Name: Karakterisering van Multi-subunit eiwitcomplexen of Human MxA het gebruik van niet-denaturerende Polyacrylamide Gel-elektroforese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Leer de oligomere status van MxA-eiwitten analyseren in cellysaten met niet-denaturerende PAGE en western blot. Deze methode vereist geen zuivering en is toegankelijk voor de meeste laboratoria.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de Swiss National Science Foundation (subsidie nr. 31003A_143834) aan JP.

Opmerking: Dit protocol is gebaseerd op de eerder gepubliceerde niet-denaturerende PAGE 12 protocol. In deze studie, de oligomere status van de MxA eiwit werd bepaald met behulp van Vero-cellen tot overexpressie MxA of IFN-α-gestimuleerde A549 cellen die endogene MxA. De hieronder beschreven protocol kan worden gebruikt om de oligomere status van elke proteïne geanalyseerd naast MxA. Echter, kan verdere optimalisatie nodig. 1. Bereiding van cellysaat voor niet-denaturerende PAGE OPMERKING: Om de oligomere toestand van de menselijke MxA eiwit te analyseren in een van beide Vero of A549-cellen werden 1,0 x 10 6 cellen geoogst. Afhankelijk van het celtype en de overvloed van het eiwit te analyseren, moet het aantal cellen worden ingesteld. Het is ook belangrijk om de lysisbuffer beschermen tegen blootstelling aan licht, zodra het lichtgevoelige joodaceetamide toegevoegd. <ol><li> Seed 0,3 x 10 6 A549 of Vero-cellen per putje intot 6 goed gerechten. Houd de cellen in 2 ml kweekmedium per putje (zie tabel 1). Incubeer cellen &#39;s nachts in een celkweek incubator (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Oogst de cellen door wassen met 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en losmaken door toevoeging van 0,5 ml van 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) 1x oplossing gedurende ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Zodra de cellen los van de schotel, voeg 0,5 ml groeimedium en meng voorzichtig door en neer te pipetteren. </li><li> Breng de cellen van elk putje in een 2 ml buisje en pelleteren ze met een tafelblad centrifuge (5000 xg, 4 ° C, 5 min). </li><li> Verwijder voorzichtig het supernatant door pipetteren zonder verstoring van de cel pellet. </li><li> Was de cellen met 1 ml ijskoude PBS door voorzichtig pipetteren de celsuspensie op en neer. </li><li> Pellet cellen in een tafelblad centrifuge (5000 xg, 4 ° C, 5 min). </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig door pipetteren without losmaken van de celpellet. </li><li> Resuspendeer cellen in 200 ul ijskoude lysisbuffer (zie tabel 1) door en neer te pipetteren en op ijs gezet. </li><li> Onmiddellijk beschermen lysaat van licht door het bedekken van de buizen met behulp van aluminiumfolie en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. OPMERKING: Na incubatie gedurende 30 min op ijs, is het niet langer noodzakelijk om het lysaat te beschermen tegen blootstelling aan licht, omdat de bescherming van de vrije thiolgroepen onomkeerbaar. </li><li> Verwijderen celresten door centrifugeren in een voorgekoeld tafelblad centrifuge (13.000 xg, 4 ° C, 20 min). </li><li> Equilibreren dialyse kolommen in dialysebuffer (Tabel 1) in de koude kamer bij 4 ° C gedurende 20 min in de centrifugatiestap. Gebruik een kolom met een molecuulgewicht cut off van 10.000. <ol><li> Bevestig de kolommen een float boei en ze in een beker gevuld met dialysebuffer. Om voorzichtig roeren te waarborgen, gebruik een magnetische roerder. Raak de membraan niet aan. LET OP: Dialyswordt kolommen kunnen worden gekocht of bereid uit 1,5 ml buizen volgens de werkwijze beschreven door Fiala en medewerkers 19 protocol. </li></ol></li><li> Verwijder de kolommen uit de dialyse buffer en de vlotter boei. Breng de ontruimde lysaten in de voorbereide dialyse kolom door pipetteren zonder het aanraken van het membraan. Bevestig de kolommen aan een vlotter boei en zet ze terug in de beker gevuld met dialyse buffer. </li><li> Dialyseer het lysaat in een bekerglas met ijskoude buffer dialyse (Tabel 1) gedurende ten minste 4 uur (of bij voorkeur overnacht) bij 4 ° C onder voorzichtig roeren met een magneetroerder. Gebruik minimaal 100 ml dialysebuffer een 200 ul lysaat. </li><li> Breng het gedialyseerd monster in een 1,5 ml buis. Verwijderen precipitaten door centrifugeren in een tafelblad centrifuge (13.000 xg, 4 ° C, 20 min). Om de dissociatie van de oligomere eiwitcomplexen verder met het protocol (deel 2) onmiddellijk na de dialyse te voorkomen. Niet bevriezende bereide lysaten. </li></ol> 2. Elektroforese OPMERKING: Elektroforese werd uitgevoerd zoals hiervoor is beschreven met enkele modificaties 22. In de hieronder beschreven protocol werd prefab gradiënt gels gebruikt (4-15% gradiënt). Als alternatief kunnen de gels worden bereid in het laboratorium. Het is zeer belangrijk om denatureringsmiddel priori als SDS aan de dissociatie van de oligomere eiwitcomplexen voorkomen. Tijd van elektroforese werd geoptimaliseerd voor de verschillende oligomere toestanden van het menselijke MxA eiwit. Het kan echter variëren voor andere eiwitten, afhankelijk van de grootte van het oligomere complex en het bereik van de scheiding die verondersteld worden bereikt om het complex te analyseren. Daarom moet het optimale tijdstip van elektroforese empirisch worden bepaald. Voor optimale resolutie van de oligomeren te analyseren moet de huidige maximaal 25 mA. <ol><li> Monteer de niet-denaturerende PAGE gel in de gel kamer. Vul tHij binnenste en buitenste kamer met vooraf gekoelde loopbuffer (tabel 1). </li><li> Voorlooptijd de gel met voorgekoeld loopbuffer bij 25 mA per gel gedurende 15 minuten in de koude kamer bij 4 ° C. </li><li> Meng 15 pl van het hierboven bereide lysaten met 5 ui 4x monsterbuffer (tabel 1). Mis het monster niet koken. </li><li> Laad 15 pl monster en een natief eiwit standaard keuze op de gel. Voer de elektroforese bij 25 mA gedurende 4 uur in de koude kamer bij 4 ° C. OPMERKING: Bij semi-kwantitatieve analyses, een eiwit kwantificering protocol (bijvoorbeeld een Bradford eiwittest 23) kunnen worden uitgevoerd om het laden van gelijke hoeveelheden totaal eiwit per laan waarborgen. </li></ol> 3. Western Blot OPMERKING: Hieronder wordt het protocol van een natte western blot systeem. Elke blotting membraan kan worden gebruikt. Activeren polyvinylideenfluoride (PVDF) membranen in 100% methanol voor equilibratie in blotting buffer. De semi-droge western blot techniek kan ook worden gebruikt, maar moet worden geoptimaliseerd voor grote oligomere complexen. <ol><li> Demonteer de gel voorzichtig deze hoeveelheid in SDS-buffer (Tabel 1). </li><li> Incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur onder zacht schudden. </li><li> Bereid 2 sponzen, 4 cellulose filterpapier lakens en een blotting membraan per gel. Drenken in blotbuffer (tabel 1). </li><li> Monteer de sandwich als volgt (onder naar boven): 1 spons, 2 cellulose filter vellen papier, membraan, gel, 2 cellulose filter vellen papier, 1 spons. </li><li> Doe de sandwich in de blotting tank. Zorg ervoor dat het membraan wordt geconfronteerd met de pluspool, terwijl de gel wordt geconfronteerd met de minpool. </li><li> Vul het blotting tank met voorgekoeld blotting buffer. </li><li> Blot 90 mA overnacht bij 4 ° C voor de beste eiwit overbrenging leidt. </li><li> Demonteer de sandwich en visualiseer het eiwit standaard door incubatie van het membraan in Ponceau S oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Destain het membraan door het zorgvuldig wassen van de Ponceau S met gedemineraliseerd water totdat u duidelijk de banden van het eiwit standaard kunnen zien. </li><li> Markeer de banden van het eiwit standaard met behulp van een pen. LET OP: Resterende Ponceau S kan interfereren met de immunokleuring. Om dit te voorkomen, kan het membraan verder worden ontkleurd door incubatie in 0,1 M NaOH gedurende 1 min en daaropvolgend wassen met gedeïoniseerd water. </li><li> Blokkeer het membraan met een blokkeerbuffer (zie tabel 1) gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. </li><li> Visualiseren eiwit (ten) van belang door immunokleuring met behulp van antilichamen tegen het eiwit te analyseren. OPMERKING: De menselijke MxA eiwit werd gevisualiseerd met behulp van het konijn polyklonaal antilichaam specifiek voor humaan Mx1 verdund 1: 1000 in blockingbuffer (tabel 1). De antilichaamoplossing werd overnacht geïncubeerd bij 4 ° C. Als alternatief, het monoklonale eennti-MxA antilichaam (kloon 143) kan worden gebruikt (gegevens niet getoond) 24. </li></ol>

<ol><li>Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucine+zipper-mediated+homo-oligomerization+regulates+the+Rho-GEF+activity+of+AKAP-Lbc%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc.</a> J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).</li>
<li>Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+cell-cell+adhesion+by+classical+cadherins%3A+Critical+role+for+low-affinity+dimerization+through+beta-strand+swapping%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).</li>
<li>Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+TBP+dimerization+in+preventing+unregulated+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression.</a> Mol Cell. 3, 717-727 (1999).</li>
<li>Torshin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+oligomerization+as+intermediate+level+of+signal+transduction%3A+analysis+of+protein-protein+contacts+and+active+sites+in+several+glycolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes.</a> Front Biosci. 4, 557-570 (1999).</li>
<li>Goodsell, D. S., Olson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+symmetry+and+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Structural symmetry and protein function.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).</li>
<li>Flydal, M. I., Martinez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylalanine+hydroxylase%3A+function%2C+structure%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation.</a> IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).</li>
<li>Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+MxA+protein%3A+an+interferon-induced+dynamin-like+GTPase+with+broad+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity.</a> J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).</li>
<li>Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mx+GTPases%3A+dynamin-like+antiviral+machines+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity.</a> Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).</li>
<li>Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+backfolding+of+the+carboxyl-terminal+end+of+MxA+protein+is+a+prerequisite+for+its+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization.</a> J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).</li>
<li>Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomeric+GTPase-negative+MxA+mutant+with+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity.</a> J Virol. 74, 8202-8206 (2000).</li>
<li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+myxovirus+resistance+protein+a+reveals+intra-+and+intermolecular+domain+interactions+required+for+the+antiviral+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function.</a> Immunity. 35, 514-525 (2011).</li>
<li>Nigg, P. E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+and+GTP-binding+Requirements+of+MxA+for+Viral+Target+Recognition+and+Antiviral+Activity+against+Influenza+A+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus.</a> J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).</li>
<li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+oligomerization+in+the+stalk+region+of+dynamin-like+MxA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA.</a> Nature. 465, 502-506 (2010).</li>
<li>Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiparallel+leucine+zipper-directed+protein+reassembly%3A+Application+to+the+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein.</a> J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).</li>
<li>Patching, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+spectroscopy+for+characterisation+of+membrane+protein-ligand+interactions+and+its+potential+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery.</a> Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).</li>
<li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li>
<li>Wyatt, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Scattering+and+the+Absolute+Characterization+of+Macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules.</a> Analytica Chimica Acta. 272 (93), 1-40 (1993).</li>
<li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+for+the+study+of+protein+association+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly.</a> Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+APAF-1.cytochrome+c+multimeric+complex+is+a+functional+apoptosome+that+activates+procaspase-9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9.</a> J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondenaturing+polyacrylamide+gel+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins.</a> Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).</li>
<li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein.</a> Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li>
<li>Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-induced+antiviral+protein+MxA+interacts+with+the+cellular+RNA+helicases+UAP56+and+URH49%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49.</a> J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).</li>
<li>Stertz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-induced%2C+antiviral+human+MxA+protein+localizes+to+a+distinct+subcompartment+of+the+smooth+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum.</a> J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).</li>
<li>Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+human+MxA+GTPase+into+highly+ordered+dynamin-like+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers.</a> J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).</li>
<li>Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP-bound+human+MxA+protein+interacts+with+the+nucleocapsids+of+Thogoto+virus+%28Orthomyxoviridae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae).</a> J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).</li>
<li>Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missorting+of+LaCrosse+virus+nucleocapsid+protein+by+the+interferon-induced+MxA+GTPase+involves+smooth+ER+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes.</a> Traffic. 5, 772-784 (2004).</li>
<li>Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+RNA+helicase+UAP56+is+required+for+prevention+of+double-stranded+RNA+formation+during+influenza+A+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection.</a> J Virol. 85, 8646-8655 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een eenvoudige methode die de snelle bepaling van de oligomere toestand van eiwitten in zoogdiercellen tot expressie gebracht door niet-denaturerende PAGE gevolgd door Western blot analyse. Het grote voordeel van deze aanpak is dat de oligomere status van een bepaald eiwit kan worden bepaald uit gehele cellysaten zonder voorafgaande eiwitzuivering. Dit kan belangrijk zijn voor eiwitten die oligomeriseren of hun functie in associatie uitoefenen met aanvullende factoren. Bovendien zijn de eiwitten nog ...

De quaternaire structuur van een eiwit speelt een cruciale rol in vele cellulaire processen. Signaalwegen, genexpressie en enzymactivering / deactivering allemaal afhankelijk van de juiste montage van eiwitcomplexen 1-4. Dit proces ook bekend als homo- of hetero-oligomerisatie wordt veroorzaakt door irreversibele covalente of omkeerbare elektrostatische en hydrofobe eiwit-eiwit interacties. Oligomerisatie diversifieert niet alleen de verschillende cellulaire processen zonder genoomgrootte verhogen, maar ook een strategie voor eiwitten stabiele complexen die resistenter voor denaturatie en degradatie 5 zijn gebouwd. Defecten in oligomerisatie van invloed op de functie van eiwitten en kan leiden tot de ontwikkeling van ziekten. Bijvoorbeeld het enzym fenylalanine hydroxylase vormt een tetrameer complex. Sommige mutaties in het eiwitcomplex de vorming tetrameer verzwakken en leiden tot de ziekte fenylketonurie 6. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; De menselijke MxA eiwit een interferon (IFN) geïnduceerde antivirale effectoreiwit uitoefenen van een brede antivirale activiteit tegen verschillende RNA en DNA-virussen 7. Het behoort tot de superfamilie van dynamin-achtige GTPases groot en heeft de capaciteit om grote oligomere structuren in vitro 8. Oligomerisatie is voorgesteld om MxA te beschermen tegen snelle afbraak 9,10. Ondanks intensieve inspanningen van vele onderzoeksgroepen, de moleculaire werkingsmechanisme blijft grotendeels ongrijpbaar en de rol van de oligomerisatie toestand van MxA voor zijn antivirale functie is onder debat 9,11,12. In dit verband, Gao en medewerkers voorgesteld een model waarbij MxA oefent zijn antivirale activiteit door interactie met virale kerneiwitten in vorm van grote ringachtige oligomere structuren 11. Echter, meer recentelijk, hebben we aangetoond dat MxA dimeren vertonen antivirale werking en interactie met het nucleoproteïne van influenza A virus 12. Based op de kristalstructuur van MxA, Gao en collega&#39;s identificeerden verschillende aminozuurresten in de grensvlakgebieden die essentieel zijn voor de oligomerisatie in vitro en zijn antivirale werking 11,13 zijn. Teneinde op te helderen die oligomere toestand van MxA antivirale activiteit uitoefent, zochten wij een eenvoudig protocol om de oligmeric staat MxA interface-mutanten tot expressie gebracht in humane cellen als endogeen MxA uitgedrukt IFNa na stimulatie snel vast te stellen. Hoewel er vele technieken die gewoonlijk worden gebruikt om de interactie tussen eiwitten bestuderen die de split-Green Fluorescent Protein (split-GFP) complementatie bepaling 14, oppervlak plasmon resonantie 15 en Förster resonantie energieoverdracht (FRET) 16, ze geen informatie over de exacte stoichiometrie van een oligomeer eiwitcomplex. Voor het onderzoek van dit aspect technieken zoalsmulti-angle lichtverstrooiing (Mals) 17 en analytische ultracentrifugatie 18 zijn zeer nuttig. Gewoonlijk zijn de eiwitten geanalyseerd met behulp van deze werkwijzen gezuiverde eiwitten. Oligomerisatie processen kunnen ook afhangen van andere cellulaire factoren. Als deze factoren zijn bekend, de analyse bemoeilijkt. Bovendien hebben sommige eiwitten moeilijk in E. coli en te zuiveren. Daarom zijn deze werkwijzen niet de optimale keuze eiwit oligomerisatie analyseren de cellulaire omgeving. Bovendien zijn deze technieken vereisen dure instrumenten die niet gemakkelijk beschikbaar zijn. Niet-denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE), grootte-uitsluitingschromatografie of chemische verknoping gevolgd door gebruikelijke natrium dodecylsulfaat (SDS) -PAGE zijn nuttige hulpmiddelen voor het karakteriseren van de vorming van oligomeren van cellysaten 2,19,20. Deze methoden vereisen geen gespecialiseerde apparatuur en kan gemakkelijk worden performed in een standaard laboratorium. We eerst geëvalueerd verschillende chemische verknoping protocollen die invariant tot aspecifieke aggregatie en precipitatie van MxA. Daarom hebben we de volgende geteste niet-denaturerende PAGE protocollen. Als niet-denaturerende PAGE gebruik van SDS uitsluit, de migratie van eiwitten afhankelijk van hun oorspronkelijke lading. Blauw-natieve PAGE gebruikt Coomassie brilliant blue G250 eiwitten met een totale negatieve lading, vergelijkbaar met SDS laden, maar niet het eiwit 21 denatureren. Helaas, Coomassie Brilliant blauw precipitaat in aanwezigheid van hoge zouten en tweewaardige kationen (bijvoorbeeld Mg 2+) die vaak in lysis buffers. Afhankelijk van de gebruikte buffers, kan het moeilijk zijn om het monster zonder verdere optimalisering van stappen die een effect op het oligomeer eiwitcomplex konden analyseren. Hier presenteren we een eenvoudig protocol op basis van een eerder gepubliceerde werkwijze 22 voor oligomerisatie van bepalenhuman MxA eiwit afkomstig van cellysaten met behulp van niet-denaturerende PAGE.

<table><tbody><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69570</td><td>Voorbereiden in dialysebuffer (indien glycerolverwijdering gewenst is) Kan zelf worden gemaakt volgens Fiala et al. 2011</td></tr><tr><td>4&ndash;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well,</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1083</td><td>Vooraf draaien in uitloopbuffer om buffersysteem aan te passen</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-vrij</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11836170001</td><td>Gebruik 1 tablet per 50 ml</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4&nbsp; fles van 500 ml Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S-oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td>TOXISCH draag handschoenen en bescherm ogen</td></tr><tr><td>NativeMark Unstained Protein Standard&nbsp; 50 &micro;l</td><td>Invitrogen</td><td>P/N 57030</td><td>Laad 5 &micro;l/putje</td></tr><tr><td>A549 cellen</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL185</td><td>Laten groeien in groeimedium (zie Tabel 1)</td></tr><tr><td>Vero cellen</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL81</td><td>Laten groeien in groeimedium (zie Tabel 1)</td></tr><tr><td>anti-Mx1-antilichaam</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00004599_D01P</td><td>Gebruik bij een 1:1.000 verdunning</td></tr><tr><td>ECL Anti-konijn IgG, met paardenradijsperoxidase gekoppeld vol antilichaam (van ezel)</td><td>GE-Healthcare</td><td>NA934V</td><td>Gebruik bij een 1:10.000 verdunning</td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA (1x)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Life Technologies</td><td>Thermo Fisher</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamid&nbsp;&nbsp; 5 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6125</td><td>voorraad&nbsp; 100 mM</td></tr><tr><td>Broomfenolblauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyrovaat life technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Pen&nbsp; Strep 100 x&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 100ml&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; life technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140 - 130</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x Stock, 100 ml&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; life technologies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>350500-038</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum, gedialyseerd, VS-oorsprong 500 ml Gibco Lot:42G9552K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose filterpapier</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>PVDF blotting&nbsp; membraan</td><td>GE-Healthcare</td><td>10600022</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethaan</td><td>Biosolve</td><td>0020092391BS</td><td></td></tr><tr><td>natriumfluoride (NaF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-7920</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492015</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-vrij</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Calbiochem</td><td>6555204</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS 10% oplossing</td><td>Amresco</td><td>N907</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Biosolve</td><td>0007132391BS</td><td></td></tr><tr><td>natriumorthovanadate (Na3VO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-Glycerofosfaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Melkpoeder</td><td>Migros/Zwitserland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Millipore</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>natriumchloride (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>magnesiumchloride (MgCl2)</td><td>Amresco</td><td>288</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>natriumhydroxide (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-8045</td><td></td></tr></tbody></table>

karakterisering van multi-subunit eiwitcomplexen of human mxa het gebruik van niet-denaturerende polyacrylamide gel-elektroforese

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

De vorming van oligomere complexen is een cruciale voorwaarde voor de juiste structuur en functie van veel eiwitten. Het interferon-geïnduceerde antivirale effectoreiwit MxA oefent een breed antiviraal effect uit tegen veel virussen. MxA is een dynamin-achtig GTPase en heeft de capaciteit om oligomere structuren van hogere orde te vormen. Ofwel, of oligomerisatie van MxA noodzakelijk is voor zijn antiviraal effect is een discussiepunt. We beschrijven hier een eenvoudig protocol om de oligomere toestand van endogene of ectopisch geëxprimeerde MxA in de cytoplasmatische fractie van menselijke cellijnen te beoordelen door niet-denaturerende polyacrylamide-gelelektroforese (PAGE) in combinatie met Western blot-analyse. Een kritieke stap van het protocol is de keuze van detergenten om aggregatie en/of precipitatie van eiwitten te voorkomen, met name geassocieerd met cellulaire membranen zoals MxA, zonder de enzymatische activiteit ervan te verstoren. Een andere cruciale aspect van het protocol is de onomkeerbare bescherming van de vrije thiolgroepen van cysteïneresiduen door iodoacetamide om kunstmatige interacties van het eiwit te voorkomen. Dit protocol is geschikt voor een eenvoudige beoordeling van de oligomere toestand van MxA en biedt bovendien de mogelijkheid voor een directe correlatie van de antiviraal activiteit van MxA-interfacemutanten met hun respectieve oligomere toestanden.

Het gebruik van niet-denaturerende PAGE, analyseerden we de oligomere toestand van het humane wildtype MxA, de dimere interface-mutanten MxA (R640A) en MxA (L617D) en de monomere-interface mutant MxA (M527D) vanaf 12 cellysaten. Cellen werden gelyseerd in een buffer die 1% octylfenoxypolyethoxyethanol (NP-40) en joodacetamide om eiwitten oplosbaar en bescherming van de vrije thiolgroepen te verzekeren (zie figuur 1). Zoals eerder beschreven, werden zout en kleine metabolieten verwijderd door ...

Dit artikel beschrijft een eenvoudig en snel protocol om de oligomere toestand van het dynamin-achtige GTPase MxA-eiwit uit lysaten van menselijke cellen te evalueren met behulp van een combinatie van niet-denaturerende PAGE met western blot-analyse.

Karakterisering van Multi-subunit eiwitcomplexen of Human MxA het gebruik van niet-denaturerende Polyacrylamide Gel-elektroforese

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Het algemene doel van dit experiment is om het aantal subunits in homooligomere proteïnecomplexen in cellysaten te bepalen met behulp van niet-denaturerende natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de celbiologie, zoals de oligomere status van proteïnen die betrokken zijn bij fundamentele cellulaire processen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat zuivering van de homooligomere proteïnecomplexen of gespecialiseerde, dure apparatuur niet vereist is.Daarom kan deze methode in de meeste laboratoria worden uitgevoerd. In dit experiment worden twee typen cellen gebruikt: A549-cellen die endogeen Myxovirus resistance A-eiwit, of MxA, tot expressie brengen, en virocellen die MxA overexpresseren.Zaai de A549-cellen en virocellen uit in platen met zes putjes, met twee milliliters groeimedium per putje. Incubeer de cellen gedurende de nacht in een celkweekincubator. Oogst de cellen op de volgende dag.Was elke put met één milliliter PBS en laat de cellen loskomen door 0,5 milliliter 0,25%Trypsin-EDTA-oplossing toe te voegen gedurende ongeveer vijf minuten bij kamertemperatuur. Zodra de celle

characterization-multi-subunit-protein-complexes-human-mxa-using-non

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In deze video, beschrijven we de karakterisering van multiprotein complexen (MPL), door blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-PAGE). In een eerste dimensie, worden gedialyseerd cellulaire lysaten gescheiden door BN-PAGE om individuele Mediterrane partnerlanden te identificeren. In een tweede dimensie SDS-PAGE, zijn mediterrane partnerlanden van belang verder onderverdeeld naar hun kiezers te analyseren door immunoblotting.

Blauwe Inheemse polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) voor de Analyse van multiprotein complexen van Cellular Lysaten

This video demonstrates a denaturing polyacrylamide-based separation technique for proteins. This technique helps in the preliminary identification of proteins based on their molecular weights.

Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis for Protein Analysis: A Technique to Separate and Visualize Proteins Based on Molecular Weight

This video describes multimeric PAGE for separating native protein complexes from tissue homogenates. The technique is a hybrid of blue native-PAGE and SDS-PAGE techniques. The separated complexes can be characterized and studied for their role in cell functioning.

Multimer-PAGE for Separating Native Protein Complexes: A Hybrid Separation Technique Consisting of Blue Native-PAGE and SDS-PAGE to Separate Intact Multimeric Proteins From Tissue Lysate

In this video, we demonstrate a two-dimensional gel electrophoresis method that separates individual proteins from a complex protein mixture obtained from tumor tissues of human nonfunctional pituitary adenoma (NFPA). The proteins are separated based on their electric charge in the first dimension and further separated based on molecular weights in the second dimension.

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

Mucinen zijn glycoconjugaten met een hoog molecuulgewicht, met een grootte variërend van 0,2 tot 200 megadalton (MDa). Als gevolg van hun grootte dringen mucinen niet door conventionele polyacrylamide gels en hebben ze grotere poriën nodig voor scheiding. We bieden een gedetailleerd protocol voor mucine agarose gel elektroforese om relatieve kwantificering te beoordelen en polymeerassemblage te bestuderen.

Mucine agarosegelelektroforese: Western blotting voor hoge molecuulgewicht glycoproteïnen

Oligomerisatie van de ryanodine receptor, een homo-tetramer ionkanaal dat Ca2+ vrijmaakt uit intracellulaire opslag, is cruciaal voor skeletspier- en hartspiercontractie. Hier presenteren we complementaire in vivo en in vitro methoden om eiwit-zelfassociatie te detecteren en homo-oligomeer stoichiometrie te bepalen.

Genetische en biochemische benaderingen voor<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; In Vitro</em&gt; Evaluatie van Protein Oligomerisatie: De ryanodinereceptor Case Study

Een werkwijze voor het stabiliseren en scheiden van natieve eiwitcomplexen van ongewijzigd weefsellysaat onder toepassing van een amino-reactieve eiwit-crosslinker gekoppeld aan een nieuw tweedimensionaal polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) systeem wordt gepresenteerd.

Multimeer-PAGE: Een methode voor het vastleggen en oplossen eiwitcomplexen Biological Samples

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Dit protocol beschrijft de scheiding van functionele mitochondriale elektronen transportketen complexen (Cx) IV en supercomplexen daarvan door gebruik te maken van natieve elektroforese om informatie over hun montage en structuur te onthullen. De inheemse gel kan onderworpen worden aan immunoblotting, in-gel assays, en zuivering door elektroelutie om individuele complexen verder te karakteriseren.

Analyse van supercomplexen van de Mitochondrial Electron Transport Chain met Native Electrophoresis, In-gel Assays, en Electroelution

Een protocol voor het ontrafelen van plant thylakoïde eiwit complexe organisatie en samenstelling met blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-pagina) en 2D-SDS-pagina wordt beschreven. Het protocol is geoptimaliseerd voor Arabidopsis thaliana, maar kan worden gebruikt voor andere plantensoorten met kleine wijzigingen.

Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Dit protocol beschrijft de combinatie van grootte uitsluiting chromatografie met multi-angle lichtverstrooiing (SEC-MALS) voor absolute karakterisering van eiwitten en complexen in oplossing. SEC-MALS bepaalt het molecuulgewicht en de grootte van zuivere eiwitten, native oligomeren, heterocomplexes en gemodificeerde eiwitten zoals glycoproteïnen.

Karakterisering van eiwitten door grootte-uitsluiting chromatografie gekoppeld aan multi-angle lichtverstrooiing (SEC-MALS)

Leer de oligomere status van MxA-eiwitten analyseren in cellysaten met niet-denaturerende PAGE en western blot. Deze methode vereist geen zuivering en is toegankelijk voor de meeste laboratoria.

Karakterisering van Multi-subunit eiwitcomplexen of Human MxA het gebruik van niet-denaturerende Polyacrylamide Gel-elektroforese (Video) | JoVE Journal

Karakterisering van Multi-subunit eiwitcomplexen of Human MxA het gebruik van niet-denaturerende Polyacrylamide Gel-elektroforese

Meer video's verkennen