Name: Gebruik makend van de Ethyleen-vrijmakende verbinding, 2-Chloroethylphosphonic zuur, als een instrument om ethyleenreactie in Bacteria Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Leer een veilige methode om bacteriële reacties op ethyleen te bestuderen met 2-chloroethylphosphonzuur (CEPA). Deze techniek vereist geen gespecialiseerde apparatuur en vervangt gevaarlijk gasvormig ethyleen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Dr. Dario Bonetta voor het verstrekken van Arabidopsis thaliana zaden en voor technische assistentie met betrekking tot de triple response assay, evenals Simone Quaranta voor hulp met FT-IR. Dit werk werd ondersteund door een Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (NSERC-DG) aan JLS, een Ontario Graduate Scholarship (OGS) aan RVA en een Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology (QEII-GSST) aan AJV.

1. stoffen <ol><li> Bereid een oplossing van 500 mM CEPA (144,49 g / mol) en een oplossing die zowel uit 500 mM NaCI (58,44 g / mol) en 500 mM NaH 2 PO 4 · H2O (137,99 g / mol) in aangezuurd (pH 2.5) ultra-zuivere water of 0,1 N HCl. Meng met behulp van een vortex totdat de oplossingen zijn duidelijk. </li><li> Serieel verdund (10x) de 500 mM oplossingen in hetzelfde oplosmiddel tot 5 mM en 50 mM voorraden te verkrijgen. </li><li> Bereid een 10 mM oplossing van 1-aminocyclopropaancarbonzuur (ACC; 101,1 g / mol) in ultra-zuiver water. </li><li> Filter-steriliseren voorraad oplossingen en bewaar monsters bij -20 ° C. </li><li> Filter-steriliseren cellulase. WINKEL porties bij 4 ° C. </li></ol> 2. Controleren Ethyleen Productie van 2-Chloroethylphosphonic Acid afbraak: Triple Response Assay <ol><li> Oppervlakte-steriliseren Arabidopsis thaliana Ecotype Columbia Seeds Het gebruik van de Vapor-fase Methode: LET OP: De volgende stap produceert toxic chloorgas. Gedrag zaad sterilisatie in een zuurkast. <ol><li> Het verkrijgen van een afsluitbare container diep genoeg om een ​​250 ml glazen beker voor zaadsterilisatie huisvesten en plaats deze in een zuurkast. </li><li> A. toevoegen thaliana zaden een microcentrifugebuis en plaatst de buis in een rek. Plaats het rek met de open buis in de afsluitbare container. Opmerking: Weet individuele buizen vullen niet meer dan de helft vol om chloorgas aan de lagere zaden te dringen. </li><li> Plaats een 250 ml bekerglas met 100 ml commercieel bleekmiddel de afsluitbare container. Voeg voorzichtig 3 ml geconcentreerd HCl aan het bleekmiddel en meteen de container met het deksel af te dichten. LET OP: Bleach en HCl te reageren op giftige chloorgas die werkt aan de oppervlakte-steriliseren van de zaden te produceren. </li><li> Incubeer de zaden in de aanwezigheid van chloorgas gedurende 4 uur in de zuurkast. Let op: Langere sterilisatie tijden zullen kieming efficiëntie. </li><li> Na sterilisatie, zodat de chlorine gas te ventileren in de zuurkast gedurende ten minste 1 uur dan sluit de microcentrifugebuis. Verlaat het bleekmiddel en HCl mengsel in de zuurkast gedurende ten minste 24 uur voor weggooien. Opmerking: Gesteriliseerde zaden kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur voor gebruik. </li><li> Geen zaden bij 4 ° C voor langdurige opslag. Breng zaden op kamertemperatuur voor het openen van de microcentrifugebuis om condensvorming te voorkomen. Store zaden in het donker. </li></ol></li><li> Bereid Agar Platen in 4-sector Petrischalen (90 x 15 mm): <ol><li> Bereid 110 ml groeimedium voor A. thaliana zaailingen: 1x Murashige en Skoog (MS) basaal medium 15 (4,33 g / l) bevattende 1% (w / v) sucrose en 0,8% (w / v) agar. Stel de MS-medium op pH 6 met NaOH. </li><li> Bereid 100 ml van bacteriële groeimedium voor CEPA ontleding: Schramm en Hestrin (SH) 16 medium bevattende 1,5% (w / v) agar. Stel de SH medium op pH 7 met NaOH. </li><li> Steriliseren media autoclaaf en temper in een 55 ° C waterbad. </li><li> Zodra de MS agar heeft getemperd, voeg 40 ml in een steriele kolf. Om de positieve controle groeimedium voor te bereiden A. thaliana zaailingen vult deze 40 ml van MS agar met 40 ui 10 mM ACC tot een eindconcentratie van 10 uM ACC verkrijgen. </li><li> Voeg 5 ml medium met de juiste kwadranten van de sectored Petrischalen (figuur 1) en laat de agar vast worden. Bereid alle platen in drievoud. Opmerking: CEPA wordt niet toegevoegd aan het kweekmedium tot later in het protocol. </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig1.jpg" /> Figuur 1:. Instellen van agarplaten voor de drievoudige respons assay met CEPA Een schematisch illustreert specifiek voor de negatieve controle (A), positieve controle (B) kwadranten en experimentele platen (C). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Augimeri en Strap 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="3"><li> Stratify A. thaliana zaden naar Synchrone Germination Zorgen: <ol><li> Voeg ongeveer vijftig A. thaliana zaden op elk kwadrant met MS of MS + ACC agar. Zorg ervoor dat zaden worden gelijkmatig verdeeld over zaailing verwijdering en analyse te vergemakkelijken. </li><li> Incubeer platen die zaden in het donker bij 4 ° C gedurende 3-4 dagen. </li></ol></li><li> Ontleden CEPA op bacteriegroei Medium (SH) en het uitvoeren van Triple Response Assay: <ol><li> Na stratificatie, bloot de zaden tot tl-licht gedurende 2 uur. </li><li> Verspreid 10 gl van de 500 mM voorraadoplossing CEPA op de kwadranten van de experimentele platen die SH-agar (pH 7 Figuur 1) tot een uiteindelijke concentratie te verkrijgen CEPAvan 1 mM. </li><li> Dicht de platen met laboratorium film en dek af met folie om een ​​donkere omgeving voor de zaden te maken. </li><li> Ontkiemen zaden door het incuberen platen in het donker bij 23 ° C gedurende 3 dagen met de agar naar beneden. Opmerking: De platen kunnen worden gestapeld, maar negatieve controles moeten op de bodem worden geplaatst, aangezien ethyleen is lichter dan lucht. </li></ol></li><li> Analyseer Triple Response Analyse van de gegevens: <ol><li> Met vlam gesteriliseerd pincet, verwijder enkele zaailingen van een plaat die overeenkomt met elke behandeling en het zicht onder een dissectie of digitale USB microscoop. Zorgen de onderkant van de zaailingen worden uitgelijnd en foto. </li><li> Verwijder 30 zaailingen van elk kwadrant (60 zaailingen per biologische repliceren en 180 zaailingen per behandeling). Lijn op een oppervlak met een zwarte achtergrond en een foto met een liniaal. </li><li> Meet de hypocotyl lengte (mm) van repliceren zaailingen met behulp van ImageJ software 17. Stel de schaal door te klikken en slepen van de * Straight *gereedschap een lengte van 10 mm te kiezen. Selecteer &quot;Set Scale&quot; onder het tabblad &quot;Analyseren&quot; en stel de bekende afstand tot 10. Met behulp van de * gesegmenteerde * tool, klik en sleep om de lengte van de hypocotyl en druk op M selecteren om afstand te meten. Vergelijk middel van biologische replicaten met een one-way ANOVA met meervoudige vergelijkingstest een Tukey. Verschillen worden significant geacht wanneer p &lt;0,05. </li></ol></li></ol> 3. Analyse van de pH tijdens bacteriegroei <ol><li> Groeien en te kwantificeren Komagataeibacter xylinus Starter Culturen in drievoud: <ol><li> Inoculeer een enkele kolonie van K. xylinus in 5 ml SH-medium (pH 5) aangevuld met 0,2% (v / v) steriel gefiltreerd cellulase. Incubeer kweken bij 30 ° C met schudden bij 150 rpm tot een OD600 van 0,3-0,4 bereikt (ongeveer 72 uur). </li><li> Oogst starterculturen door centrifugeren (2000 x g, 4 ° C, 10 min). Met 5 ml steriel 0,85% (w / v) NaCll oplossing, de cellen tweemaal wassen en resuspendeer de celpellet. Houd cellen op ijs. </li><li> Kwantificeren cellen met behulp van een Petroff-Hausser telkamer. </li></ol></li><li> Inoculeer Cultures for Analyse van de pH: <ol><li> Voeg 150 ml SH-bouillon (pH 7) aangevuld met 0,2% (v / v) steriel gefiltreerd cellulase twaalf 500 ml kolven met folie deksels. Wordt geënt in flessen met K. xylinus zuursels in een concentratie van 10 5 cellen / ml. Met behulp van de drie starter culturen, bereiden drie biologische herhalingen per behandeling. </li><li> Supplement kweken met 300 pi van de 5, 50 of 500 mM voorraadoplossingen CEPA definitieve CEPA verdunningen bereid van 0,01, 0,1 en 1,0 mM, respectievelijk. Supplement de onbehandelde controlekweken met 300 ul van het gebruikte oplosmiddel voor CEPA lossen. </li><li> Dicht de flessen stevig door taping de folie deksels kolven en incubeer gedurende 14 dagen kweken bij 30 ° C met schudden bij 150 rpm. </li></ol></li><li> Elke dag, aseptically verwijderen 5 ml monsters van elke kolf en pellet cellen door centrifugeren (2000 x g, 4 ° C, 10 min). Transfer supernatanten een schone buis en meet de pH van elk biologisch repliceren met behulp van een pH meter. </li><li> Analyseer het tijdsverloop data door grafieken de gemiddelde pH van het biologische herhalingen. Let op: Het is belangrijk dat de cultuur pH niet minder dan 3,5 heeft laten vallen; een kweek van pH 5 vermindert ethyleen vrijlating uit CEPA en een pH beneden 3,5 remt etheen release. </li><li> Te controleren chloor en fosfaatspiegels Voer een identiek experiment met 0,01, 0,1, en 1,0 mM van NaCl-NaH 2PO 4 oplossing met behulp van de 5, 50 en 500 mM voorraden respectievelijk. </li></ol> 4. Kolonie morfologie <ol><li> Grow K. xylinus Starter Culturen in drievoud: <ol><li> Inoculeer een enkele kolonie van K. xylinus in 5 ml SH-medium (pH 5) aangevuld met 0,2% (v / v) steriel gefiltreerd cellulase. Incubate kweken bij 30 ° C met schudden bij 150 rpm tot een OD600 van 0,3-0,4 bereikt (ongeveer 72 uur). </li><li> Oogst starterculturen door centrifugeren (2000 x g, 4 ° C, 10 min). Met 5 ml steriele zoutoplossing, was de cellen en resuspendeer de celpellet. Houd cellen op ijs. </li></ol></li><li> Bereid 24 agarplaten die 25 ml SH (pH 7) medium met 1,5% (w / v) agar. </li><li> Zodra de agar gestold, verspreid 50 ul van de 5, 50 en 500 mM voorraadoplossingen CEPA op agar definitieve CEPA concentraties van 0,01, 0,1 en 1,0 mM te verkrijgen, respectievelijk. Opgericht onbehandelde oplosmiddelcontrole platen, die uit niet wijziging en verspreiding van 50 gl van het gebruikte oplosmiddel voor de testverbindingen lossen. </li><li> Streak platen voor geïsoleerde kolonies met een lus vol (~ 5 pl) van K. xylinus starter cultuur en verzegelen ze met paraffine film. Inoculeer alle platen in drievoud. Incubeer de platen gedurende vijf dagen bij 30 ° C. </li><li> Photograph kolonies bij een vergroting van 20x met behulp van een digitale USB microscoop en kwalitatief beoordelen koloniale morfologie en cellulose productie op vast medium. Opmerking: Cellulose verschijnt als een wazige stof langs de rand van de kolonie. </li><li> Te controleren chloor en fosfaatspiegels Voer een identiek experiment met 0,01, 0,1, en 1,0 mM van NaCl-NaH 2PO 4 oplossing met behulp van de 5, 50 en 500 mM voorraden respectievelijk. </li></ol> 5. Pellicle Testen <ol><li> Groeien en te kwantificeren K. xylinus Starter Culturen in drievoud: <ol><li> In drievoud Inoculeer een enkele kolonie van K. xylinus in 5 ml SH-medium (pH 5) aangevuld met 0,2% (v / v) steriel gefiltreerd cellulase. Incubeer kweken bij 30 ° C met schudden bij 150 rpm tot een OD600 van 0,3-0,4 bereikt (ongeveer 72 uur). </li><li> Oogst starterculturen door centrifugeren (2000 x g, 4 ° C, 10 min). Met 5 ml steriele zoutoplossing, wassen thij cellen tweemaal en resuspendeer de celpellet. Houd cellen op ijs. </li><li> Kwantificeren cellen met behulp van een Petroff-Hausser telkamer. </li></ol></li><li> Bereid Master Mixes om geënt 24-well platen: <ol><li> Supplement 60 ml SH-medium (pH 7) met 120 ul van de 5, 50 en 500 mM CEPA voorraden CEPA uiteindelijke concentraties te verkrijgen van 0,01, 0,1 en 1,0 mM, respectievelijk. Supplement andere 60 ml SH-medium (pH 7) met 120 ul van het gebruikte oplosmiddel voor CEPA lossen. Vortex te mengen. </li><li> Verdeel elk 60 ml van CEPA-bevattend medium in vier 14 ml porties. Enten van de drie 14 ml porties biologische herhalingen startercultuur bij een concentratie van 10 5 cellen / ml. Blijf buizen met cellen op ijs te voorkomen celluloseproduktie. Opmerking: De resterende 14 ml monster wordt gebruikt voor steriele controleputjes. </li></ol></li><li> Wordt geënt in 24-well platen: <ol><li> Test elke behandeling in zijn eigen plaat met drie rijen en biologische repliceerteen rij van steriele controles (figuur 2). </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig2.jpg" /> Figuur 2:. Stroomschema illustreert het protocol voor vlies bepaling en analyse De CEPA gesupplementeerd pH 7 SH-medium (60 ml) wordt in porties gedurende drie aparte biologische herhaalde inoculaties en een steriele controle (14 ml elk). Deze kweken worden vervolgens in porties verdeeld in zes technische replicaten (2 ml) in een 24 wells plaat en vervolgens afgedicht met paraffine film. Na incubatie gedurende 7 dagen bij 30 ° C, worden pellicles geoogst en gekenmerkt door het bepalen van natte gewicht en de dikte droog gewicht, en kristalliniteit door FT-IR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken</a> <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Met behulp van de 14 ml master mix, voeg 2 ml in each zes putjes van een steriele 24-putjes plaat. Voltooi de drie biologische repliceert en steriele controle (Figuur 2). Herhaal dit voor elke behandeling. </li><li> Seal-platen met paraffine film en incubeer statisch gedurende 7 dagen bij 30 ° C. </li></ol><ol start="4"><li> Harvest en Meet Pellicle Wet gewicht en de dikte droog gewicht (Cellulose Yield) en de kristalliniteit (figuur 2): <ol><li> Druk op de ene kant van het vlies aan de tegenpartij vlies rand verheffen en te verwijderen individuele pellicles met een pincet. Met behoud van grip, leg ze op nieuw papier handdoek voor 3 sec om het overtollige medium te verwijderen voorafgaand aan het wegen om hun natte gewichten te bepalen. </li><li> Lijn pellicles naast een liniaal en een foto van de zijkant met behulp van een hoge resolutie digitale camera. </li><li> Met behulp van ImageJ software 17, meten vlies dikte op de linker schouder, rechter schouder en het midden van elke vliesje. Gemiddeld alle technische replica voor elke biologische Replicate. </li><li> Individueel de pellicles overbrengen in de putjes van een 6-wells plaat. Pellicles behandelen met 12 ml 0,1 N NaOH bij 80 ° C gedurende 20 min te lyseren. </li><li> Verwijder de NaOH en geneutraliseerd pellicles door wassen met ultrazuiver water gedurende 24 uur onder roeren. Ververs het water elke 6 uur. Opmerking: Pellicles moet wit na voltooiing van de was- stap. </li><li> Plaats pellicles op silicium matten en droog bij 50 ° C gedurende 48 uur tot constant gewicht. Eenmaal droog, te verwijderen uit matten en meet vlies gewichten op een analytische schaal bacteriële cellulose opbrengst te bepalen. </li><li> Analyseer vliesje kristalliniteit via Fourier-transform infrarood spectroscopie (FT-IR) met behulp 32 scans en een resolutie van 4 cm -1 in het traject van 4000 tot 650 cm -1. Bereken de kristalliniteitsindex, CI (IR) met behulp van een 1437/895 A; de absorptieverhouding van de &quot;kristallijne band&quot; en &quot;band amorf&quot; zoals eerder beschreven 18. </li></ol&gt; </li><li> Te controleren chloor en fosfaatspiegels Voer een identiek experiment met 0,01, 0,1, en 1,0 mM van NaCl-NaH 2PO 4 oplossing met behulp van de 5, 50 en 500 mM voorraden respectievelijk. </li><li> Analyseer Pellicle gegevens: <ol><li> Bereken vliesje hydratatie door het verschil te bepalen tussen vlies nat gewicht en droog gewicht. </li><li> Het gemiddelde van de waarden van alle technische replicaten een bepaalde waarde voor elke biologische repliceren voor statistische analyse te verkrijgen. Vergelijk behandelingen met een one-way ANOVA met meervoudige vergelijkingstest Tukey. Verschillen significant als p &lt;0,05. </li><li> Normaliseren data als het percentage van de onbehandelde controles en plot de middelen om biologische repliceert. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Guzmán, P., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+triple+response+of+Arabidopsis+to+identify+ethylene-related+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants.</a> Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).</li>
<li>Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+research+on+the+plant+hormone+ethylene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Growth+Regul%22%5BJournal%5D)">History of research on the plant hormone ethylene.</a> J. Plant Growth Regul. 34 (4), 809-827 (2015).</li>
<li>Schaller, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+and+the+regulation+of+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Ethylene and the regulation of plant development.</a> BMC Biol. 10 (1), (2012).</li>
<li>Hua, J., Sakai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EIN4+and+ERS2+are+members+of+the+putative+ethylene+receptor+gene+family+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 10 (8), 1321-1332 (1998).</li>
<li>Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insensitivity+to+ethylene+conferred+by+a+dominant+Mutation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Insensitivity to ethylene conferred by a dominant Mutation in Arabidopsis thaliana.</a> Science. 241 (4869), 1086-1089 (1988).</li>
<li>Hamilton, A. J., Bouzayen, M., Grierson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+tomato+gene+for+the+ethylene-forming+enzyme+by+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of a tomato gene for the ethylene-forming enzyme by expression in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (16), 7434-7437 (1991).</li>
<li>Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+ethylene+removal+with+Pseudomonas+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hazard.+Mater%22%5BJournal%5D)">Assessment of ethylene removal with Pseudomonas strains.</a> J. Hazard. Mater. 131 (3), 131-136 (2006).</li>
<li>Kim, H. E., Shitashiro, M., Kuroda, A., Takiguchi, N., Kato, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+chemotaxis+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+other+Pseudomonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Environ%22%5BJournal%5D)">Ethylene chemotaxis in Pseudomonas aeruginosa and other Pseudomonas species.</a> Microbes Environ. 22 (2), 186-189 (2007).</li>
<li>Augimeri, R. V., Strap, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phytohormone+ethylene+enhances+bacterial+cellulose+production%2C+regulates+CRP%2FFNRKx+transcription+and+causes+differential+gene+expression+within+the+cellulose+synthesis+operon+of+Komagataeibacter+%28Gluconacetobacter%29+xylinus+ATCC+53582%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The phytohormone ethylene enhances bacterial cellulose production, regulates CRP/FNRKx transcription and causes differential gene expression within the cellulose synthesis operon of Komagataeibacter (Gluconacetobacter) xylinus ATCC 53582.</a> Front. Microbiol. 6, 1459(2015).</li>
<li>Zhang, W., Wen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ethylene+gas+and+comparison+of+ethylene+responses+induced+by+ethylene%2C+ACC%2C+and+ethephon%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Preparation of ethylene gas and comparison of ethylene responses induced by ethylene, ACC, and ethephon.</a> Plant Physiol. Biochem. 48 (1), 45-53 (2010).</li>
<li>Zhang, W., Hu, W., Wen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+preparation+and+its+application+to+physiological+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal.+Behav%22%5BJournal%5D)">Ethylene preparation and its application to physiological experiments.</a> Plant Signal. Behav. 5 (4), 453-457 (2010).</li>
<li>Warner, H. L., Leopold, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+evolution+from+2-chloroethylphosphonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ethylene evolution from 2-chloroethylphosphonic acid.</a> Plant Physiol. 44 (1), 156-158 (1969).</li>
<li>Biddle, E., Kerfoot, D. G. S., Kho, Y. H., Russell, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+studies+of+the+thermal+decomposition+of+2-chloroethylphosphonic+acid+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic studies of the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid in aqueous solution.</a> Plant Physiol. 58 (5), 700-702 (1976).</li>
<li>Klein, I., Lavee, S., Ben-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+water+vapor+pressure+on+the+thermal+decomposition+of+2-chloroethylphosphonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of water vapor pressure on the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid.</a> Plant Physiol. 63 (3), 474-477 (1979).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>Schramm, M., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+production+of+cellulose+at+the+air%2Fliquid+interface+of+a+culture+of+Acetobacter+xylinum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum.</a> J. Gen. Microbiol. 11 (1), 123-129 (1954).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Ciolacu, D., Ciolacu, F., Popa, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amorphous+cellulose-structure+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Cellul.+Chem.+Technol%22%5BJournal%5D)">Amorphous cellulose-structure and characterization.</a> Cellul. Chem. Technol. 45 (1), 13-21 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven werkwijzen beschrijven de in situ bereiding van ethyleen uit CEPA voor de studie van bacteriële ethyleenreactie met het modelorganisme, K. xylinus. Deze werkwijze is zeer nuttig als ethyleen kan worden verkregen door aanvulling elk waterig medium dat een pH heeft hoger dan 3,5 10,11 met CEPA ontkennen de noodzaak van zuivere ethyleengas of gespecialiseerde laboratoriumapparatuur. Deze methode is niet beperkt tot het bestuderen van de effecten van CEPA afgeleide etheen bact...

Het olefine etheen (C 2 H 4) werd ontdekt als een plantenhormoon in 1901 toen het werd vastgesteld dat erwt zaailingen, gekweekt in een laboratorium steenkolengas lampen gebruikt, vertoonde een abnormale morfologie waarbij stengels (hypocotylen) waren korter, dikker en boog zich zijwaarts ten opzichte van de normale erwt zaailingen; een fenotype later aangeduid als de triple respons 1,2. Latere studies toonden aan dat ethyleen een belangrijke plantenhormoon dat talrijke ontwikkelingsprocessen zoals groei, stressrespons, rijping van fruit en senescence 3. Arabidopsis thaliana, modelorganisme voor plantenbiologie onderzoek regelt, werd bestudeerd met betrekking tot de reactie op ethyleen. Verschillende ethyleen reactie mutanten zijn geïsoleerd door het benutten van de triple respons fenotype waargenomen in het donker-volwassen A. thaliana zaailingen in aanwezigheid van etheen 1,4,5. De biosynthetische voorloper voor ethyleen productie in planten is 1-aminocyclopropane carbonzuur (ACC) 6 en wordt vaak gebruikt in de drievoudige respons assay endogene etheenproduktie die leidt naar de drievoudige respons fenotype 1,4,5 verhogen. Hoewel de ethyleenreactie schaal bestudeerd in planten, is het effect van exogeen ethyleen op bacteriën zeer weinig bestudeerd ondanks de nauwe associatie van bacteriën met planten. Een studie meldde dat bepaalde Pseudomonas stammen kunnen overleven met behulp van ethyleen als enige bron van koolstof en energie 7. Echter slechts twee studies aangetoond dat de bacteriën reageren op ethyleen. De eerste studie toonde aan dat stammen van Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida en P. syringae waren chemotactische richting van ethyleen met gebruik van agarose plug assay waarin gesmolten agarose werd gemengd met een chemotaxis buffer geëquilibreerd met zuiver ethyleengas 8. Echter, voor zover ons bekend, zijn er geen furth geweester rapporten met behulp van zuiver ethyleengas om bacteriële ethyleen reactie, waarschijnlijk te karakteriseren als gevolg van de moeilijkheid van de behandeling van gassen in het laboratorium zonder gespecialiseerde apparatuur. Het tweede rapport van bacteriële ethyleen reactie aangetoond dat ethyleen verhoogde bacteriële cellulose productie en beïnvloed genexpressie in de fruit-geassocieerde bacterie, Komagataeibacter (voorheen Gluconacetobacter) xylinus 9. In dit geval, de ethyleen vrijmakende verbinding, 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA) werd gebruikt om ethyleen in situ te produceren binnen het bacteriële groeimedium, het omzeilen van de behoefte aan zuivere ethyleengas of gespecialiseerde apparatuur. CEPA ethyleengas in een 1: 1 molaire verhouding boven pH 3,5 10,11 via een base gekatalyseerde eerste orde reactie 12-14. De afbraak van CEPA is positief gecorreleerd met pH en temperatuur 13,14 en resulteert in de productie van ethylalcoholeen, chloride en fosfaat. CEPA biedt onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van bacteriële reacties op ethyleen met een handig alternatief voor gasvormige ethyleen. Het algemene doel van de volgende protocollen wordt een eenvoudige en efficiënte werkwijze voor bacteriële ethyleenreactie bestuderen en inclusief validering van fysiologisch relevante niveaus etheenproductiefaciliteiten van CEPA decompositie in bacteriële groeimedium analyse cultuur pH te waarborgen CEPA ontleding, niet verminderd tijdens de groei van bacteriën, en de evaluatie van het effect van ethyleen op de bacteriële morfologie en fenotype. We laten deze protocollen het gebruik van K. xylinus echter deze protocollen kunnen worden aangepast ethyleenrespons bij andere bacteriën bestuderen door het geschikte groeimedium en fenotype analyse.

<table><tbody><tr><td>1-aminocyclopropaancarbonzuur (ACC)</td><td>Sigma</td><td>A3903</td><td>Biosynthetische voorloper van ethyleen in planten</td></tr><tr><td>4-sector Petri-schaal</td><td>Phoenix Biomedical</td><td>CA73370-022</td><td>Voor het testen van drievoudig antwoord</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop</td><td>AGR001.1</td><td>Om medium te verharden</td></tr><tr><td>Canon Rebel T1i DLSR-camera</td><td>Canon</td><td>3818B004</td><td>Voor foto's van pellicles</td></tr><tr><td>Cellulase van Trichoderma reesei ATCC 26921&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C2730</td><td>Waterige oplossing</td></tr><tr><td>Citroenzuur</td><td>BioShop</td><td>CIT002.500</td><td>Voor SH-medium</td></tr><tr><td>Commerciële bleek</td><td>Life Brand</td><td>57800861874</td><td>Bleach voor zaadsterilisatie</td></tr><tr><td>Geconcentreerd HCl</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td>Zoutzuur voor pH-aanpassing</td></tr><tr><td>Digitaal USB-microscoop</td><td>Plugable</td><td>N/A</td><td>Voor foto's van kolonies</td></tr><tr><td>Ethefon (>96%; 2-chloorethylfosfonzuur)</td><td>Sigma</td><td>C0143</td><td>Ethyen-afgevende verbinding</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>Voor SH-medium</td></tr><tr><td>Komagataeibacter xylinus ATCC 53582</td><td>ATCC</td><td>53582</td><td>Bacterieel cellulose-producerend alphaproteobacterie</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisje</td><td>LifeGene</td><td>LMCT1.7B</td><td>1,7 ml microcentrifugebuisje</td></tr><tr><td>Murashige en Skoog (MS) basaal medium&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td>Arabidopsis thaliana-groeimedium</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot;7H2O&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPD579.500</td><td>Natriumfosfaat, dibasisch heptahydraat voor SH-medium</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioBasic</td><td>SOD001.1</td><td>Natriumchloride voor zoutoplossing en controle-oplossing</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot;H2O&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPM306.500</td><td>Natriumfosfaat, monobasisch monohydraat voor controle-oplossing</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>BioShop</td><td>SHY700.500</td><td>Natriumhydroxide voor pH-aanpassing</td></tr><tr><td>Paraffinefilm</td><td>Parafilm</td><td>PM996</td><td>Voor het afdichten van platen en kolven</td></tr><tr><td>Peptone (bacteriologisch)</td><td>BioShop</td><td>PEP403.1</td><td>Voor SH-medium</td></tr><tr><td>Petroff-Hausser telkamer</td><td>Hausser scientific</td><td>3900</td><td>Tellenkamer voor bacteriële cellen</td></tr><tr><td>Polyethersulfon sterilisatiefilter 0,2 &micro;m</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>Voor het steriliseren van cellulase</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>BioShop</td><td>SUC600.1</td><td>Sucrose voor MS-medium</td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>Voor SH-medium</td></tr></tbody></table>

gebruik makend van de ethyleen-vrijmakende verbinding, 2-chloroethylphosphonic zuur, als een instrument om ethyleenreactie in bacteria studie

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Etheen (C2H4) is een gasvormig fytohormoon dat betrokken is bij tal van aspecten van plantontwikkeling, en speelt een dominante rol bij veroudering en fruitrijping. Exogene etheen toegepast tijdens vroege plantontwikkeling activeert het triple response fenotype; een kortere en dikkere hypocotyl met een overdreven apicale haak. Ondanks de nauwe relatie tussen planten en bacteriën, is het effect van exogene etheen op bacteriën grotendeels over het hoofd gezien. Dit is deels te wijten aan de moeilijkheid om gasvormig etheen te controleren in het laboratorium zonder gespecialiseerde apparatuur. 2-Chloroetylfosfonzuur (CEPA) is een verbinding die zich ontbindt in etheen, chloor en fosfaat in een molaire verhouding van 1:1:1:1 wanneer opgelost in een waterig medium met een pH van 3,5 of hoger. Hier beschrijven we het gebruik van CEPA om in situ etheen te produceren voor de onderzoek van etheenreactie in bacteriën met behulp van de fruit-geassocieerde, cellulose-producerende bacterie Komagataeibacter xylinus als modelorganisme. De protocollen die hierin worden beschreven, omvatten zowel de verificatie van etheenproductie uit CEPA via de Arabidopsis thaliana triple response assay als de effecten van exogene etheen op K. xylinus celluloseproductie, pellicle-eigenschappen en koloniemorfologie. Deze protocollen kunnen worden aangepast om het effect van etheen op andere microben te onderzoeken met behulp van geschikte groeimedia en fenotypeanalyses. Het gebruik van CEPA biedt onderzoekers een eenvoudige en efficiënte alternatief voor zuiver etheengas voor de routinematige bepaling van bacteriële etheenrespons.

Een schematische opzet plaat voor het verifiëren van ethyleen bevrijding van CEPA in SH-medium (pH 7) van de drievoudige respons assay wordt getoond in Figuur 1A - C. Een stroomschema illustreert de pellicule protocol wordt getoond in figuur 2. donker-gekweekte A. thaliana zaailingen vertonen drievoudige respons fenotype (korter en dikker hypocotyl met een overdreven apicale haak) in aanwezigheid van ACC en in aanwezigheid van e...

De hier beschreven protocollen vergemakkelijken de gemakkelijke onderzoeking van bacteriële ethyleenreacties door gebruik te maken van 2-chloorethylfosfonzuur (CEPA). Ethyleen wordt in situ geproduceerd door de ontbinding van CEPA in een aqueus bacteriegroeimedium, waardoor de vereiste voor zuiver ethyleengas wordt omzeild.

Gebruik makend van de Ethyleen-vrijmakende verbinding, 2-Chloroethylphosphonic zuur, als een instrument om ethyleenreactie in Bacteria Studie

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Het algemene doel van deze procedure is om een eenvoudige en veilige methode te bieden voor de studie van de bacteriële respons op ethyleen. Deze methode zal belangrijke vragen beantwoorden over plant-microbe-interacties, zoals de rol die ethyleen speelt bij de bacteriële adhesie en kolonisatie van planten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er geen gespecialiseerde apparatuur nodig is en dat het veel veiliger is dan het werken met gasvormig ethyleen in het laboratorium.Hoewel deze methode inzicht kan geven in hoe de productie van bacteriële cellulose wordt beïnvloed door ethyleen, kan deze ook worden toegepast op andere plant-geassocieerde micro-organismen voor de in vitro studie naar hoe ethyleen-gemedieerde processen betrokken zijn bij plantkolonisatie. Maak ter voorbereiding 100 milliliters groeimedium voor de Arabidopsis-zaailingen en 100 milliliters bacterieel groeimedium voor de CEPA-afbraak. Zodra het arabidopsis-medium op temperatuur is, verdeelt u 40 milliliters naar een steriele kolf en vult u dit aliquot aan met 40 microliters 10 millimolair ACC.Vul nu de kwadranten van de plaat met vijf milliliter medium en laat de agar stollen. Tegenoverliggende kwadranten van alle platen bevatten bacterieel groeimedium en arabidopsismedium. Gebruik drie verschillende mediumconfiguraties.De CEPA-behandeling vindt later in het protocol plaats. Bereid elke plaatconfiguratie in triplo. Zodra de agar is afgekoeld, worden ongeveer 50 zaden gelijkmatig verdeeld over elk kwadrant van het arabidopsis-medium.Incubeer de platen vervolgens in het donker bij vier graden Celsius gedurende drie tot vier dagen. Stel de zaden na incubatie bloot aan fluorescent licht gedurende twee uur. Verdeel daarna 10 µL van een 500 mM CEPA-stamoplossing over de bacteriële agar van één plaatconfiguratie.De uiteindelijke CEPA-concentratie in de agar zal één millimolair zijn. Seal nu alle platen met laboratoriumfolie en wikkel ze in aluminiumfolie. Plaats de platen vervolgens onderdonken in een donkere omgeving bij 23 graden Celsius met de agarzijde naar beneden en laat ze drie dagen incuberen om de zaden te laten kiemen.Nadat de zaden zijn gekiemd, gebruikt u vlamgesteriliseerde pincetten om de zaailingen van elke behandeling te verwijderen. Selecteer 30 zaailingen uit elk kwadrant voor een totaal van 180 per behandeling. Maak beelden van de zaailingen onder een dissectiemicroscoop of met een digitale camera met hoge resolutie tegen een zwarte achtergrond, met daarnaast een liniaal voor de schaal.Meet vervolgens de lengte van de hypocotylen met de ImageJ-software. Meet met de 'straight tool' 10 millimeters en selecteer 'Set Scale' onder het tabblad 'Analyze' om de schaal in te stellen. Gebruik daarna de 'Segmented tool' onder de 'Straight Line tool' om elke hypocotyl te meten en druk op M om de lengtes te berekenen.De pellicle-assay is een standaard analyse-instrument voor de productie van bacteriële cellulose. De pH- en morfologische analyse zijn gedetailleerd beschreven in het betreffende protocol. Oogst ter voorbereiding cellen uit startculturen in triplikaat en kwantificeer de cellen met behulp van een Petroff-Hauser telkamer.Bereid vervolgens vier medium mastermixen voor met verschillende CEPA-concentraties. Aliquoteer voor elke mastermix 60 milliliters pH 7 SH-medium en voeg 120 microliters van een CEPA-stockoplossing van nul, vijf, 50 of 500 millimolar toe om uiteindelijke CEPA-concentraties van nul, 0,1, 0,1 of 1,0 millimolar te verkrijgen. Meng deze media door de kolven te zwenken.Voor elk van de triplicaten is één set medium nodig en een vierde set is nodig om als steriele controle te dienen. Verdeel daarom elke mediumbereiding van 60 milliliter in vier aliquoten van 14 milliliter. Koel vervolgens de aliquoten van 14 milliliter voor voordat ze worden geinoculeerd met hun respectievelijke startculturen voor een uiteindelijke concentratie van 100.000 cellen per milliliter.Houd alle geinoculeerde buizen op ijs om celluloseproductie te voorkomen. Gebruik de resterende 14 milliliter aliquots voor steriele controleputjes. Laad nu, vanuit elke 14 milliliter mastermix, twee milliliter aliquots in zes putjes van een steriele 24-wells plaat, voor een totaal van vier geladen platen per geanalyseerde startcultuur.Verzegel de platen zorgvuldig met paraffinefolie en laat ze zeven dagen statisch incuberen bij 30 °C. Incubeer tijdens deze periode parallel een vloeibare cultuur van 25 mL om periodiek de zuurgraad van het medium te meten. Indien de zuurgraad daalt tot onder een pH van 5, zal de groei van het organisme de afbraak van CEPA tot ethyleen remmen en is deze daarmee incompatibel met deze assay.Oogst een week later de pellikel en meet het natgewicht, de dikte, het drooggewicht en de kristalliniteit. Om een pellikel van de plaat te verzamelen, drukt u op één zijde van de pellikel om de tegenovergesteld zijde op te tillen en pakt u deze op met een pincet. Terwijl u de grip behoudt, plaatst u deze gedurende drie seconden op een schoon vloeipapier om overtollig medium te verwijderen.Weeg vervolgens elke pellikel en noteer dit als het natte gewicht. Lijn daarna de pellikels langs een liniaal uit en fotografeer ze van opzij met een digitale camera met hoge resolutie. Analyseer deze foto's om de diktes van de pellikels te bepalen.Houd vervolgens de pellikels individueel over naar de putjes van een six-well plaat. Behandel ze met 12 milliliters 0,1 normaal natriumhydroxide bij 80 graden Celsius gedurende 20 minuten om de cellen te lyseren. Verwijder daarna het natriumhydroxide en neutraliseer de behandelde pellikels door ze 24 uur lang grondig te wassen met 12 milliliters ultrapuur water onder agitatie in een six-well plaat.Vervang tijdens deze incubatie elke zes uur het water. Na afloop van de incubatie moeten de pellikels wit zijn. Plaats de pellikels vervolgens op siliconen matten en droog ze 48 uur lang bij 50 graden Celsius ter voorbereiding op de meting van het droggewicht.De kristalliniteit van de pellikels kan worden geanalyseerd met behulp van Fourier-transform infraroodspectroscopie. In het donker gekweekte Arabidopsis thaliana-zaailingen vertoonden het triple response-fenotype van een korte, dikke hypocotyl met een uitgesproken apicale haak in aanwezigheid van ACC en in aanwezigheid van ethyleen geproduceerd door de ontbinding van CEPA op SH-medium, maar niet onder onbehandelde condities. Duidelijk was dat de hypocotyllengte van de behandelde zaden significant korter was dan die van de onbehandelde controles.Zo werd ethyleen uit CEPA vrijgegeven op SH-medium in een fysiologisch relevante concentratie. Alle concentraties CEPA-afgeleid ethyleen zorgden voor een significante afname van het natte gewicht van de pellicle, maar hadden geen invloed op de dikte van de pellicle, en alle concentraties CEPA-afgeleid ethyleen zorgden voor een significante toename van het droge gewicht van de pellicle. Bovendien werd de hydratatie van de pellicle verminderd door alle concentraties CEPA-afgeleid ethyleen.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de pH van het groeimedium te meten om ervoor te zorgen dat de pH niet onder de vijf zakt, zodat de degradatie van CEPA tot ethyleen niet wordt geremd. Houd er rekening mee dat CEPA in poedervorm extreem gevaarlijk is voor slijmvliezen. Er moet altijd de nodige voorzichtigheid in acht worden genomen bij het uitvoeren van dit protocol.Deze techniek stelt onderzoekers die geïnteresseerd zijn in interacties tussen planten en bacteriën in staat om veilig in vitro onderzoek te doen naar ethyleen-gemedieerde responsen. Dit zal helpen bij het verduidelijken van de wijze waarop plantensignalen bacteriële kolonisatie en adhesie mediëren. Momenteel is dit onderzoeksveld nog onvoldoende bestudeerd.

utilizing-ethylene-releasing-compound-2-chloroethylphosphonic-acid-as

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

We hebben een eenvoudige en reproduceerbare protocol om stomatale reactie op de levende bacteriën te openen. Deze methode minimaliseert verwonden en manipulatie van het blad ten opzichte van het gebruik van de epidermale schillen eerder gerapporteerd.

Het beoordelen van stomatale Reactie op bacteriële cellen Live met behulp van Whole Leaf Imaging

Source: Nathoo, N., et al. A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates a hydroponic co-cultivation system for studying plant–bacteria interactions under sterile conditions. Plant seedlings are transferred into a sterile, acidic growth medium, incubated, and inspected for contamination before inoculation with Agrobacterium. The activated bacteria attach to plant...

A Co-Cultivation System to Study the Molecular Responses of Plant Hosts and Interacting Bacteria

Source: Augimeri, R. V. et. al., Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the effect of ethylene generated by 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA) on bacterial growth and cellulose production. Ethylene activates signaling pathways that stimulate cellulose synthesis, resulting in enhanced pellicle formation. These results highlight the bacterial response to ethylene.

Investigating the Bacterial Response to Ethylene Using an Ethylene-Releasing Compound

Kwantificering van ziekteverwekkergroei is een krachtig hulpmiddel om verschillende Arabidopsis thaliana (hierna: Arabidopsis) immuunresponsen te karakteriseren. De hier beschreven methode presenteert een geoptimaliseerde spuitinfiltratie-assay om de groei van Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 in volwassen Arabidopsis-bladeren te kwantificeren.

Bacteriële Leaf Infiltratie Assay voor Beeldende karakterisatie van Plant Defense Reacties met behulp van de<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

We beschrijven een eenvoudige methode voor het screenen van bacterieculturen op de productie van verbindingen die remmend werken op andere bacteriën.

Het gebruik van de Soft-agar Overlay techniek voor het screenen op bacterieel geproduceerd remmende verbindingen

Fluorescerende eiwit gebaseerde benaderingen te controleren effectoren uitgescheiden door bacteriën in de cellen van de gastheer zijn uitdagend. Dit is te wijten aan de incompatibiliteit tussen fluorescente proteïnen en het type III secretie systeem. Hier, wordt een geoptimaliseerde split superfolder GFP-systeem gebruikt voor visualisatie van effectoren uitgescheiden door bacteriën in de fabriek van de gastheercel.

Split groen Fluorescent proteïne systeem te visualiseren effectoren verlost van bacteriën tijdens de infectie

Het doel van dit manuscript is om een overzicht te presenteren voor de uitgebreide biochemische en functionele studies van de RING-type E3 ubiquitine ligases. Deze pijplijn met meerdere stappen, met gedetailleerde protocollen, valideert een enzymatische activiteit van de geteste eiwitten en laat zien hoe u de activiteit koppelt aan functie.

Functionele karakterisatie van RING-type E3 Ubiquitin ligases in vitro en in planta

Hier presenteren we een stapsgewijs protocol voor het uitvoeren van het proximity-labeling (PL)-experiment in komkommer (Cucumis sativus L.) met behulp van AT4G18020 (APRR2)-AirID-eiwit als model. De methode beschrijft de constructie van een vector, de transformatie van een construct door agro-infiltratie, biotine-infiltratie, eiwitextractie en zuivering van biotine-gelabelde eiwitten door middel van affiniteitszuiveringstechniek.

AirID-gebaseerde nabijheidsetikettering voor eiwit-eiwitinteractie in planten

Het huidige protocol beschrijft een methode die eencellige genexpressieanalyse mogelijk maakt op Pseudomonas syringae-populaties die in de apoplast van de plant worden gekweekt.

Eencellige analyse van de expressie van Pseudomonas syringae-genen in het plantenweefsel

Dit protocol beschrijft een high-throughput benadering voor het evalueren van plantionenlekkage, peroxidaseactiviteit en calloseproductie in hetzelfde monster.

Evaluatie van bladreacties op microbiële secundaire metabolieten met behulp van een high-throughput formaat

Leer een veilige methode om bacteriële reacties op ethyleen te bestuderen met 2-chloroethylphosphonzuur (CEPA). Deze techniek vereist geen gespecialiseerde apparatuur en vervangt gevaarlijk gasvormig ethyleen.

Gebruik makend van de Ethyleen-vrijmakende verbinding, 2-Chloroethylphosphonic zuur, als een instrument om ethyleenreactie in Bacteria Studie (Video) | JoVE Journal

Gebruik makend van de Ethyleen-vrijmakende verbinding, 2-Chloroethylphosphonic zuur, als een instrument om ethyleenreactie in Bacteria Studie

Meer video's verkennen