Parallel Meting van de circadiane klok genexpressie en hormoon in Human primaire celculturen
November 11th, 2016
Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.
The overall goal of this procedure is the parallel assessment of circadian bioluminescence and the secretory activity of human primary endocrine cells cultured and synchronized en vitro.This method can help to investigate the temporal pattern of cell secretion and how it can be regulated by cell-autonomous circadian clocks.The main advantage of this technique is that it allows us to monitor the circadian luciferins as reporter activity and, simultaneously collect outflow medium for measuring the levels of secreted hormones and myokines.To introduce circadian bioluminescence reporters into primary cells by lentiviral transduction, first, transfer the 3.5 cm petri dishes containing human myoblasts at 30%to 50%confluency to a laminar flow cabinet.Replace the human myoblast medium with 2 mL of growth medium.Then transduce the primary cell culture by pipetting lentivirus solution into the dish to obtain a multiplicity of infection equal to three.Incubate the cells overnight in a tissue-culture incubator.Change medium the next day.To achieve en vitro synchronization, add 10 micromolar adenylyl cyclase activator in 2 mL of medium per 3.5 cm petri dish containing the previously transfected primary cells.Incubate the cells for 60 minutes at 37
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie beschrijft methoden om circadiane bioluminiscentie te monitoren naast de secretoire activiteit van humane eilandcellen en primaire myotubes. De aanpak omvat lentivirale genoverdracht van een luciferase kernklokreporter, gevolgd door in vitro synchronisatie en continue celperifusie voor mediumverzameling.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Chronobiologie
Achtergrond
- Circadiane ritmen spelen een cruciale rol in cellulaire functies.
- Het monitoren van bioluminiscentie kan inzicht geven in cellulaire activiteit.
- Humane eilandcellen zijn essentieel voor insulinesecretie.
- Primaire myotubes zijn belangrijk voor het bestuderen van spierfysiologie.
Doel van het onderzoek
- Om de relatie tussen circadiane ritmen en secretoire activiteit te onderzoeken.
- Om een methode te ontwikkelen voor real-time monitoring van cellulaire functies.
- Om de begrip van metabolische processen in menselijke cellen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Lentivirale genoverdracht voor luciferase reporter expressie.
- In vitro synchronisatie van celculturen.
- Continue perfusie voor mediumverzameling.
- Bioluminiscentie meting om circadiane ritmen te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle monitoring van circadiane bioluminiscentie in humane eilandcellen.
- Gedemonstreerde secretoire activiteit van primaire myotubes.
- Een betrouwbare methode vastgesteld voor het bestuderen van cellulaire ritmen.
- Inzichten geboden in de interactie tussen circadiane biologie en cellulaire functie.
Conclusies
- De studie biedt een nieuwe aanpak om cellulaire activiteiten in real-time te monitoren.
- Bevindingen dragen bij aan het begrip van circadiane invloeden op metabolisme.
- Mogelijke toepassingen in diabetesonderzoek en spierfysiologie.
Veelgestelde vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Continuos Long-term Circadian Bioluminescence Recording, Performed in Parallel with the Assessment of Hormone Secretion in Living Human Primary Cells
2:24
Parallel Assessment of Circadian Bioluminescence Recording and Hormone Secretion Profiles in Synchronized Human Secretory Primary Cells
4:37
Results: Evaluation of the Clock Regulation of Basal IL-6 Secretion by Human Myotubes
5:33
Conclusion
