Name: Visualiseren Stromule Frequency met fluorescentiemicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Leer stromulefrequentie visualiseren in plantencellen met behulp van confocale fluorescentiemicroscopie en geïsoleerde chloroplasten van Nicotiana benthamiana. Deze methode levert reproduceerbare data over chloroplastdynamiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.O.B. en A.M.R. werden ondersteund door predoctorale beurzen van de National Science Foundation.

LET OP: Voor dit protocol, hebben we ons gericht op het testen van stromule frequentie in de epidermis van N. benthamiana bladeren. Diverse stabiele transgene lijnen werden gegenereerd die kunnen worden gebruikt voor dit doel, zoals 35S PRO: FNRtp: EGFP 13 en NRIP1: Cerulean 6. Beide lijnen tonen robuuste expressie van fluoroforen in de chloroplast stroma van bladeren gekweekt onder uiteenlopende omstandigheden. Als alternatief kan-chloroplast gerichte fluoroforen transient worden uitgedrukt in N. benthamiana via Agrobacterium-transformaties 13. Dit is minder dan de ideale transgene lijnen, omdat Agrobacterium infiltraties enkele basale verdediging reacties in N. induceren benthamiana en interacties met Agrobacterium kunnen stromule frequentie veranderen in het blad 14, potentieel complicerende interpretatie van de resultaten. Tenslotte, stromule vorming visualiseren in vitro,chloroplasten kunnen worden geëxtraheerd uit elke plantensoort, met behulp van genetisch gecodeerde fluoroforen of een fluorescerende kleurstof, zoals beschreven in hoofdstuk 5 hieronder. 9,15 LET OP:. Methoden voor het kweken van planten zijn eerder beschreven 16 Kortom, groeien N. benthamiana planten in 4 &quot;potten gevuld met elke professionele bodem mix die een goede drainage biedt. Bedek zaailingen met een doorzichtige plastic koepel voor de eerste 10-14 dagen de tijd om een vochtige omgeving voor het ontkiemen te bieden. In elke standaard meststof mix volgende instructies van de fabrikant om 14- dagen oude planten. Grow planten onder wit licht, met behulp van ~ 100 umol fotonen m -2 sec -1 lichtintensiteit. Waterplanten regelmatig. 1. Voorbereiding Leaf Monsters voor visualisatie LET OP: Stromule dynamiek worden beïnvloed door verwonding 8, dus het prepareren van weefsels onmiddellijk voor het visualiseren van stromule moeten worden uitgevoerds door confocale fluorescentiemicroscopie. Idealiter zou een monster gevisualiseerd met 15 minuten na verwijdering van de plant. <ol><li> Snijd een klein deel van het blad met behulp van een zeer scherp scheermesje. Gebruik altijd hetzelfde gebied van het blad voor de consistentie, en er zeker van op hetzelfde oppervlak (adaxial of abaxiale) in alle experimenten te visualiseren. </li><li> Direct na het snijden het blad gedeelte onderdompelen blad sectie in een 5 ml naaldloze injectiespuit gevuld met water, verwijdert lucht uit de injectiespuit en een vacuüm toepassing voor de spuit opening met een vinger en het trekken van de zuiger. <ol><li> Laat de zuiger voorzichtig om te voorkomen dat schade aan het blad sectie. Herhaal deze twee of drie maal, of tot de meeste van de lucht is verwijderd en het blad lijkt diep groen. OPMERKING: Deze stap verwijdert lucht in het blad die kunnen interfereren met nauwkeurige visualisatie van stromules. </li></ol></li><li> Voeg een druppel water op een dia en plaats het blad sectie over deze daling. Voeg vervolgens een andere Dr.op water naar de top van het blad, en plaats een dekglaasje op het blad. Als er sprake is van luchtbellen, tik dan zachtjes het deksel slip, totdat ze worden verwijderd. De slede is nu klaar voor microscopie en moet onmiddellijk worden gevisualiseerd. </li></ol> 2. Visualiseren Stromules met confocale fluorescentiemicroscopie <ol><li> Met doorvallend licht gericht op een gezichtsveld nabij het midden van het blad sectie (weg van het beschadigd door het scheermesblad cellen). Gebruik een 20X objectief zodat veel chloroplasten gelijktijdig kunnen worden gevisualiseerd. Red een afbeelding met uitgezonden licht, zodat celtypes later kunnen worden onderscheiden, indien nodig. </li><li> Schakel de lichtbron een laser met geschikte excitatie en emissie filters voor de fluorofoor gebruikt. Bijvoorbeeld wekken GFP met een 488 nm laser en laat emissies tussen 500 nm en 525 nm. <ol><li> Met behulp van de microscoop software, selecteert u het GFP-kanaal en klik op de pinhole opening tot 1 Ai passenry unit. Selecteer laser scanning, om te beginnen met het visualiseren van het monster, en klik vervolgens op de GFP-kanaal naar de laser intensiteit en de detector winst voor het laservermogen te minimaliseren, terwijl nog duidelijk visualiseren stromules aan te passen. Zodra deze instellingen zijn vastgesteld, houden ze zo consistent mogelijk in alle experimenten. </li></ol></li><li> Bereid een z -stack experiment dat een serie afbeeldingen verzamelt door het blad epidermis in het gezichtsveld. <ol><li> Voor de z -stack, omvatten alle epidermale chloroplasten in het gezichtsveld vertekening te voorkomen (bijvoorbeeld als chloroplasten nabij het bladoppervlak meer stromules onder geteste omstandigheden). </li><li> Neem beelden op het maximale interval mogelijk dat onder alle stromules maar minimaliseren van de tijd die een z -stack. Als bijvoorbeeld 1 Airy eenheid is gelijk aan een in-focus confocale punt dat 2 urn diep, waarbij een afbeelding om 2 pm is waarschijnlijk ideaal. LET OP: Het blad epidermis een oneffen oppervlak, zodat de totale diepte van de z -stack zal variëren afhankelijk van het monster; z meeste -stacks nodig 10-20 beelden, maar kan meer. </li><li> Pas scansnelheid en beeldresolutie als nodig is om ervoor te zorgen dat de z -stack snel wordt verzameld (meestal binnen 5-10 min, indien mogelijk). Sla de z -stack voor latere analyse. </li></ol></li></ol> 3. Beeldverwerking <ol><li> Bepaal stromule frequentie met behulp van een beeldanalyse-software. Voor dit protocol, raden we u aan ImageJ, dat voor het publiek beschikbaar zijn van de National Institutes of Health (http://imagej.nih.gov/ij/), of de populaire upgrade van ImageJ, Fiji is (http://fiji.sc / Fiji). </li><li> Samenvoegen de z -stack tot één beeld met behulp van de maximale intensiteit projectie in de software. </li><li> Identificeren en handmatig alle chloroplasten in de afbeelding te tellen. </li><li> Per chloroplast visueel vaststellen of één of meer stromulesworden gezien die zich uitstrekt van de chloroplast in beeld de samengevoegde z -stack. Voor voorbeelden, zie figuur 1. Opmerking: omdat de biologische functies van stromules niet bekend, kan elk dun, stroma-gevulde, buisvormig verlengstuk van de chloroplast worden beschouwd als een &quot;stromule&quot;, ongeacht de lengte. Als algemene regel, een stroma-gevulde verlenging van het chloroplast is een stromule indien deze minder dan ongeveer 1 micrometer in diameter langs het grootste deel van zijn lengte 7 is. Zorg ervoor dat één persoon analyseert alle foto&#39;s te controleren voor subjectieve verschillen in het bepalen of een chloroplast heeft een stromule. Een tweede onderzoeker moet onafhankelijk controleren of de stromule frequenties subjectieve vooroordelen verder terug te dringen. </li></ol> 4. experimenteel ontwerp en Sampling OPMERKING: Stromule frequentie sterk uiteen bladeren, maar verschillende rapporten suggereren dat er weinig variatie in stromule frequentie binnen een inddual blad 9,17. <ol><li> Bereken het blad stromule frequentie van een gezichtsveld van een blad. Gooi het blad, en beschouwen dit als een onafhankelijke steekproef. Houden geen rekening met aparte velden van uitzicht vanaf een blad als onafhankelijke steekproeven. LET OP: Er is geen sterke consensus over de beste manier om maatregel veranderingen in stromule activiteit, en totdat de functie van stromules wordt meer duidelijk omschreven, moeten onderzoekers blijven creatief bij het kwantificeren stromule dynamiek te zijn. Ter vergelijking in de literatuur echter gemeenschappelijke normen rapportage worden gebruikt in aanvulling op meer creatieve benaderingen. Op zijn minst bericht altijd de frequentie van chloroplasten die een of meer stromules hebben. </li><li> Bepaal de frequentie van chloroplasten die stromules in een gezichtsveld hebben. Gebruik ImageJ om alle chloroplasten te identificeren in een gezichtsveld. Vervolgens wordt voor elke chloroplast bepalen of de chloroplast ten minste ene stromule heeft gevormd. Verslag stromule frequentie als de percentage van chloroplasten met een stromule. LET OP: Sommige onderzoekers transformeren het percentage, bijvoorbeeld met de boogsinus transformatie, voordat de rapportage stromule frequenties; terwijl dit een optie voor statistische analyse, de boogsinus van stromule frequentie is niet een intuïtieve waarde, en hoeft niet te worden gemeld in de hoofdtekst of de cijfers van een studie. <ol><li> Als alternatief is, telt het totale aantal stromules en delen door het totale aantal chloroplasten. OPMERKING: In de meeste gevallen zal dit vergelijkbare resultaten te benaderen 4,2 opleveren; kan de frequentie stromule overschatten, maar als een chloroplast vele stromules gevormd. In de getoonde resultaten onder representatieve voorbeeld bijvoorbeeld enkele chloroplasten twee of meer stromules, waardoor het aantal stromules per chloroplast 40/87 (versus een stromule frequentie van 33/87). </li><li> Als alternatief, bepalen de stromule lengte in plaats van stromule frequentie. Lengte kan worden gemetenin ImageJ door het traceren van de stromule met de vrije hand lijn tool. LET OP: Aangezien de biologische rol van stromules onbekend blijft, is het niet duidelijk dat stromule lengte invloed op hun functie. Melden significante verschillen in stromule lang als ze worden waargenomen, maar ook rapporteren stromule frequenties (zoals beschreven in 4.2). OPMERKING: Stromule frequentie kan zeer variabel tussen verschillende bladeren onder dezelfde groeiomstandigheden zijn. Daarom, hoewel het bepalen van stromule frequentie kan tijdrovend zijn, experimenten moeten worden zorgvuldig ontworpen om grote steekproeven te nemen. Gebruik datasets uit ons laboratorium hebben we vastgesteld dat een monster van ten minste 16 planten per behandeling meestal voldoende krachtig is om te bepalen of er een statistisch significant verschil van ten minste een 1,5-voudige verandering in stromule frequentie tussen twee condities (met standaard α = 0.05 en β = 0,80). </li></ol></li><li> Statistische analyse van de resultaten. <ol><li> Om het me vergelijkeneen stromule frequenties van twee behandelingen, gebruik maken van de Welch t-test (ook bekend als de heteroscedastische t-toets of t-toets in de veronderstelling ongelijke variantie). Opmerking: Deze test is niet zo krachtig als t-toets conventionele Student&#39;s, maar Welch&#39;s t test is voordelig omdat het niet aannemen dat de variantie in stromule frequentieverdeling vergelijkbaar tussen behandelingen. LET OP: Aangezien stromule frequentie is een &quot;deel&quot;, is haar steekproefverdeling voorspelde binomiale eerder dan normaal te zijn, die kan in theorie scheef statistische analyse als steekproefomvang zijn zeer laag is of als stromule frequentie is zeer laag (in de buurt van 0%) of zeer hoog (bijna 100%). Sommige rapporten hebben boogsinus transformaties gebruikt voor statistische analyse, die bedoeld is om een binomiale verdeling vormen naar een normale verdeling en dus voldoen aan de standaard eisen van een Student t-test of ANOVA. In de praktijk echter, eenrcsine transformaties hebben weinig of geen effect op de statistische analyse, en worden daarom niet aanbevolen. In plaats daarvan, herhaal experimenten om steekproefomvang, die statistische power zal toenemen en het aantal fouten in de interpretatie van de gegevens te verhogen. </li><li> Wat statistische aanpak wordt gebruikt, moet u zorgvuldig verslag van de bemonsteringsstrategie, steekproefgrootte, statistische test, en p-waarde voor elk experiment. OPMERKING: Net als bij andere gebieden van de biologie, kan een p-waarde van minder dan 0,05 worden beschouwd als &quot;statistisch significant&quot;, hoewel de onderzoekers zeker de exacte p-waarde verkregen moet melden. Als p iets boven 0,05, waardoor de steekproefomvang met twee of drie experimenten kunnen helpen verduidelijken of het verschil waargenomen reproduceerbaar en statistisch significant. </li></ol></li></ol> 5. extraheren Intact Bladgroenkorrels te visualiseren Stromule Dynamics LET OP: verschillende methodenzijn gebruikt om chloroplasten isoleren van bladeren, met een enigszins ander protocol in een recente studie over stromule formatie in vitro 15. Het protocol hieronder gebruikt een betrekkelijk eenvoudige methode die biochemisch pure chloroplast monsters niet oplevert, maar in plaats daarvan een grote hoeveelheid intacte, gezonde chloroplasten 9,18 isoleren. <ol><li> Bereid koude extractie buffer: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM sorbitol, 2 mM EDTA, 1,0 mM MgCl2 en 1,0 mM MnCl2. Breng de pH op 6,9 met NaOH en HCl, en in de koelkast voor gebruik. OPMERKING: Hoewel niet noodzakelijk, met koud buffers en het opslaan van monsters op ijs indien mogelijk een groter deel van intacte chloroplasten verkregen. </li><li> Bereid isolatie buffer: 50 mM Hepes NaOH, 330 mM sorbitol, 2 mM EDTA, 1,0 mM MnCl2, 1,0 mM MgCl2, 10 mM KCl en 1,0 mM NaCl. Breng de pH op 7,6 met NaOH en HCl en in de koelkast voor gebruik. </li><li> Of de vleugels nietexpressie van een genetisch gecodeerde stromale fluorofoor, voor te bereiden carboxyfluoresceïne (CFDA) oplossing: 50 mm CFDA voorraad oplossing in dimethylsulfoxide (DMSO) (2,3 mg CFDA per 1,0 ml DMSO). OPMERKING: De precieze concentratie is niet kritisch. Houd CFDA voorraad in het donker te allen tijde. WINKEL kleine fracties 50 mM CFDA bij -20 ° C. </li><li> Om chloroplasten isoleren, te verwijderen ~ 5-10 g bladeren van verschillende planten en kort afspoelen met koud water. Onmiddellijk over naar 50 ml koude extractiebuffer. Grind bladeren met behulp van een blender met een aantal korte pulsen. Filtreer door twee of drie lagen kaasdoek te bladeren vuil te verwijderen, verdelen de geëxtraheerde chloroplasten twee 50 ml centrifugebuizen en centrifugeer gedurende 1 min bij 750 x g. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de groene chloroplasten in 10 ml isolatie buffer. Centrifugeer opnieuw gedurende 1 min bij 750 xg, verwijder het supernatant en resuspendeer chloroplasten geïsoleerd buffer eindvolume tot 5 ml wordt. </li><li> overdracht 201, l van de chloroplasten aan een dia, dek af met een dekglaasje, en beginnen microscopie. Opmerking chloroplasten van transgene planten die plastidegerichte fluorescente proteïnen zijn nu klaar voor visualisatie door confocale fluorescentiemicroscopie. </li><li> Vlek chloroplasten van planten die niet tot expressie plastidegerichte fluorescerende eiwitten te stromules te visualiseren. <ol><li> Voeg 5 ul van 50 mM CFDA bouillon aan de 5 ml chloroplasten gesuspendeerd in isolatie buffer. Breng het uiteindelijke concentratie 50 uM. </li><li> Sta chloroplasten incuberen 5 min, en vervolgens over een kleine hoeveelheid (~ 50 pi) van een glijbaan, bedek met een dekglaasje en beginnen microscopie. </li><li> Gebruik een FITC of GFP filter set. Gebruik een 20X objectief te veel chloroplasten gelijktijdig te visualiseren, of een hoger doel een enkele geïsoleerde chloroplast te visualiseren. LET OP: CFDA zal fluoresceren in het stroma van intacte chloroplasten. </li><li> Als er sterke achtergrondfluorescentie, was de chloroplasts opnieuw in 10 ml isolatie buffer na 5 min incubatie met CFDA Centrifugeer gedurende 1 min bij 750 xg, verwijder het supernatant en resuspendeer in 5 ml isolatiebuffer. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Koussevitzky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+from+chloroplasts+converge+to+regulate+nuclear+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression.</a> Science. 316 (5825), 715-719 (2007).</li>
<li>Burch-Smith, T. M., Brunkard, J. O., Choi, Y. G., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNAS+Plus%3A+Organelle-nucleus+cross-talk+regulates+plant+intercellular+communication+via+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">PNAS Plus: Organelle-nucleus cross-talk regulates plant intercellular communication via plasmodesmata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (51), E1451-E1460 (2011).</li>
<li>Stonebloom, S., Brunkard, J. O., Cheung, A. C., Jiang, K., Feldman, L., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+states+of+plastids+and+mitochondria+differentially+regulate+intercellular+transport+via+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Redox states of plastids and mitochondria differentially regulate intercellular transport via plasmodesmata.</a> Plant Physiol. 158 (1), 190-199 (2012).</li>
<li>Nomura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast-mediated+activation+of+plant+immune+signalling+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Chloroplast-mediated activation of plant immune signalling in Arabidopsis.</a> Nat. Commun. 3, 926(2012).</li>
<li>Avendaño-Vázquez, A. -O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+uncharacterized+apocarotenoid-derived+signal+generated+in+%CE%B6-carotene+desaturase+mutants+regulates+leaf+development+and+the+expression+of+chloroplast+and+nuclear+genes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An uncharacterized apocarotenoid-derived signal generated in ζ-carotene desaturase mutants regulates leaf development and the expression of chloroplast and nuclear genes in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 26 (June), 2524-2537 (2014).</li>
<li>Caplan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+stromules+runction+during+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Chloroplast stromules runction during innate immunity.</a> Dev. Cell. 34 (1), 45-57 (2015).</li>
<li>Hanson, M. R., Sattarzadeh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromules%3A+recent+insights+into+a+long+neglected+feature+of+plastid+morphology+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stromules: recent insights into a long neglected feature of plastid morphology and function.</a> Plant Physiol. 155 (4), 1486-1492 (2011).</li>
<li>Gray, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid+stromules+are+induced+by+stress+treatments+acting+through+abscisic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Plastid stromules are induced by stress treatments acting through abscisic acid.</a> Plant J. 69 (3), 387-398 (2012).</li>
<li>Brunkard, J., Runkel, A., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplasts+extend+stromules+independently+and+in+response+to+internal+redox+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chloroplasts extend stromules independently and in response to internal redox signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (32), 10044-10049 (2015).</li>
<li>Dupree, P., Pwee, K. -H., Gray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+photosynthesis+gene-promoter+fusions+in+leaf+epidermal+cells+of+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Expression of photosynthesis gene-promoter fusions in leaf epidermal cells of transgenic tobacco plants.</a> Plant J. 1 (1), 115-120 (1991).</li>
<li>Charuvi, D., Kiss, V., Nevo, R., Shimoni, E., Adam, Z., Reich, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain+and+loss+of+photosynthetic+membranes+during+plastid+differentiation+in+the+shoot+apex+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Gain and loss of photosynthetic membranes during plastid differentiation in the shoot apex of Arabidopsis.</a> Plant Cell. 24 (3), 1143-1157 (2012).</li>
<li>Chiang, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+GATA+transcription+factors+GNC+and+CGA1+reveals+their+key+role+in+chloroplast+development%2C+growth%2C+and+division+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the GATA transcription factors GNC and CGA1 reveals their key role in chloroplast development, growth, and division in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 160 (1), 332-348 (2012).</li>
<li>Schattat, M., Barton, K., Baudisch, B., Klösgen, R. B., Mathur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid+stromule+branching+coincides+with+contiguous+endoplasmic+reticulum+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plastid stromule branching coincides with contiguous endoplasmic reticulum dynamics.</a> Plant Physiol. 155 (4), 1667-1677 (2011).</li>
<li>Erickson, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-derived+cytokinin+influences+plastid+morphology+and+starch+accumulation+in+Nicotiana+benthamiana+during+transient+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-derived cytokinin influences plastid morphology and starch accumulation in Nicotiana benthamiana during transient assays.</a> BMC Plant Biol. 14 (1), 127(2014).</li>
<li>Ho, J., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+stromules+in+vitro+from+chloroplasts+isolated+from+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The formation of stromules in vitro from chloroplasts isolated from Nicotiana benthamiana.</a> PLoS One. 11 (2), e0146489(2016).</li>
<li>Brunkard, J. O., Burch-Smith, T. M., Runkel, A. M., Zambryski, P. Investigating plasmodesmata genetics with virus-induced gene silencing and an Agrobacterium-mediated GFP movement assay. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrunkard%2C+JO+%22Method.+Mol.+Biol%22">Method. Mol. Biol</a>. , 185-198 (2015).</li>
<li>Schattat, M. H., Klösgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+stromule+formation+by+extracellular+sucrose+and+glucose+in+epidermal+leaf+tissue+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of stromule formation by extracellular sucrose and glucose in epidermal leaf tissue of Arabidopsis thaliana.</a> BMC Plant Biol. 11, 115(2011).</li>
<li>Joly, D., Carpentier, R. Rapid isolation of intact chloroplasts from spinach leaves. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJoly%2C+D+%22Method.+Mol.+Biol%22">Method. Mol. Biol</a>. 684, 321-325 (2011).</li>
<li>Waters, M. T., Fray, R. G., Pyke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromule+formation+is+dependent+upon+plastid+size%2C+plastid+differentiation+status+and+the+density+of+plastids+within+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Stromule formation is dependent upon plastid size, plastid differentiation status and the density of plastids within the cell.</a> Plant J. 39 (4), 655-667 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Bij onderzoeken stromules moeten drie belangrijke factoren gedurende beschouwd: (i) manipulatie van het plantenweefsel moet tot een absoluut minimum worden gehouden, (ii) het experimentele systeem worden consequent gehouden, en (iii) bemonsteringsstrategieën moet zorgvuldig worden gepland verzekeren robuust zijn reproduceerbare data geanalyseerd. Stromules zijn opmerkelijk dynamisch: ze kunnen verlengen en intrekken snel voor de ogen van een waarnemer onder de microscoop. Bovendien stromule ...

Chloroplasten zijn dynamische organellen in plantencellen die verantwoordelijk zijn voor fotosynthese en een groot aantal andere metabole processen. Signaalroutes van het chloroplast oefenen ook aanzienlijke invloed uit op plantenfysiologie en -ontwikkeling, en coördineren plantreacties op omgevingsstress, pathogenen en zelfs bladvorm1-6. Onlangs hebben biologen interesse gekregen in een slecht begrepen aspect van de chloroplaststructuur: stromules, zeer dunne stroma-gevulde buisjes die zich uitstrekken vanaf het oppervlak van het chloroplast7.
De biologische functies van stromules blijven onbekend, hoewel bekend is dat de frequentie van stromules varieert als reactie op omgevingsstimuli7-9, en stromules mogelijk in staat zijn om signaalmoleculen tussen organellen over te brengen6. Alle soorten plastiden (niet alleen de groene, fotosynthetische chloroplasten, maar ook heldere leucoplasten, zetmeel-gevulde amyloplasten en gekleurde chromoplasten, om slechts enkele soorten plastiden te noemen) maken stromules, en stromules zijn te vinden in alle landplantensoorten die tot nu toe zijn onderzocht. Stromules kunnen dynamisch uitrekken en terugtrekken, binnen enkele seconden verschijnen of verdwijnen, of ze kunnen lange tijd relatief stationair blijven. Een van de grote uitdagingen waarmee stromule biologen worden geconfronteerd, is dat stromules vaak worden bestudeerd met drastisch verschillende methoden, weefsels en soorten, waardoor vergelijkingen over de stromule biologieliteratuur moeilijk worden. Om verder te gaan, zullen standaardpraktijken en grondige beschrijvingen van de experimentele systemen die worden gebruikt om stromules te bestuderen, van cruciaal belang zijn voor het ontdekken van de functie van deze alomtegenwoordige kenmerken van chloroplastmorfologie.
Hier beschrijven we methoden voor het visualiseren van stromulevorming in de epidermale chloroplasten van Nicotiana benthamiana bladeren. In het mesofyl zijn chloroplasten dicht opeengepakt in grote, driedimensionale cellen, wat het moeilijk maakt om stromules nauwkeurig en snel te visualiseren door confocale microscopie. Daarentegen zijn epidermale cellen relatief plat, bevatten minder chloroplasten en bevinden zich op het oppervlak van het blad, waardoor gemakkelijke en snelle visualisatie van stromules mogelijk is. N. benthamiana is een ideaal modelsysteem voor deze experimenten omdat, in tegenstelling tot veel plantensoorten, alle cellen in de epidermis van N. benthamiana chloroplasten maken10. In de epidermis van de meeste planten, inclusief Arabidopsis thaliana, hebben alleen de stomabewakingscellen chloroplasten, terwijl andere epidermale cellen 'leucoplasten' hebben, plastiden die helder, relatief amorf en niet-fotosynthetisch zijn9,11,12. Dus, terwijl een enkel gezichtsveld van een A. thaliana epidermis slechts een handvol chloroplasten in een paar bewakingscellen zou kunnen tonen, zou een gezichtsveld van een N. benthamiana epidermis tientallen of zelfs honderden chloroplasten omvatten. Alle hier beschreven methoden kunnen echter worden aangepast om andere vragen in stromule biologie te onderzoeken; bijvoorbeeld, we hebben dezelfde aanpak gebruikt om leucoplast stromules van A. thaliana te bestuderen9.

<table><tbody><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fischer-Scientific</td><td>S320-1</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fischer-Biotech</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Confocal Microscope&nbsp;</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td>Model: LSM710</td><td></td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21879&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>EMD</td><td>MX1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Waring blender</td><td>Waring&nbsp;</td><td>Model: 31BL92</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>fiji.sc</td><td></td><td>Open-source software voor het analyseren van biologische beelden</td></tr></tbody></table>

visualiseren stromule frequency met fluorescentiemicroscopie

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, oftewel "stroma-gevulde tubuli", zijn smalle, buisvormige uitsteeksels van het oppervlak van het chloroplast die universeel worden waargenomen in plantencellen, maar waarvan de functies nog steeds een raadsel zijn. Naast de groeiende aandacht voor de rol van chloroplasten bij het coördineren van plantreacties op stress, is de interesse in stromules en hun relatie tot de signaleringsdynamiek van chloroplasten de afgelopen jaren toegenomen, geholpen door vooruitgang in fluorescentiemicroscopie en eiwitfluoroforen die een snelle, nauwkeurige visualisatie van stromuledynamiek mogelijk maken. Hier bieden we gedetailleerde protocollen om de frequentie van stromules te meten in de epidermale chloroplasten van Nicotiana benthamiana, een uitstekend modelsysteem voor het onderzoeken van de biologie van chloroplaststromules. We geven ook methoden voor het visualiseren van chloroplaststromules in vitro door chloroplasten uit bladeren te extraheren. Ten slotte beschrijven we bemonsteringsstrategieën en statistische benaderingen om verschillen in stromulefrequenties te analyseren als reactie op stimuli, zoals omgevingsstress, chemische behandelingen of gensilencing. Onderzoekers kunnen deze protocollen gebruiken als uitgangspunt om nieuwe methoden te ontwikkelen voor innovatieve experimenten om te onderzoeken hoe en waarom chloroplasten stromules maken.

Dit protocol werd gebruikt om stromule frequentie visualiseren overdag en &#39;s nachts in de zaadlobben van jonge N. benthamiana zaailingen. Segmenten van een z-stack werden samengevoegd tot één beeld (figuur 1A). Voor visuele doeleinden, dat het was toen desaturated en omgekeerd, zodat stroma zwart is (Figuur 1B). De chloroplasten werden bestempeld, hetzij als zonder stromules (groene asterisk) of met ten minste één stromule (magenta ...

Protocollen om de dynamica van chloroplast-stromules te onderzoeken, de stroma-gevulde buisjes die zich uitstrekken vanaf het oppervlak van chloroplasten, worden beschreven.

Visualiseren Stromule Frequency met fluorescentiemicroscopie

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren en bepalen van de frequentie van stromulen met behulp van live-cell confocale fluorescentiemicroscopie in bladeren, en het visualiseren van stromulen in vitro met behulp van uit bladeren geëxtraheerde chloroplasten. Deze experimentele methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de plantencelbiologie en chloroplastonderzoek door te ontdekken hoe stromulen functioneren. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat ze reproduceerbare en robuuste gegevens opleveren, zelfs voor deze zeer dynamische chloroplaststructuren.We kregen het idee voor de studie naar chloroplastisolatie omdat uit sommige onderzoeken bleek dat de vorming van stromulen cytosolische structuren vereist, zoals het cytoskelet. Daarom hebben we besloten de cel te homogeniseren om te zien of stromulen dan nog steeds konden worden gevormd. Begin bij de bereiding van bladmonsters met het afsnijden van een klein gedeelte van een blad van Nicotiana benthamiana met een zeer scherp scheermesje.Dompel de bladsectie direct na het snijden onder in een injectiespuit van vijf milliliter gevuld met water. Verwijder vervolgens de lucht uit de spuit en creëer een vacuüm door de opening van de spuit met een vinger af te dekken voordat u de zuiger naar achteren trekt. Laat de zuiger voorzichtig los om beschadiging van de bladsectie te voorkomen.Herhaal de luchtverwijdering vervolgens twee of drie keer, of totdat de lucht is verwijderd en het blad donkergroen oogt. Voeg een druppel water toe aan een objectglas en plaats de bladsectie op de druppel. Voeg daarna nog een druppel water toe bovenop het blad en plaats een dekglas.Als er luchtbellen aanwezig zijn, tik dan voorzichtig tegen het dekglas tot deze zijn verdwenen. Focus met doorgelaten licht en een 20x objectief op een gezichtsveld nabij het centrum van de bladsnede, waarbij meerdere chloroplasten gelijktijdig zichtbaar zijn. Sla een afbeelding met doorgelaten licht op, zodat celtypen indien nodig later kunnen worden onderscheiden.Schakel vervolgens over naar laserilluminatie met de juiste excitatie- en emissiefilters voor het gebruikte fluorofoor en sla een nieuwe afbeelding op. Selecteer met de microscoopsoftware het GFP-kanaal en klik om de pinhole-opening aan te passen naar één airy unit. Selecteer laserscanning om de visualisatie van het monster te starten, en klik vervolgens op het GFP-kanaal en de detectorgain om het laservermogen te minimaliseren terwijl de stromules nog steeds duidelijk zichtbaar blijven.Bereid vervolgens een Z-stack experiment voor om een reeks beelden van de bladepidermis binnen het gezichtsveld vast te leggen. Pas de scansnelheid en beeldresolutie naar behoefte aan om ervoor te zorgen dat de Z-stack snel wordt verzameld. Sla de Z-stack vervolgens op voor latere analyse.Voeg met behulp van ImageJ de Z-stapel samen tot één afbeelding door de maximale intensiteit in de software te gebruiken. Identificeer vervolgens alle chloroplasten in de afbeelding en tel deze handmatig. Bepaal voor elke chloroplast visueel of er één of meer stromulen zichtbaar zijn die vanuit de chloroplast uitsteken in de samengevoegde Z-stapelafbeelding.Bereid voor het extraheren van intacte chloroplasten een koude extractiebuffer voor met behulp van de volgende reagentia. Pas vervolgens met NaOH en HCl de pH aan naar 6,9 en bewaar de buffer gekoeld tot gebruik. Bereid de isolatiebuffer en pas de pH aan naar 7,6.Als de bladeren geen genetisch gecodeerde stromofluorofoor tot expressie brengen, bereid dan een Carboxyfluoresceïne-diacetaat- of CFDA-oplossing. Om chloroplasten te isoleren, verwijdert u ongeveer 5 tot 10 gram bladeren van verschillende planten en spoelt u deze kort af met koud water. Breng de bladeren vervolgens onmiddellijk over in 50 milliliter koude extractiebuffer.Maal de bladeren met een blender door middel van enkele korte pulsen en filter het mengsel vervolgens door twee tot drie lagen kaasdoek om bladresten te verwijderen. Verdeel de geëxtraheerde chloroplasten over twee centrifugebuizen van 50 milliliter en centrifugeer gedurende één minuut bij 750 x g. Verwijder het supernatant en gebruik 10 milliliter isolatiebuffer om de groene chloroplasten opnieuw te suspenderen.Centrifuge vervolgens opnieuw gedurende één minuut bij 750 x g, verwijder het supernatant en gebruik isolatiebuffer om de chloroplasten opnieuw te suspenderen tot een eindvolume van vijf milliliter. Als de chloroplasten afkomstig zijn van transgene planten die plastiden-getargete fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, breng dan 20 microliters van de chloroplasten over op een objectglas en voeg een dekglas toe. Voer vervolgens de microscopie uit.Om chloroplasten te kleuren van planten die geen plastiden-gerichte fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, voegt u vijf µL van een 50 mM CFDA-stamoplossing toe aan de vijf mL chloroplasten in isolatiebuffer. Nadat de chloroplasten vijf minuten hebben geïncubeerd, brengt u een klein aliquot over op een objectglas, plaatst u een dekglas en voert u de microscopie uit. Gebruik tenslotte een FITC- of GFP-filterset en een 20x objectief om meerdere chloroplasten gelijktijdig te visualiseren.Of een objectief met een hogere vergroting om een enkel geïsoleerd chloroplast te visualiseren. Hier wordt een samengevoegde stack getoond die de GFP-stomatafrequentie in de cotylen van jonge N.Benthamiana-zaailingen weergeeft. In dit paneel is het beeld verzadigingsarm gemaakt en geïnverteerd, zodat het stroma zwart verschijnt.De chloroplasten werden gelabeld als zijnde zonder stromulen, of met ten minste één stromule. Van de 87 gevisualiseerde epidermale chloroplasten hadden er 33 stromulen, wat neerkomt op een frequentie van 37,9 procent in dit blad. Deze grafiek vertegenwoordigt de analyse van meer dan 23.000 chloroplasten en enkele honderden cellen van een enkel blad van 21 verschillende planten.De gemiddelde stromulefrequentie overdag was 20,8 plus of minus 1,8 procent, en de gemiddelde nachtelijke stromulefrequentie was 12,8 plus of minus 0,9 procent, wat duidt op een significant hogere frequentie overdag, zoals vastgesteld door de Welch's T-test. In deze figuur werden chloroplast-stromules in vitro waargenomen na isolatie uit N.benthamiana die plastide-getarget GFP tot expressie bracht, of na het gebruik van CFDA om chloroplasten uit N.benthamiana of Spinachia oleracea te kleuren. Bij het uitvoeren van live-cell imaging van stromules is het belangrijk om snel te werken en het plantenweefsel zo min mogelijk te manipuleren.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals gene silencing of chemische behandelingen, worden gebruikt om aanvullende moleculaire spelers of pathways te ontdekken die betrokken zijn bij de vorming en functie van stromulen. Deze techniek is door onderzoekers in de plantencelbiologie en plantimmuniteit gebruikt om de rol van stromulen in cellulaire signaleringsroutes en plantreacties op pathogenen te bestuderen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de frequentie van stromulen in een blad berekent en hoe u stromulen in geëxtraheerde chloroplasten observeert.En onthoud dat de lasers en de elektrische spanning die een scanning elektronenconfocale microscoop voeden uiterst gevaarlijk kunnen zijn, en dat het belangrijk is om de systeemeisen voor het gebruik van deze apparatuur te begrijpen.

visualizing-stromule-frequency-with-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier laten we zien de protocollen voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie microscopie op levende bacteriële cellen in staat te stellen functionele moleculaire complexen worden opgespoord, gevolgd en gekwantificeerd.

Visualiseren Single moleculaire complexen In Vivo Geavanceerde fluorescentiemicroscopie

Dit protocol biedt een stap-voor-stap procedure te controleren enkele cel gedrag van verschillende bacteriën in de tijd met behulp van geautomatiseerde fluorescentie time-lapse microscopie. Verder hebben we geven richtlijnen hoe de microscopie beelden te analyseren.

Live cell imaging van Bacillus subtilis En Streptococcus pneumoniae Met Automatisch Time-lapse Microscopie

Source: Schlimpert, S. et al. Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates fluorescence time-lapse imaging of the complete life cycle of the bacteria Streptomyces venezuelae using a microfluidic device to visualize germination, hyphal growth, and sporulation in real time.

Fluorescence Time-Lapse Imaging of the Streptomyces venezuelae Life Cycle

This video demonstrates how neuronal vesicles are labeled with specific fluorescent proteins to visualize their movement. First, a plasmid coding for a fluorescent protein is incubated with a transfection agent and then introduced into a culture of neurons. Subsequently, images of the neurons are acquired and analyzed to track the vesicles' movement.

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging

Om stromingssnelheden en directionaliteit van filamenteus-actine bij de T-cel immunologische synaps te onderzoeken, wordt live-cell superresolutie beeldvorming gecombineerd met totale interne reflectiefluorescentie en gekwantificeerd met behulp van ruimte-tijdelijke beeldcorrelatiespectroscopie.

Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens

Dit manuscript beschrijft een methode voor het labelen van individuele boodschapper-RNA (mRNA) afschriften met fluorescently-geëtiketteerden DNA sondes, voor gebruik in single-molecuul fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) proeven in E. coli. smFISH is een visualisatie methode waarmee de simultane detectie-, lokalisatie- en kwantificering van afzonderlijke mRNA moleculen in vaste afzonderlijke cellen.

Methode voor het labelen van afschriften in individuele Escherichia coli cellen voor Single-molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie experimenten

Presenteren we een protocol voor het gebruik van STED microscopie gelijktijdig afbeelding actine structuren, microtubuli en microtubulus plus-end bindende proteïnen in B-cellen die zich hebben verspreid op coverslips bekleed met antilichamen aan de B-cel receptor, een model voor de eerste fase van immuun synapse formatie.

Visualiseren van de actine en microtubulus Cytoskeletons in de B-cel immuun Synaps met behulp van de gestimuleerde emissie uitputting (STED) microscopie

Het algemene doel van deze methodiek is geven de optimale proefomstandigheden van monstervoorbereiding Beeldacquisitie en wederopbouw om uit te voeren van 2D dubbele dSTORM kleurenafbeeldingen van microtubuli en intermediaire filamenten in vaste...

Imaging Intermediaire filamenten en microtubuli met 2-dimensionale directe stochastische optische wederopbouw microscopie

Dit protocol beschrijft de analyse van fluorescently gelabelde intracellulaire compartimenten in ontluikende gist met behulp van Multi-Color 4D (time-lapse 3D) confocale microscopie. De beeldvormings parameters worden gekozen om adequate signalen vast te leggen en foto schade te beperken. Met aangepaste ImageJ-plug-ins kunnen gelabelde structuren worden bijgehouden en kwantitatief worden geanalyseerd.

4D microscopie van gist

Chip-based superresolutie optische microscopie is een nieuwe benadering van fluorescentiemicroscopie en biedt voordelen in kosteneffectiviteit en doorvoer. Hier worden de protocollen voor chip voorbereiding en beeldvorming getoond voor TIRF microscopie en lokalisatie gebaseerde super-resolution microscopie.

High-throughput totale interne reflectie fluorescentie en directe stochastische optische reconstructie microscopie met behulp van een Photonic chip

Verschillende veelgebruikte methoden worden hier geïntroduceerd om de membraanhandelgebeurtenissen van een plasmamembraanreceptorkinase te bestuderen. Dit manuscript beschrijft gedetailleerde protocollen, waaronder de bereiding van het plantmateriaal, de farmacologische behandeling en de confocale beeldvorming.

Op afbeeldingen gebaseerde methoden om membraanhandelgebeurtenissen in somatale afstammingscellen te bestuderen

Leer stromulefrequentie visualiseren in plantencellen met behulp van confocale fluorescentiemicroscopie en geïsoleerde chloroplasten van Nicotiana benthamiana. Deze methode levert reproduceerbare data over chloroplastdynamiek.

Visualiseren Stromule Frequency met fluorescentiemicroscopie

Meer video's verkennen