Karakterisering van Multi-subunit eiwitcomplexen of Human MxA het gebruik van niet-denaturerende Polyacrylamide Gel-elektroforese
October 28th, 2016
Dit artikel beschrijft een eenvoudig en snel protocol om de oligomere toestand van het dynamin-achtige GTPase MxA-eiwit uit lysaten van menselijke cellen te evalueren met behulp van een combinatie van niet-denaturerende PAGE met western blot-analyse.
Het algemene doel van dit experiment is om het aantal subeenheden in homooligomere eiwitcomplexen in celafbraaksels te bepalen met behulp van niet-denaturerende natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van celbiologie, zoals de oligomere status van eiwitten die betrokken zijn bij fundamentele cellulaire processen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het geen zuivering van de homooligomere eiwitcomplexen of gespecialiseerde, dure apparatuur vereist.
Daarom kan het in de meeste laboratoria worden uitgevoerd. Dit experiment maakt gebruik van twee soorten cellen. A549-cellen die endogene Myxovirus-resistentie A-eiwit, of MxA; en virocellen die MxA overexpresseren.
Zaai de A549-cellen en virocellen in zes putjes met twee milliliter groeimedium per putje. Incubeer de cellen een nacht in een celkweekincubator. De volgende dag oogst je de cellen.
Was elke put met één milliliter PBS en bevestig de cellen door 0,5 milliliter van een 0,25% Trypsin-EDTA-oplossing toe te voegen gedurende ongeveer vijf minuten op kamertemperatuur. Zodra de cellen loskomen van de schotel, voeg je 0,5 milliliter groeimedium toe en meng je voorzichtig door op en neer te pipetten. Breng de cellen van elke put over in een tweede milliliter buis en pelleteer ze met behulp van een tafelcentrifuge.
Verwijder voorzichtig het supernatant door te pipetteren zonder de celpellet te verstoren. Was de cellen door één milliliter ijskoud PBS toe te voegen en voorzichtig de celsuspensie op en neer te pipetteren. Pelleteer de cellen in een tafelcentrifuge.
Verwijder voorzichtig het supernatant door te pipetteren zonder de celpellet los te maken. Voeg 200 microliter ijskoud lyseerbuffer toe, resuspendeer de cellen door op en neer te pipetteren en plaats ze vervolgens op ijs. Bescherm het lysaal onmiddellijk tegen licht door de buisjes af te dekken met tinfolie omdat het iodiacetaamid in de lyseerbuffer lichtgevoelig is.
Incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Het gebruik van iodiacetaamid is cruciaal omdat iodiacetaamid de thiolgroep van vrije cysteïnen onomkeerbaar beschermt door een thioetherbinding te vormen en kunstmatige eiwitaggregatie voorkomt. Verwijder vervolgens celdebris door centrifugatie in een voorgekoelde tafelcentrifuge.
Tijdens de centrifugatie, bereid dialysekolommen voor met een molecuulgewicht van 10.000. Bevestig de dialysekolommen aan een vlotter en plaats ze in een beker gevuld met voorgekoelde dialysebuffer om de kolommen te gelijken. Raak het membraan niet aan.
Plaats een magnetische roerder in een beker en breng de beker over in de koude kamer. Gebruik de magnetische roerder om zachtjes te roeren, gelijken gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder na 20 minuten de kolommen uit de dialysebuffer en de vlotter.
Breng de opgehelderde lysaten over in de voorbereide dialysekolommen door te pipetteren zonder het membraan aan te raken. Bevestig de kolommen aan een vlotter. Leg ze terug in de beker gevuld met dialysebuffer en breng vervolgens de beker over naar de koude kamer.
Dialyseer het lysaal gedurende ten minste vier uur bij vier graden Celsius terwijl je voorzichtig roert met een magnetische roerder om kleine metabolieten en zouten te verwijderen die de niet-denaturerende polyacrylamidegel-elektroforese zouden kunnen verstoren. Wanneer de dialyse voltooid is, breng je elk gedialyseerde monster over in een 1,5 milliliterbuisje. Verwijder neerslag door centrifugatie in een tafelcentrifuge.
Elektroforese moet onmiddellijk na dialyse van de lysaten worden uitgevoerd om de dissociatie van de oligomere eiwitcomplexen te voorkomen. Vul de binnen- en buitenste gelkamer met voorgekoelde lopende buffer. Laat de niet-denaturerende polyacrylamidegel 15 minuten lopen bij 25 milliampère per gel met voorgekoelde lopende buffer bij vier graden Celsius.
Meng 15 microliter van het bereide lysaal met vijf microliter 4X monsterbuffer. Laad een natuurlijk eiwitstandaard naar keuze en 15 microliter monster op de gel. Laat de gel 25 milliampère gedurende vier uur bij vier graden Celsius lopen.
Wanneer de niet-denaturerende polyacrylamidegelelektroforese voltooid is, demonteer de gel en breng hem voorzichtig over in SDS-buffer. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden. Bereid twee sponzen, vier cellulosefilterpapiervellen en een blottingmembraan per gel voor en week ze in blottingbuffer.
Monteer de sandwich als volgt van onder naar boven. Eén spons, twee cellulosefilterpapiervellen, een blottingmembraan, de gel, twee cellulosefilterpapiervellen en één spons. Plaats de sandwich in de blottingtank, zorg ervoor dat het membraan naar de pluspool kijkt, terwijl de gel naar de minpool kijkt.
Vul de blottingtank met voorgekoelde blottingbuffer. Voor de beste eiwitoverdrachtsresultaten, blotten bij 90 milliampère gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Demonteer de sandwich de volgende dag.
Incubeer het membraan gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in Ponceau S-oplossing om de eiwitstandaard te visualiseren. Ontkleuren het membraan door het in gedeïoniseerd water te plaatsen en te wassen. Nadat het membraan in een schaal is geplaatst, markeer de banden van de eiwitstandaard met een pen.
Blokkeer het membraan met blokkeerbuffer gedurende ten minste een uur bij kamertemperatuur of een nacht bij vier graden Celsius. Vervolgens worden de eiwitten van belang gevisualiseerd door immunokleuring met behulp van een konijnenpolyklonaal antilichaam gericht tegen MxA zoals beschreven in het tekstprotocol. Virocellen die endogene MxA missen, werden getransfecteerd met recombinant wildtype MxA en monomere en dimere MxA-varianten.
De migratie van de recombinante MxA-varianten op hun verwachte molecuulgewicht bevestigde hun oligomere toestand. Het ectoopisch tot expressie gebrachte wildtype MxA migreerde als een tetrameer. Deze recombinante eiwitten werden vervolgens gebruikt om de oligomere toestand van endogene menselijke MxA-eiwitten afkomstig van interferon-alfa gestimuleerde A549-cellen te beoordelen.
Het resultaat toonde aan dat de grootte van MxA in lysaten van
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een snel protocol om de oligomere toestand van het MxA-eiwit te evalueren met behulp van niet-denaturerende PAGE en western blot-analyse. Deze methode is toepasbaar op cel lysaten van menselijke cellen.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Eiwitanalyse
- Biochemie
Achtergrond
- Het begrijpen van de oligomere toestand van eiwitten is cruciaal in de celbiologie.
- Homo-oligomere eiwitcomplexen spelen een belangrijke rol in cellulaire processen.
- Traditionele methoden vereisen vaak eiwitzuivering, wat bewerkelijk kan zijn.
- Dit protocol maakt analyse direct vanuit cel lysaten mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om het aantal subeenheden in homo-oligomere eiwitcomplexen te bepalen.
- Om de oligomere status van MxA-eiwit in verschillende celtypen te evalueren.
- Om een eenvoudige methode te bieden die toegankelijk is voor de meeste laboratoria.
Gebruikte methoden
- Niet-denaturerende natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide-gelelektroforese (PAGE).
- Western blot-analyse voor eiwitdetectie.
- Gebruik van A549-cellen en virocellen voor MxA-expressieanalyse.
- Analyse van cel lysaten zonder de noodzaak van zuivering.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle evaluatie van de oligomere toestand van MxA uit cel lysaten.
- De haalbaarheid van de methode in standaard laboratoriumomstandigheden aangetoond.
- Inzichten geboden in de rol van het eiwit in cellulaire processen.
- De voordelen van niet-zuiveringstechnieken benadrukt.
Conclusies
- Het protocol is effectief voor het analyseren van eiwit-oligomerisatie.
- Het kan worden gebruikt in verschillende onderzoekscontexten binnen de celbiologie.
- Deze methode verbetert de toegankelijkheid voor onderzoekers die eiwitcomplexen bestuderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Assessing the oligomeric state of antiviral proteins like MxA directly from cell lysates enables mechanistic de-risking of target hypotheses in early discovery. This non-denaturing PAGE approach supports target validation by linking functional oligomeric forms to antiviral activity without requiring protein purification. The method provides a scalable, reproducible readout for evaluating mutant phenotypes in a disease-relevant system, informing lead identification and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating MxA oligomeric states with antiviral function.
- Operational Value: Enables functional target validation using endogenous or ectopic expression in human cell lines.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing active oligomeric complexes from inactive monomers or aggregates.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized lysates for downstream screening of MxA modulators or interface mutants.
- Quantitative Output: Generates resolvable oligomeric bands (monomer, dimer, tetramer) for comparative analysis across conditions.
- Reproducibility: Uses dialysis and light-protected lysis to minimize artifactual aggregation, ensuring consistent complex detection.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Evaluates MxA oligomerization in interferon-stimulated A549 cells, a physiologically relevant model of antiviral response.
- Translational Continuity: Links oligomeric state to antiviral phenotype, supporting biomarker-aligned target assessment.
- Preclinical De-risking: Enables structure-function analysis of MxA mutants to guide therapeutic candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, enabling oligomerization assessment after target engagement but before lead optimization, particularly for GTPase-mediated antiviral targets.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about oligomerization-dependent activity without perturbing native complexes.
- Screening: Delivers quantitative electrophoretic readouts to compare wild-type and mutant protein assemblies.
- Analytics: Provides subunit resolution via native PAGE, enabling densitometric comparison of oligomeric populations.
- Translational Research: Connects biochemical state to antiviral function in human cells, supporting target confidence.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other dynamin-like GTPases or oligomeric signaling proteins in antiviral or innate immunity pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by defining the active oligomeric state of MxA.
- Operational Value: Employs standard lab equipment (centrifuge, gel apparatus, blotter) avoiding specialized infrastructure.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by validating whether observed antiviral effects correlate with defined oligomeric species.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of MxA-targeted strategies based on oligomerization competence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native PAGE, dialysis, and western blotting to preserve labile complexes.
- Needs pre-chilled buffers, magnetic stirrer, dialysis columns (10 kDa cutoff), and light-protected handling of iodoacetamide.
- Demands standardized lysis and dialysis protocols across teams to prevent variability in oligomer detection.
- Must avoid freeze-thaw cycles and protease activity to maintain complex integrity during sample prep.
- Limited to detecting stable oligomers; transient or weak interactions may require crosslinking or orthogonal validation.
