Een methode voor het meten van RNA N 6 -methyladenosine Wijzigingen in cellen en weefsels
5 december 2016
Gemodificeerde Northern blotting methode voor het meten N6 -methyladenosine (m 6 A) veranderingen in RNA wordt beschreven. De huidige methode kan wijzigingen in diverse RNA's en controles onder verschillende experimentele ontwerpen te detecteren.
Het algemene doel van de gemodificeerde northern blotting-techniek is om N6-methyladenosine, n6A-modificaties in RNA te meten en modificaties in diverse RNA's te detecteren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen over de rol van RNA-epigenetica, zoals N6-methyladenosine-modificaties. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de effectieve scheiding van RNA, betere standaardisatie voor experimentele ontwerpen en een duidelijke afbakening van n6A-modificatie in RNA's mogelijk maakt.
Deze methode kan inzicht geven in n6A-modificaties in RNA en kan ook worden toegepast op andere RNA-modificaties met verschillende detectie-antilichamen. Om het experiment te beginnen, spuit ribonuclease-ontsmettingsoplossing op papieren handdoeken en veeg de pipetten en laboratoriumbankoppervlakken schoon. Maak de papieren handdoeken nat met nuclease-vrij water en veeg opnieuw de pipetten en laboratoriumbankoppervlakken schoon.
Verkrijg RNA-isolatieoplossing die op vier graden Celsius wordt bewaard en voeg een milliliter van de oplossing toe aan ongeveer 75 milligram muizenweefsel. Gebruik een overhead-roerder om het weefsel te homogeniseren. Voeg vervolgens 100 microliter 1-Bromo-3-chloorpropaan of BCP per milliliter monsterhomogenaat toe.
Schud de buizen krachtig gedurende 15 seconden en ga verder met totale RNA-isolatie. Bepaal de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer door de absorptie op 260 nanometer en 280 nanometer te noteren. Controleer de RNA-monsterkwaliteit door 0,8% agarose gelelektroforese uit te voeren.
Spoel alle elektroforese-apparatuur af met di-ethylpyrocarbonaat of DEPC-water. Combineer 2,5 gram agarose, vervolgens 215 milliliter DEPC-water in een Erlenmeyer-kolf en smelt het mengsel volledig in een magnetron. Nadat de oplossing is gesmolten, voegt u 12,5 milliliter 10X MOPS-buffer toe.
En 22,5 milliliter 37% formaldehyde in de kolf. Giet vervolgens de oplossing in het elektroforese-apparaat met een kam van 1,5 millimeter dik. Gebruik een schone kam om bellen naar de randen van de gel te duwen.
Laat de gel bij kamertemperatuur stollen. Gebruik vervolgens eerder bereide 1X MOPS-loopbuffer om de putjes van de gel te spoelen en de gel voor te lopen. Laad de RNA-monsters in de putjes van de gel en zet de gel aan.
De volgende dag, onderzoek en fotografeer de gel onder een UV-licht. Om de overdracht voor te bereiden, snijdt u de gel en verwijdert u het ongebruikte gedeelte. Bereid 500 milliliter 10X saline sodium citrate of SSC-buffer voor.
Was de gel twee keer met 10X SSC-buffer. Snijd een velletje filterpapier groot genoeg om de gel te bedekken. Snijd vier stukken filterpapier tot dezelfde grootte als de gel.
Snijd vervolgens een velletje positief geladen nylonmembraan tot dezelfde grootte als de gel. Markeer een inkeping op de gel en het membraan als marker om de juiste oriëntatie te garanderen. Week het membraan in 2X SSC-buffer.
Giet 500 milliliter 10X SSC-buffer in de overdrachtslade. Leg het grote velletje filterpapier over de glazen plaat en maak het filterpapier nat met overdrachtsbuffer. Gebruik vervolgens een pipette om eventuele bellen eruit te persen.
Week twee stukken voorgesneden filterpapier in overdrachtsbuffer en plaats ze op het midden van het filterpapier. Verwijder eventuele bellen. Leg vervolgens de gel met de bovenkant naar beneden op het filterpapier en leg het membraan op de gel, zorg ervoor dat de inkepingen van de gel en het membraan op elkaar lijnen.
Plaats vervolgens twee stukken voorgesneden filterpapier bovenop het membraan. Verwijder eventuele bellen tussen de lagen. Plaats plasticfolie rond de gel om ervoor te zorgen dat de handdoeken alleen buffer opnemen die door de gel en het membraan gaat.
Stapel vervolgens papieren handdoeken bovenop het filterpapier. Plaats een overgrote glazen plaat bovenop de handdoeken en plaats een gewicht bovenop de stapel en laat het RNA gedurende de nacht van de gel naar het membraan overbrengen. Na de overdracht, houd het membraan in 2X SSC-buffer vochtig.
Dompel twee vellen filterpapier in 10X SSC-buffer en plaats de vellen vervolgens in de UV-crosslinker. Zorg ervoor dat de RNA-geabsorbeerde kant naar boven wijst en plaats het membraan bovenop het filterpapier. Selecteer de automatische crosslink-modus en druk op de startknop om de bestraling te starten.
Bekijk het membraan en de gel met een UV-gelbeeldvanger om de RNA-overdracht van de gel naar het membraan te bevestigen. Blokkeer het membraan in 5% vetvrij melk in TBST-buffer bij kamertemperatuur gedurende een uur. Incubeer het membraan een nacht in m6A-antilichaamoplossing bij vier graden Celsius.
De volgende dag, was het membraan drie keer gedurende 15 minuten met TBST-buffer. Incubeer vervolgens het membraan in de HRP-geconjugeerde donkey anti-konijn antilichaamoplossing gedurende een uur bij kamertemperatuur. Na een uur, was het membraan drie keer gedurende 15 minuten met TBST-buffer.
Breng de verbeterde chemiluminescentie-substraat aan. Vang de chemiluminescentie op met een digitale imager. Ten slotte, ga naar m6A-kwantificering en meet de relatieve m6A chemiluminescente intensiteit met behulp van image J. Muizenlever RNA's werden met tussenpozen van vier uur bemonsterd en bestudeerd met de gemodificeerde northern blotting-techniek.
De methylering van rRNA's, mRNA's en kleine RNA's werd duidelijk gedetecteerd. Representatieve m6A-blots werden uitgevoerd voor totaal RNA en zonder rRNA van de leveren van wilde muizen. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in vier dagen worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd.
Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van RNA-epigenetica om de impact op de menselijke fysiologie te onderzoeken met betrekking tot de circadiane ritme en obesitas.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een aangepaste northern blotting-methode voor het meten van N6-methyladenosine (m6A)-modificaties in RNA. De techniek maakt het mogelijk om modificaties in diverse RNA-monsters te detecteren en is toepasbaar binnen verschillende experimentele ontwerpen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- RNA-epigenetica
- m6A-modificaties
- Experimentele technieken
Achtergrond
- N6-methyladenosine is een belangrijke RNA-modificatie.
- Het begrijpen van RNA-modificaties is essentieel voor inzichten in genregulatie.
- Huidige methoden voor het detecteren van m6A zijn beperkt.
- Deze aangepaste techniek is erop gericht de detectie en analyse te verbeteren.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het detecteren van m6A-modificaties in RNA.
- Om het begrip van de RNA-epigenetica te verbeteren.
- Om een gestandaardiseerde aanpak te bieden voor diverse experimentele ontwerpen.
Gebruikte methoden
- RNA-isolatie uit muisweefsel.
- Elektroforese voor de beoordeling van de RNA-kwaliteit.
- Overdracht van RNA naar een nylonmembraan.
- Detectie met behulp van m6A-antilichamen en chemiluminescentie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle detectie van m6A-modificaties in rRNAs, mRNAs en kleine RNA's.
- Duidelijke afbakening van m6A-modificaties in diverse RNA-monsters.
- De techniek kan efficiënt binnen vier dagen worden uitgevoerd.
Conclusies
- De gemodificeerde northern blot-techniek is effectief voor het bestuderen van RNA-modificaties.
- Deze methode opent nieuwe wegen voor onderzoek naar RNA-epigenetica.
- Potentiële toepassingen omvatten studies naar circadiane ritmes en obesitas.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Nauwkeurige meting van RNA N6-methyladenosine (m6A)-modificaties ondersteunt de validatie van targets in de RNA-epigenetica door een kwantitatieve beoordeling van epitranscriptomische regulatie mogelijk te maken. Deze methode vergroot het voorspellende vertrouwen in mechanistische studies die m6A koppelen aan fysiologische processen, zoals circadiane ritmes en het metabolisme. Het biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar platform voor het verminderen van risico's bij therapeutische hypothesen in de ontdekkingsbiologie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar m6A-afhankelijke RNA-stabiliteit, translatie en splicing om de functionele rollen van epigenetische regulatoren in genexpressienetwerken te verduidelijken.
- Operationele waarde: Biedt een duidelijke afbakening van m6A over verschillende RNA-soorten heen, wat de identificatie van biomarker-relevante targets in ziektemodellen ondersteunt.
- Predictieve waarde: Faciliteert dosis-respons- en tijdverloopanalyses van m6A-niveaus, waardoor de betrouwbaarheid van target-engagement en pathway-modulatie wordt verbeterd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve chemiluminescente uitlezingen die compatibel zijn met beelden met hoge resolutie voor vergelijkende analyse tussen experimentele condities.
- Operationele waarde: Standaardiseert RNA-overdracht en detectie via een nylon membraan en antilichaam-gebaseerde probing, waardoor variabiliteit in modificatieprofielering wordt verminderd.
- Klaarheid voor assay: Maakt een zij-aan-zij vergelijking van gemodificeerde en ongemodificeerde RNA-controles mogelijk, wat de validatie van de assay ondersteunt voor epigenetische screeningscampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt m6A-dynamiek in lever-RNA aan metabole en circadiane fenotypes, wat de exploratie van translationele biomarkers in preklinische modellen ondersteunt.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale bemonstering mogelijk (bijv. intervallen van vier uur) om temporele modificatiepatronen vast te leggen die relevant zijn voor fysiologische ritmes.
- Risicobeperking: Vermindert ambiguïteit in RNA-modificatiemetingen, waardoor de reproduceerbaarheid in workflows voor target-validatie wordt verbeterd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van discovery biology naar lead-identificatie door epigenetische validatie op laagenniveau te bieden die complementair is aan transcriptionele en proteomische profilering.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van m6A-writers, erasers en readers via directe meting van de modificatiestatus in RNA.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten voor het beoordelen van effecten van verbindingen op epitranscriptomische markeringen in celgebaseerde systemen of systemen afgeleid van weefsel.
- Analytics: Maakt beeldgebaseerde kwantificering van de m6A-signaalintensiteit mogelijk, wat statistische vergelijking tussen behandelingsgroepen of genetische achtergronden faciliteert.
- Translationeel onderzoek: Verbindt epigenetische veranderingen in RNA met fysiologische uitkomsten, wat de preklinische voortgang op basis van biomarkers ondersteunt.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Aanpasbaar aan diverse RNA-typen en modificatiespecifieke antilichamen, waardoor hergebruik mogelijk is voor meerdere epigenetische targets en ziektegebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Mechanistische risicoreductie van RNA-epigenetische targets via directe, modificatie-specifieke detectie.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde workflow met gedefinieerde transfer-, blokkerings- en detectiestappen die de reproduceerbaarheid tussen laboratoria waarborgt.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door de functionele relevantie van m6A in ziekte-relevante pathways te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van epigenetische targets mogelijk op basis van kwantificeerbare modificatiedynamiek.
Overwegingen voor implementatie
- Expertise in RNA-behandeling, elektroforese en immunoblotting-technieken is vereist.
- De instrumentatie omvat een UV-crosslinker, een digitale imager en een spectrofotometer voor RNA-kwantificering.
- Standaardisatie tussen teams vereist consistent gebruik van DEPC-behandelde oplossingen en gecontroleerde transfercondities.
- Aanpassing aan andere RNA-modificaties hangt af van de beschikbaarheid van specifieke antilichamen die deze modificaties herkennen.
- Praktische beperkingen omvatten het risico op RNA-degradatie en de noodzaak voor optimalisatie van de incubatie- en wascondities van de antilichamen.
