Visualiseren Stromule Frequency met fluorescentiemicroscopie

Het algemene doel van deze procedure is om de frequentie van stromules te visualiseren en te bepalen met behulp van confocale fluorescentiemicroscopie van levende cellen in bladeren, en voor het visualiseren van stromules in vitro met behulp van chloroplasten die uit bladeren zijn geëxtraheerd. Deze experimentele methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de plantencelbiologie en chloroplastenonderzoek door te ontdekken hoe stromules functioneren. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat ze reproduceerbare en robuuste gegevens produceren, zelfs van deze zeer dynamische chloroplaststructuren.

We hadden het idee voor de chloroplastisolatiestudie omdat sommige onderzoeken suggereerden dat stromulevorming cytosolische structuren, zoals het cytoskelet, nodig had om zich te vormen. Dus besloten we de cel te mengen en te kijken of stromules zich nog steeds konden vormen. Om blaadjes voor te bereiden, begint u met het gebruik van een zeer scherp scheermes om een ​​klein stukje van een Nicotiana benthamiana-blad te snijden.

Onmiddellijk na het snijden van het bladstuk, dompelt u het in een vijf milliliter spuit gevuld met water. Vervolgens verwijdert u de lucht uit de spuit en past u een vacuüm toe door een vinger over de spuitopening te houden voordat u de zuiger trekt. Laat de zuiger voorzichtig los om schade aan het bladstuk te voorkomen.

Herhaal het verwijderen van de lucht twee of drie keer, of totdat de lucht is verwijderd en het blad diepgroen lijkt. Voeg een druppel water toe aan een glasplaat en plaats het bladstuk op de druppel. Voeg vervolgens nog een druppel water toe aan de bovenkant van het blad en voeg een dekglas toe.

Als er luchtbellen zijn, tikt u voorzichtig op het dekglas totdat ze zijn verwijderd. Met getransmitteerd licht en een 20x objectief, focus op een gezichtsveld nabij het centrum van het bladstuk, waarbij meerdere chloroplasten tegelijkertijd worden gevisualiseerd. Sla een afbeelding op met getransmitteerd licht, zodat celtypen later kunnen worden onderscheiden indien nodig.

Schakel vervolgens over naar laserverlichting met de juiste excitatie- en emissiefilters voor de gebruikte fluorofoor, en sla een andere afbeelding op. Gebruik de microscoopsoftware, selecteer het GFP-kanaal en klik om de pin-apertuur aan te passen tot één luchtunit. Selecteer laserscannen om het monster te visualiseren en klik vervolgens op het GFP-kanaal en detectorversterking om het laservermogen te minimaliseren terwijl stromules nog steeds duidelijk worden gevisualiseerd.

Bereid vervolgens een Z-stack-experiment voor dat de reeks afbeeldingen door de bladepidermis in het gezichtsveld zal verzamelen. Pas de scannelheid en beeldresolutie zo nodig aan om ervoor te zorgen dat de Z-stack snel wordt verzameld. Sla vervolgens de Z-stack op voor latere analyse.

Gebruik image J om de Z-stack samen te voegen in een enkele afbeelding met behulp van de maximale intensiteit in de software. Identificeer en tel vervolgens handmatig alle chloroplasten in de afbeelding. Bepaal voor elke chloroplast visueel of er een of meer stromules te zien zijn die zich uitstrekken vanaf de chloroplast in de samengevoegde Z-stack-afbeelding.

Om intacte chloroplasten te extraheren, bereid koude extractiebuffer voor met behulp van de volgende reagentia. Pas vervolgens met NaOH en HCl de pH aan tot 6,9 en koel voor gebruik. Bereid isolatiebuffer en pas de pH aan tot 7,6.

Als de bladeren geen genetisch gecodeerde stromofluorofoor tot expressie brengen, bereid Carboxyfluorescein-diacetaat of CFDA-oplossing voor. Om chloroplasten te isoleren, verwijdert u ongeveer 5 tot 10 gram bladeren van verschillende planten en spoelt u deze kort in koud water. Breng de bladeren vervolgens onmiddellijk over in 50 milliliter koude extractiebuffer.

Gebruik een blender met meerdere korte pulsen om de bladeren te malen en filter de mengsel door twee tot drie lagen kaasdoek om bladresten te verwijderen. Verdeel de geëxtraheerde chloroplasten in twee 50 milliliter centrifugeerbuisjes en centrifugeer gedurende één minuut bij 750 x g. Gooi het supernatant weg en gebruik 10 milliliter isolatiebuffer om de groene chloroplasten op te schorsen.

Centrifugeer vervolgens opnieuw gedurende één minuut bij 750 x g, gooi het supernatant weg en gebruik isolatiebuffer om de chloroplasten op te schorsen tot een eindvolume van vijf milliliter. Als de chloroplasten van transgene planten zijn die plastid-gerichte fluorescente eiwitten tot expressie brengen, breng dan 20 microliter van de chloroplasten over naar een glasplaat en voeg een dekglas toe. Voer vervolgens microscopie uit.

Om chloroplasten te kleuren van planten die geen plastid-gerichte fluorescente eiwitten tot expressie brengen, voegt u vijf microliter van 50 millimolair CFDA-voorraad toe aan de vijf milliliter chloroplasten in isolatiebuffer. Laat de chloroplasten vijf minuten incuberen en breng vervolgens een kleine aliquot over naar een glasplaat, voeg een dekglas toe en voer microscopie uit. Gebruik ten slotte een FITC- of GFP-filterset en een 20x objectief om meerdere chloroplasten tegelijkertijd te visualiseren.

Of een hoger objectief om een ​​enkele geïsoleerde chloroplast te visualiseren. Een samengevoegde stack die de frequentie van GFP-stomule in de codoledence van jonge N. Benthamiana-zaailingen toont, wordt hier getoond. In dit paneel is de afbeelding verzadigd en geïnverteerd, zodat de stroma zwart lijkt.

De chloroplasten werden gelabeld als het hebben van geen stromules, of het hebben van ten minste één stromule. Van de 87 gevisualiseerde epidermale chloroplasten, hebben er 33 stromules, voor een frequentie van 37,9 procent in dit blad. Deze grafiek vertegenwoordigt de analyse van meer dan 23.000 chloroplasten en enkele honderden cellen van een enkel blad van 21 verschillende planten.

De gemiddelde stromulefrequentie gedurende de dag was 20,8 plus of minuus 1,8 procent, en de gemiddelde nachtelijke stromulefrequentie was 12,8 plus of minuus 0,9 procent, wat wijst op een significant hogere frequentie overdag