiden tot onvruchtbaarheid, miskramen of ontwikkelingsstoornissen, zoals het syndroom van Down. Hier beschrijven we methoden om materialen van keuze te introduceren in eicellen en methoden om meiotische rijping onderzoeken en te beoordelen ploïdie.

Eicel muis micro-injectie, rijping en ploïdie Assessment

De kinetochoor is waar de SAC initieert het signaal het toezicht op de mitotische segregatie van de zuster chromatiden. Een methode wordt beschreven om de werving en de omzet van een van de kinetochoor eiwitten en de coördinatie te visualiseren met het chromosoom beweging...

Studeren Mitotische Checkpoint door te laten zien Dynamic kinetochoor Protein Gedrag en Chromosoom Motion in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytieel Embryo&#39;s

Immunostaining van Drosophila late-stage oöcyten kan een uitdaging zijn vanwege de omliggende membranen van de oöcyten. Deze video beschrijft een methode met hoge doorvoer voor het verkrijgen van oöcyten, hun fixatie en het verwijderen van membranen voor immunostaining. Het aanbevolen protocol demonstreert deze technieken met laat stadium oöcyten die worden gebruikt om verschillende stadia van meiose te visualiseren.

Voorbereiding van vaste Drosophila-oöcyten voor immunostaining: een methode met hoge doorvoer om het buitenste membraan te repareren en te verwijderen

Beeldvorming van centrosomal eiwitten in Drosophila spermatogenese is een krachtige methode om nieuwe eiwitten essentieel voor centrosome biologie identificeren en de specifieke functie van bekende spelers in dit proces verduidelijken.

Imaging Centrosomes in Fly Testikels

Werkwijzen voor het isoleren en het voorbereiden van Drosophila testes monsters (wonen en vast) voor beeldvorming door fase-contrast en fluorescentie microscopie worden hierin beschreven.

Cytologische analyse van Spermatogenese: Live and Vaste Bereidingen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

Dit manuscript presenteert een gedetailleerde methode voor het genereren van X-chromosoom arm sondes en presterende fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) te onderzoeken van de Braziliaanse deelstaat zus chromatide cohesie in prometaphase en metafase ik gearresteerd  Drosophila eicellen. Dit protocol is geschikt om te bepalen of cohesie Meiotische arm intact of verstoord in verschillende genotypen is.

Met behulp van fluorescentie In Situ hybridisatie (FISH) te controleren van de toestand van Arm cohesie in Prometaphase en metafase ik Drosophila eicellen

Als de genetische varianten die zijn gekoppeld aan ziekten bij de mens begint te worden blootgelegd, wordt het steeds belangrijker systemen waarmee snel evalueren de biologische betekenis van deze geïdentificeerde varianten te ontwikkelen. Dit protocol wordt beschreven methoden voor de evaluatie van menselijke genfunctie tijdens vrouwelijke meiose ik met behulp van de muis eicellen.

Met behulp van de muis eicellen te beoordelen van menselijke genfunctie tijdens de meiose I

Meiotische fouten in synapsen en recombinatie komen vaak voor bij eicellen van zoogdieren. Grondige analyse van eiwitten die bij deze processen betrokken zijn, is essentieel om te begrijpen hoe en waarom oögenese vaak fout gaat. De hier gepresenteerde technieken maken een uitgebreide monitoring van recombinatie en synapsen mogelijk om de eicelkwaliteit bij muizen te evalueren.

Voorbereiding van meiotische chromosoomspreads van eicellen van muizen voor beoordeling van synapsis en recombinatie

Mesoscopische fluorescentie tomografie opereert buiten de grenzen van de penetratie-weefsel snijden fluorescentie microscopie. De techniek is gebaseerd op multi-projectie verlichting en een foton transport beschrijving. Tonen we aan in-vivo het hele lichaam 3D-visualisatie van de morfogenese van GFP-expressie vleugel imaginaire schijven...

Mesoscopische Fluorescentie Tomografie voor In-vivo Imaging van de ontwikkelingslanden Drosophila</em

Leer hoe je Drosophila-eicellen prepareert voor cytologisch onderzoek naar spindelassemblage en chromosoomoriëntatie tijdens meiose I. Deze methode maakt immunofluorescentie-imaging mogelijk door effectieve verwijdering van eicelmembranen.

Technieken voor Imaging prometaphase metafase van de meiose I in Fixed

Meer video's verkennen