Parallel Meting van de circadiane klok genexpressie en hormoon in Human primaire celculturen
11 november 2016
Hier beschrijven we instellingen om parallel de circadiane bioluminescentie en de secretoire activiteit van humane eilandcellen en primaire myotubes te monitoren. Hiervoor gebruikten we lentivirale genoverdracht van een luciferase kernklok reporter, gevolgd door in vitro synchronisatie en het verzamelen van uitstroommedium door continue celperfusie.
Het algemene doel van deze procedure is de parallelle beoordeling van circadiane bioluminescentie en de secretoire activiteit van humane primaire endocriene cellen gekweekt en gesynchroniseerd en vitro.Deze methode kan helpen bij het onderzoeken van het temporele patroon van celsecretie en hoe dit kan worden gereguleerd door cel-autonome circadiane klokken.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons toestaat om de circadiane luciferines als reporter-activiteit te monitoren en tegelijkertijd uitstroommedium te verzamelen voor het meten van de niveaus van uitgescheiden hormonen en myokinen.Om circadiane bioluminescentie-reporters in primaire cellen te introduceren door middel van lentivirale transductie, breng eerst de 3,5 cm petrischalen met humane myoblasten bij 30% tot 50% confluentie over naar een laminaire stromingskast.Vervang het humane myoblast-medium met 2 mL groeimedium.Transduceer vervolgens de primaire celcultuur door lentivirussoplossing in de schaal te pipetten om een multipliciteit van infectie gelijk aan drie te verkrijgen.Incubeer de cellen een nacht in een weefselkweekincubator.Ververs het medium de volgende dag.Om synchronisatie en vitro te bereiken, voeg 10 micromolar adenylylcyclase-activator toe in 2 mL medium per 3,5 cm petrischaal die de eerder getransfecteerde primaire cellen bevat.Incubeer de cellen gedurende 60 minuten bij 37
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie beschrijft methoden om circadiane bioluminescentie te monitoren naast de secretieactiviteit van menselijke eilandjescellen en primaire myotubes. De aanpak omvat lentivirale genoverdracht van een luciferase core clock-reporter, gevolgd door in vitro synchronisatie en continue celperfusie voor het verzamelen van medium.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Chronobiologie
Achtergrond
- Circadiaanse ritmes spelen een cruciale rol bij cellulaire functies.
- Het monitoren van bioluminescentie kan inzicht bieden in de cellulaire activiteit.
- Menselijke eilandjes van Langerhans-cellen zijn essentieel voor de insulinesecretie.
- Primaire myotubes zijn belangrijk voor het bestuderen van de spierfysiologie.
Doel van de studie
- Om de relatie tussen circadiane ritmes en secretorische activiteit te onderzoeken.
- Om een methode te ontwikkelen voor real-time monitoring van cellulaire functies.
- Om het begrip van metabole processen in menselijke cellen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Lentivirale genoverdracht voor expressie van de luciferase-reporter.
- In vitro synchronisatie van celculturen.
- Continue perifusie voor de opvang van medium.
- Bioluminescentiemeting om circadiane ritmes te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle monitoring van circadiane bioluminescentie in menselijke eilandjescellen.
- Aantoonbare secretieactiviteit van primaire myotubes.
- Ontwikkeling van een betrouwbare methode voor het bestuderen van cellulaire ritmen.
- Inzichten verschaft in de wisselwerking tussen circadiane biologie en cellulaire functie.
Conclusies
- De studie biedt een nieuwe benadering om cellulaire activiteiten in realtime te monitoren.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van circadiane invloeden op het metabolisme.
- Potentiële toepassingen in diabetesonderzoek en spierfysiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Parallelle meting van de expressie van circadiane klokgenen en hormoonsecretie in primaire menselijke celculturen maakt directe analyse van de temporele regulatie in menselijke endocriene en spierstelsels mogelijk. Deze benadering verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van targets door moleculaire circadiane oscillatoren te koppelen aan functionele secretie-outputs. Het integreren van deze metingen in de ontdekkingsfase ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van metabole en chronobiologische programma's binnen de portfolio.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt mechanistische risicoreductie mogelijk door klokgenactiviteit te correleren met hormoon- en myokine-secretie in primaire menselijke cellen.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door kernklokgenen te verstoren en downstream secretie-effecten te kwantificeren.
- Vergemakkelijkt voorspellend vertrouwen in de selectie van pathways voor metabole en endocriene targets.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt gevalideerde, gesynchroniseerde primaire celsystemen vast voor een robuuste assayontwikkeling.
- Levert kwantitatieve, tijdopgeloste read-outs van zowel genexpressie als secretorische activiteit.
- Maakt een reproduceerbare beoordeling mogelijk van de effecten van verbindingen of genetische perturbaties op circadiane gereguleerde outputs.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt in vitro bevindingen in lijn met ziekterelevante menselijke fysiologie door het gebruik van primaire eilandjes- en spiercellen.
- Ondersteunt de ontdekking van translationele biomarkers door verstoringen van de moleculaire klok te koppelen aan functionele secretie-fenotypen.
- Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie in het metabole en chronobiologische onderzoek.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode slaat een brug tussen vroege ontdekking en preklinisch onderzoek door hypothesetoetsing van circadiane regulatie in primaire menselijke cellen mogelijk te maken, wat zowel de targetvalidatie als de translationele continuïteit ondersteunt.
- Discovery Biology: Maakt direct testen van de circadiane genfunctie en de impact daarvan op secretoire routes mogelijk.
- Screening: Biedt gesynchroniseerde, assay-ready primaire celmodellen met kwantitatieve outputs voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Genereert tijdgevoelige bioluminescentie- en secretiedata voor robuuste statistische vergelijking tussen condities.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt perturbatie van de moleculaire klok aan ziekterelateerde secretoire fenotypen in menselijke cellen.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar platform voor het evalueren van circadiane regulatie in diverse primaire celtypen en targets.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standardiseert langetermijn-parallelle meetworkflows in primaire menselijke cellen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door moleculaire en functionele output te koppelen in ziekterelevante systemen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van metabole en chronobiologische programma's mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in lentivirale transductie, primaire celkweek en bioluminescentiemeting.
- Vereist toegang tot gesynchroniseerde perifusiesystemen en gevoelige hormoon/myokine-assays.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor reproduceerbare gegevensverzameling van tijdreeksen.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende primaire celtypen of secretie-eindpunten.
- Langetermijnkweek en reporterstabiliteit moeten voor elke toepassing worden gevalideerd.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Continuos Long-term Circadian Bioluminescence Recording, Performed in Parallel with the Assessment of Hormone Secretion in Living Human Primary Cells
2:24
Parallel Assessment of Circadian Bioluminescence Recording and Hormone Secretion Profiles in Synchronized Human Secretory Primary Cells
4:37
Results: Evaluation of the Clock Regulation of Basal IL-6 Secretion by Human Myotubes
5:33
Conclusion
