Karakterisering van elektronentransport via levende Biofilms
1 juni 2018
Een protocol voor het meten van de elektrische geleiding van levende micro-organismen biofilms fysiologisch relevante voorwaarden wordt gepresenteerd.
Het algemene doel van deze experimentele procedure is om de hoeveelheid stroom te bepalen die in situ door een levend materiaal kan worden geleid, evenals het mechanisme dat door het levende materiaal wordt gebruikt om de stroom te transporteren. Deze methode zou kunnen helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van microbiële elektrochemie, zoals: Hoe kunnen bepaalde biofilms elektronen over honderden micrometer bewegen om cellulaire stofwisseling te ondersteunen? Het grote voordeel van deze techniek is dat de verweven elektroden een zeer hoge signaal-ruisverhouding geven en kunnen worden geschaald om in veel verschillende reactorconfiguraties te passen.
Deze methode kan inzicht geven in extracellulair elektronentransport over meerdere cellengtes in biofilms. Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals elektrisch geleidende polymeerfilms. Onderzoekers die nieuw zijn in deze methode zullen worstelen omdat het een bipotentiostaat vereist om de potentialen van beide elektroden afzonderlijk in te stellen en de stroom bij elke elektrode afzonderlijk te meten.
Om te beginnen verkrijg commercieel verkrijgbare IDA-elektroden gepatronneer op een niet-geleidend substraat of synthetiseer ze met behulp van standaard lithographische methoden. Bereid geleidend zilver epoxy voor volgens de instructies van de fabrikant met een mengstaaf of pipettepunt. Plaats vervolgens een draad op elke gouden pad en zet ze op hun plaats met behulp van laboratoriumtape.
Bedek de draad en het pad met zilver epoxy met behulp van een mengstaaf of pipettepunt. Verplaats het apparaat voorzichtig naar een oven van 80 graden Celsius gedurende één uur om te drogen. Nadat de epoxy is uitgehard, gebruik een multimeter om de elektrische geleidbaarheid tussen het uiteinde van de draad en de pads te controleren.
De weerstand tussen de draad en de pads moet minder dan vijf ohm zijn. Gebruik ook de multimeter om te verifiëren dat geen geleidend epoxy meerdere elektrodepads verbindt, omdat dit de array kan kortsluiten. Als geleidend epoxy meerdere aansluitingen verbindt, gebruik dan de schraper om de aansluitingen te isoleren.
Verwijder vervolgens de punt van een 15 milliliter conische centrifugeerbuis om deze als mal voor het isolatiemateriaal te gebruiken. Gebruik een naald van 21 gauge om twee kleine gaatjes in de bodem van de mal te maken waardoor de draden kunnen uitsteken. Plaats de IDA in de mal en steek de draden door de gaatjes in de bodem van de mal.
Bereid vervolgens een thermisch elektrisch en waterdicht isolatiemateriaal voor. Vlamvertragende polyurethaanharsen zijn vaak geschikt. Pipetteer de isolator in de mal zodat de zilver epoxy volledig bedekt is en laat de isolator drogen volgens de specificaties van de fabrikant.
Om de elektrochemische cel op te zetten, plaats de IDA, tegenelektrode en referentie-elektrode in de elektrochemische cel. Vul de elektrochemische cel met steriel medium geschikt voor biofilmgroei. Gebruik voor Geobacter sulfurreducens vers water medium zonder fumaraat.
Verbind vervolgens de elektroden met een bipotentiostaat. Verbind één IDA-elektrode met de werkende aansluiting een, de andere IDA-elektrode met de werkende aansluiting twee, de referentie-elektrode met de referentie-aansluiting en de tegenelektrode met de tegenaansluiting. Voer een controle-experiment uit door cyclische voltammetrie uit te voeren op elektrode een en elektrode twee open te houden om ervoor te zorgen dat de elektroden niet zijn verbonden.
Om de relevante elektroactieve biofilm te laten groeien, inoculeer de elektrochemische reactor vanuit een stamcultuur of verrijking van de gewenste elektrochemisch actieve micro-organismen met behulp van standaard aseptische microbiologische technieken. Voor standaardtests, inoculeer in een verhouding van 1 tot 20 van inoculum-tot-reactorvolume. Zet het roeren in de reactor op het gewenste niveau en stel de incubator of waterbad in op de gewenste temperatuur op basis van de groeicondities van de biofilm van belang.
Incubeer het systeem op basis van specifieke vereisten van het geïnteresseerde micro-organisme totdat de biofilm de opening tussen de twee elektroden overbrugt. Voor stationaire Geobacter sulfurreducens biofilm, incubeer gedurende zeven tot tien dagen bij 30 graden Celsius. Begin met het instellen van de experimentele parameters die zullen worden gebruikt om de stroompotentiaalafhankelijkheid voor de gatingmetingen te bepalen, zoals beschreven in het tekstprotocol.
Stel de bipotentiostaatsoftware in om de gatingmetingen uit te voeren over het geselecteerde bereik bij de geselecteerde bronaftapspanning en bij de gewenste scannelheid. Voer bovendien een basislijnmeting uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Voer gatingmetingen uit onder dezelfde omstandigheden tijdens overloop met oplosbare elektronendonor of acceptor aanwezig in niet-overloop zonder oplosbare elektronendonor of acceptor omstandigheden.
Verkrijg een controlereacteur om ervoor te zorgen dat de ingestelde en de werkelijke temperatuur van het medium hetzelfde zijn. Plaats een thermometer of een thermokoppel in een controlereacteur waar de IDA zou zijn. Maak vervolgens bronspanningsmetingen over het bereik van temperaturen geselecteerd onder overloop en niet-overloop omstandigheden met behulp van de bipotentiostaat.
Om dit te doen, stel en houd de IDA op het poortpotentiaal dat het maximale geleide stroom oplevert met behulp van de bipotentiostaat. Neem het maximale geleide stroom op met behulp van de bipotentiostaat terwijl de temperatuur wordt gecycled tussen het bereik van temperaturen geselecteerd met behulp van de ingebouwde bedieningselementen van het waterbad of de incubator. Cycle de temperatuur van de ene ingestelde waarde naar de andere en terug met behulp van de ingebouwde bedieningselementen van de incubator of het waterbad.
Dit bepaalt de omkeerbaarheid van de reactie om ervoor te zorgen dat de temperatuurcyclus de biofilm niet schaadt. Stel tenslotte de temperatuur terug naar de normale groeitemperatuur en laat het systeem stabiliseren. Hier worden representatieve resultaten getoond van een IDA die correct functioneert in zoetwatermedium.
Versus een waar de elektroden zijn kortgesloten. Representatieve elektrochemische gatingmetingen uitgevoerd op een Geobacter sulfurreducens biofilm onder niet-overloopomstandigheden met een bronspanningsspanning van 10 millivolt vertonen de piekvormige geleide stroom versus poortpotentiaalcurve die kenmerkend is voor redoxgeleiding. Hier tonen representatieve ruwe
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het meten van de elektrische geleidbaarheid van levende microbiële biofilms onder fysiologisch relevante condities. De methode is erop gericht te verduidelijken hoe biofilms elektronen transporteren om het cellulaire metabolisme te ondersteunen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiële elektrochemie
- Biofilmgeleidbaarheid
- Extracellulair elektronentransport
Achtergrond
- Het begrijpen van elektronentransport in biofilms is cruciaal voor de microbiële elektrochemie.
- Biofilms kunnen elektronen over lange afstanden transporteren, wat invloed heeft op cellulaire functies.
- Gedigitaliseerde elektroden (interdigitated electrodes) zorgen voor een hoge signaal-ruisverhouding bij metingen.
- Deze techniek kan ook worden toegepast op andere geleidende materialen.
Doel van de studie
- Om de stroomgeleiding door levende microbiële biofilmen te meten.
- Om de mechanismen van elektronentransport in biofilmen te onderzoeken.
- Om inzicht te verschaffen in elektronentransport over meerdere cellen.
Gebruikte methoden
- Gebruik van interdigitaalelektroden voor geleidingsmetingen.
- Toepassing van een bipotentiostat om elektrodepotentialen te regelen.
- In situ meting van de stroom in levende biofilms.
- Aanpassing van de methode voor diverse reactorconfiguraties.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een precieze meting van het elektronentransport in biofilms mogelijk.
- Een hoge signaal-ruisverhouding verbetert de nauwkeurigheid van de meting.
- De verkregen inzichten kunnen toekomstig onderzoek in de microbiële elektrochemie informeren.
- Potentiële toepassingen strekken zich uit tot elektrisch geleidende polymeerfilms.
Conclusies
- Dit protocol is een waardevol instrument voor het bestuderen van microbiële biofilms.
- Inzicht in elektronentransportmechanismen kan het vakgebied verder ontwikkelen.
- Onderzoekers kunnen voor uitdagingen komen te staan vanwege de complexiteit van de apparatuur.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directies
Elektrochemische gating van levende biofilms maakt directe kwantificering van extracellulair elektronentransport onder fysiologisch relevante omstandigheden mogelijk, waarmee een cruciale mechanistische onzekerheid in de microbiële elektrochemie wordt weggenomen. Deze mogelijkheid ondersteunt het voorspellend vertrouwen bij de validatie van targets voor biofilm-gestuurde metabole processen en informeert risico-gecorrigeerde beslissingen in vroege discovery- en screening-pipelines. De hoge signaal-ruisverhouding van de methode en de aanpasbaarheid aan verschillende reactorformaten positioneren deze als een herbruikbaar platform voor functionele karakterisering in biopharma R&D.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt mechanische analyse van elektronentransportpaden in levende biofilms mogelijk.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door functionele mechanismen van elektronentransport te verduidelijken.
- Biedt kwantitatieve gegevens voor voorspellende betrouwbaarheid bij de selectie van microbiële systemen.
Screening & Assayontwikkeling
- Faciliteert de voorbereiding van gevalideerde biofilmsystemen voor daaropvolgende elektrochemische assays.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve geleidingsmetingen voor de standaardisatie van assays.
- Maakt schaalbare screening van biofilmvarianten of genetisch gemodificeerde stammen mogelijk voor elektrontransporteigenschappen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Slaat aan bij ziekte-relevante systemen bij het bestuderen van biofilm-vormende pathogenen en hun metabole verstoring.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van biofilm-gerichte interventies.
- Biedt mechanistische risicoreductie voor translationele biomarkerontwikkeling in microbiële systemen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze elektrochemische gating-methode integreert op de interface tussen vroege ontdekking en lead-identificatie en vormt hiermee een brug van mechanistische hypothese-testen naar kwantitatieve screening in workflows voor microbiële elektrochemie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en padverduidelijking voor extracellulair elektronentransport.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor vergelijkende analyse van biofilmgeleidbaarheid.
- Analytics: Biedt resolutiemetingen van de stroomsterkte en temperatuurafhankelijke profielen voor een robuuste gegevensanalyse.
- Translationeel Onderzoek: Maakt afstemming mogelijk met preklinische modellen van biofilmmetabolisme en -disruptie.
- Enterprise Reuse: Aanpasbaar aan diverse reactorconfiguraties en toepasbaar op andere geleidende levende materialen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar elektronentransport in biofilms.
- Operationele waarde: Standaardiseert meetprotocollen en verbetert de reproduceerbaarheid tussen onderzoeksteams.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie door functionele targets in een vroeg stadium te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van microbiële systemen en interventies gericht op het metabolisme van biofilms.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in elektrochemische instrumentatie en de cultivatie van microbiële biofilms.
- Necessiteert toegang tot bipotentiostaatsystemen en interdigitated electrode-arrays.
- Vereist strikte standaardisatie tussen teams om de vergelijkbaarheid van gegevens te waarborgen.
- Aanpasbaar aan diverse microbiële soorten en reactorformaten, mits voorzien van适当 validatie.
- Afhankelijk van zorgvuldige elektrodevoorbereiding om kortsluitingen te voorkomen en de nauwkeurigheid van de metingen te garanderen.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
1:04
Interdigitated Microelectrode Array (IDA) Preparation
3:18
Electrochemical Reactor Setup, Testing, and Inoculation
5:13
Electrochemical Gating Experiments
7:17
Results: Living Geobacter Sulfurreducens Biofilms Behave as Redox Conductors
8:11
Conclusion
