Karakterisering van Multi-subunit eiwitcomplexen of Human MxA het gebruik van niet-denaturerende Polyacrylamide Gel-elektroforese

Het algemene doel van dit experiment is om het aantal subunits in homooligomere proteïnecomplexen in cellysaten te bepalen met behulp van niet-denaturerende natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de celbiologie, zoals de oligomere status van proteïnen die betrokken zijn bij fundamentele cellulaire processen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat zuivering van de homooligomere proteïnecomplexen of gespecialiseerde, dure apparatuur niet vereist is.

Daarom kan deze methode in de meeste laboratoria worden uitgevoerd. In dit experiment worden twee typen cellen gebruikt: A549-cellen die endogeen Myxovirus resistance A-eiwit, of MxA, tot expressie brengen, en virocellen die MxA overexpresseren.

Zaai de A549-cellen en virocellen uit in platen met zes putjes, met twee milliliters groeimedium per putje. Incubeer de cellen gedurende de nacht in een celkweekincubator. Oogst de cellen op de volgende dag.

Was elke put met één milliliter PBS en laat de cellen loskomen door 0,5 milliliter 0,25%Trypsin-EDTA-oplossing toe te voegen gedurende ongeveer vijf minuten bij kamertemperatuur. Zodra de cellen loslaten van de schaal, voegt u 0,5 milliliter groeimedium toe en mengt u dit voorzichtig door herhaaldelijk met de pipet op en neer te zuigen. Breng de cellen uit elke put over in een buisje van twee milliliter en pellet deze met behulp van een tafelcentrifuge.

Verwijder voorzichtig het supernatant met een pipette zonder de celpellet te verstoren. Was de cellen door één milliliter ijskoude PBS toe te voegen en de celsuspensie voorzichtig op en neer te pipetteren. Pelleteer de cellen in een tafelcentrifuge.

Verwijder voorzichtig het supernatant door te pipetteren zonder het celpellet los te maken. Voeg 200 µL ijskoud lysisbuffer toe, resuspendeer de cellen door herhaaldelijk te pipetteren en plaats het mengsel vervolgens op ijs. Bescherm het lysaat onmiddellijk tegen licht door de buisjes met aluminiumfolie af te dekken, aangezien het iodoacetamide in de lysisbuffer lichtgevoelig is.

Incubeer 30 minuten op ijs. Het gebruik van iodoacetamide is essentieel omdat iodoacetamide de thiolgroep van vrije cysteïnes irreversibel beschermt door de vorming van een thioetherbinding, waardoor kunstmatige eiwitaggregatie wordt voorkomen. Verwijder vervolgens het celdebris door centrifugatie in een vooraf gekoelde tafelcentrifuge.

Bereid tijdens het centrifugeren dialysekolommen voor met een molecular weight cutoff van 10.000. Bevestig de dialysekolommen aan een drijver en plaats ze in een bekerglas gevuld met vooraf gekoelde dialysebuffer om de kolommen te equilibreren. Raak het membraan niet aan.

Plaats een magneetroerder in een bekerglas en zet het bekerglas in de koelruimte. Gebruik de magneetroerder om voor voorzichtig roeren te zorgen en laat het geheel 20 minuten equilibreren bij vier graden Celsius. Verwijder na 20 minuten de kolommen uit de dialysebuffer en de drijver.

Breng de geklaarde lysaten over naar de voorbereide dialysekolommen door te pipetteren zonder het membraan aan te raken. Bevestig de kolommen aan een drijver. Plaats ze terug in het bekerglas gevuld met dialysebuffer en breng het bekerglas vervolgens naar de koudekamer.

Dialyseer het lysaat gedurende ten minste vier uur bij vier graden Celsius onder voorzichtig roeren met een magnetische roerder om kleine metabolieten en zouten te verwijderen die de niet-denaturerende polyacrylamidegelelektroforese kunnen beïnvloeden. Wanneer de dialyse voltooid is, brengt u elk gedialyseerd monster over in een buisje van 1,5 milliliter. Verwijder neerslagen door centrifugatie in een tafelcentrifuge.

Elektroforese moet onmiddellijk na dialyse van de lysaten worden uitgevoerd om dissociatie van de oligomere eiwitcomplexen te voorkomen. Vul de binnenste en buitenste gelkamer met vooraf gekoelde runningbuffer. Voer een pre-run uit van de niet-denaturerende polyacrylamidegel met vooraf gekoelde runningbuffer bij 25 milliampère per gel gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.

Meng 15 µL van het geprepareerde lysaat met vijf µL 4X monsterbuffer. Laad een native eiwitstandaard naar keuze en 15 µL monster op de gel. Laat de gel vier uur lopen bij 25 mA en 4 °C.

Wanneer de niet-denaturerende polyacrylamidegelelektroforese is voltooid, wordt de gel gedemonteerd en voorzichtig overgebracht naar SDS-buffer. Incubeer dit gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder matige schudding. Bereid per gel twee sponsjes, vier vellen cellulosefilterpapier en een blottingmembraan voor en week deze in blottingbuffer.

Stel de sandwich als volgt samen, van onder naar boven: één spons, twee vellen cellulose filterpapier, een blottingmembraan, de gel, twee vellen cellulose filterpapier en één spons. Plaats de sandwich in de blottingtank, waarbij u erop let dat het membraan naar de pluspool is gericht en de gel naar de minpool.

Vul het blottingtank met vooraf gekoelde blottingbuffer. Voor de beste resultaten bij de proteïneoverdracht wordt de blotting gedurende de nacht uitgevoerd bij 90 milliampère op vier graden Celsius. Haal de sandwich de volgende dag uit elkaar.

Incubeer het membraan vijf minuten bij kamertemperatuur in Ponceau S-oplossing om de eiwitstandaard te visualiseren. Ontkleur het membraan door het in gedeïoniseerd water te plaatsen en te wassen. Markeer na het overbrengen van het membraan naar een tray de banden van de eiwitstandaard met een pen.

Blokkeer het membraan met blokkeringsbuffer gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur of overnight bij vier graden Celsius. Vervolgens worden de eiwitten van belang gevisualiseerd via immunokleuring met gebruik van een konijnen polyklonaal antilichaam gericht tegen MxA, zoals beschreven in het tekstprotocol. Virocellen die geen endogeen MxA bevatten, werden getransfecteerd met recombinant wild-type MxA en monomerische en dimerische MxA-varianten.

De migratie van de recombinante MxA-varianten op hun verwachte moleculaire gewicht bevestigde hun oligomere toestand. Het ectopisch tot expressie gebrachte wild-type MxA migreerde als een tetrameer. Deze recombinante eiwitten werden vervolgens gebruikt om de oligomere toestand van endogeen menselijk MxA-eiwit te beoordelen, afgeleid van interferon-alfa-gestimuleerde A549-cellen.

Het resultaat toonde aan dat de grootte van MxA in lysaten van interferon-alfa gestimuleerde A549-cellen overeenkomt met een tetrameer. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in anderhalf dag worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de monsters gedurende het gehele proces niet bevroren en ontdooid mogen worden, aangezien dit proteïne-interacties kan vernietigen of proteïne-aggregaties kan veroorzaken.

Daarnaast is het bij het werken met lichtgevoelige reagentia, zoals iodoacetamide, belangrijk om de monsters tijdens de lysestap tegen licht te beschermen. Na de niet-denaturerende SDS-PAGE kunnen andere methoden, zoals eiwitextractie uit gels en enzymatische activiteitsanalyse of een tweedimensionale PAGE, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de enzymatische activiteit en de karakterisering van potentiële hetero-oligomere complexen. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de celbiologie om de samenstelling van oligomere eiwitcomplexen in gekweekte cellen te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het prepareren van cellysaten uit celculturen voor het bestuderen van oligomere eiwitten in een niet-denaturerende PAGE-analyse. Vergeet niet dat het werken met iodoacetamide extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen en oogbescherming, altijd moeten worden getroffen.