Verstoringen van circulerende miRNAs in het prikkelbare darm syndroom gedetecteerd met een multiplexverzending High-throughput genexpressie Platform
30 november 2016
We beschrijven het gebruik van een multiplexe hoogdoorvoerige genexpressieplatform die genexpressie kwantificeert door middel van barcodes en het tellen van moleculen in biologische substraten zonder de noodzaak voor amplificatie. We gebruikten het platform om microRNA (miRNA) expressie in vol bloed te kwantificeren bij personen met en zonder prikdarm syndroom.
Het algemene doel van dit multiplex-protocol voor de kwantificering van nucleïnezuur is om de expressie van microRNA in vol bloed digitaal te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de studie van spijsverteringsstoornissen. Het helpt bij de identificatie van gereguleerd moleculaire mechanismen en biomarker-signaturen, zoals microRNA's.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de kwantificering van microRNA niet afhankelijk is van amplificatie. Deze technologie telt moleculaire doelen digitaal en is grotendeels geautomatiseerd. Om totaal RNA te zuiveren, ontdooi en incubeer eerder verzamelde en bevroren volbloedmonsters gedurende twee uur.
Gebruik een draaiende emmerrotor om de buisjes te centrifugeren bij 5.000 keer g bij kamertemperatuur gedurende tien minuten. Verwijder vervolgens de supernatanten door voorzichtig te gieten of te pipetten in een afvalbuisje, zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord. Voeg vier milliliter RNase-vrij water toe aan de pellet.
Plaats de dop stevig weer op en vortex tot de pellet zichtbaar is opgelost. Centrifugeer vervolgens de buis opnieuw en verwijder de supernatant. Voeg vervolgens 350 microliter BM1-buffer toe aan de pellet en vortex tot de pellet zichtbaar is opgelost.
Breng vervolgens het monster over naar een twee milliliter verwerkingsbuis voor geautomatiseerde extractie van totaal RNA. Gebruik een commercieel verkrijgbaar RNA-extractiekit en voer een geautomatiseerde zuivering uit van intracellulair RNA, inclusief microRNA uit het volbloedmonster, door de voorgeladen pipettentips, centrifugebuizen, buffers en reagentia die in de RNA-zuiveringskit zijn meegeleverd, in het robotische RNA-extractiesysteem te laden. Kies uit het protocolselectiemenu het Blood miRNA PartA-protocol en start de uitvoering.
Voltooi de RNA-extractie en bewaar de monsters volgens het tekstprotocol. Bereid microRNA-monsters voor door eerst RNase-vrij water te gebruiken om 12 RNA-monsters te normaliseren tot 33 nanogram per microliter. Bereid met nuclease-vrij water een 1-in-500 verdunning van de microRNA-controles voor die in de assaykit zijn meegeleverd en bewaar op ijs.
Bereid vervolgens de annealing master mix voor door 13 microliter annealingbuffer, 26 microliter micro R-tag reagens en 6,5 microliter microRNA-controles te combineren. Voeg aan elk van de 12 0,2 milliliter stripbuisjes 3,5 microliter van de annealing master mix toe en voeg vervolgens 3 microliter van het RNA-monster toe. Schep de buisjes om te mengen, centrifugeer ze met een bench-top mini microcentrifuge bij 2000 keer g en draai de buisjes in een thermocycler volgens het volgende programma.
Bereid vervolgens een ligatie master mix voor door drie microliter van de ligatiebuffer en 19,5 microliter PEG te combineren. Voeg vervolgens 2,5 microliter van de ligatie master mix toe aan elk van de reacties. Na het mengen en centrifugeren van de buisjes, plaats ze terug in de thermocycler bij 48 graden Celsius gedurende vijf minuten.
Voeg vervolgens een microliter ligase rechtstreeks toe aan elk monster terwijl deze nog in de thermocycler-blok zit en incubeer de buisjes volgens het volgende programma. Meng voorzichtig en centrifugeer de buisjes en voeg een microliter ligatie opruimingsenzym toe aan elk monster. Incubeer vervolgens de buisjes in de thermocycler zoals hier getoond.
Na de incubatie, voeg 40 microliter RNase-vrij water toe aan de monsters voor het mengen en centrifugeren. Om microRNA-hybridisatie uit te voeren, ontdooi de reporter en capture probe sets die op ijs zijn bewaard en centrifugeer ze. Voeg 130 microliter hybridisatiebuffer toe aan de Reporter Code Set 2 en meng om de hybridisatie master mix te creëren.
Voeg in 12 nieuwe 0,2 milliliter stripbuisjes 20 microliter van de hybridisatie master mix toe. Denatureer de zojuist bereide microRNA-monsters gedurende vijf minuten bij 85 graden Celsius en koel ze af op ijs. Voeg vervolgens 5 microliter van de microRNA-monsters toe aan elk van de stripbuisjes die de hybridisatie master mix bevatten.
Programmeer de thermocycler naar 65 graden Celsius, bij een temperatuur berekend op een volume van 30 microliter en de verwarmde deksel op de Forever-tijdinstelling, zodat deze niet aflopen naar 4 graden Celsius aan het einde van de uitvoering. Voeg 5 microliter van de capture probe set toe aan elke buis en meng. Plaats de buisjes na het centrifugeren onmiddellijk in de thermocycler bij 65 graden Celsius.
Incubeer de monsters gedurende minimaal 12 uur en maximaal 30 uur. Zet de prep-station op door de cartridge en platen eerst op te warmen tot kamertemperatuur. Centrifugeer vervolgens de platen.
Om de prep-station te laden, opent u de stationsdeur en laadt u de reagentiaplaten, cartridge, pipettentips, bereide monsters in 0,2 milliliter stripbuisjes en twee lege 0,2 milliliter 12-buisjes stripbuisjes op de juiste locaties in de robot. Verwijder de stripbuisjesdoppen en deksel van de reagentiaplaat. Sluit vervolgens de prep-stationdeur en voer het juiste assay uit vanaf het bedieningspaneel.
Om de barcodes van de geïmmobiliseerde en georiënteerde tripartite complexen te visualiseren en te tellen, verwijdert u de cartridge uit de prep-station, gebruikt u het meegeleverde deksel om deze te verzegelen en plaatst u deze in de digitale analyzer in een beschikbare sleuf. Gebruik het touchscreen om een cartridge definitiebestand, of CDF, te maken. Zorg ervoor dat het juiste reporter bibliotheekbestand aan elk monster in de CDF is toegewezen.
Nadat het scannen is voltooid, downloadt u de databestanden van de digitale analyzer via een USB-drive of per e-mail, voordat u de gegevens verwerkt en analyseert, volgens het bijbehorende QC- en analyseprotocol. Het genexpressieplatform assaysysteem vermindert technische ruis door zijn hoog geautomatiseerde aard en de unieke chemie die het gebruikt, produceert hoogprecisie genexpressiedata. De technische replica's die hier worden getoond, demonstreren de hoge reproduceerbaarheid in zowel endogene als virale microRNA expressiekwantificering die mogelijk is.
Met behulp van deze methode kunnen virus-gecodeerde en endogene menselijke microRNA's die afwijken van de verwachte expressie, zoals gedefinieerd door gezonde studie deelnemers, worden geïdentificeerd als doelwitten van belang in IBS. De precisie en gevoeligheid van de methode maakt het mogelijk om verstoringen onder laag-
Overzicht
Dit artikel presenteert een multiplexed hoog-doorvoer genexpressie platform ontworpen om microRNA expressie in gehele bloedmonsters te kwantificeren. De methode maakt nauwkeurige meting zonder amplificatie mogelijk, waardoor het geschikt is voor het bestuderen van aandoeningen zoals het prikkelbare darmsyndroom.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Genexpressie analyse
- MicroRNA kwantificering
- Onderzoek naar spijsverteringsstoornissen
Achtergrond
- MicroRNA's spelen een cruciale rol in genregulatie.
- Het begrijpen van hun expressie kan inzichten bieden in verschillende ziekten.
- Huidige methoden vertrouwen vaak op amplificatie, wat variabiliteit kan introduceren.
- Deze studie heeft tot doel die beperkingen te overwinnen met een nieuwe aanpak.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor digitale kwantificering van microRNA in bloed.
- Om dysregulerende moleculaire mechanismen in prikkelbare darmsyndroom te identificeren.
- Om biomarker signaturen voor spijsverteringsstoornissen vast te stellen.
Gebruikte methoden
- Automatische RNA extractie uit gehele bloedmonsters.
- Bereiding van microRNA monsters met behulp van specifieke reagentia.
- Hybridisatie- en ligatieprocessen voor microRNA detectie.
- Digitale analyse van genexpressie data met behulp van een gespecialiseerd platform.
Belangrijkste resultaten
- De methode toonde hoge precisie in het kwantificeren van microRNA niveaus.
- Technische replicaten toonden reproduceerbaarheid in resultaten.
- Identificeerde microRNA's die afwijken van gezonde expressieprofielen.
- Subtiele verstoringen in doelen met lage expressie werden betrouwbaar gedetecteerd.
Conclusies
- Het multiplex platform biedt een robuust hulpmiddel voor het bestuderen van microRNA in bloed.
- Het kan helpen bij het begrijpen van de moleculaire basis van spijsverteringsstoornissen.
- Deze aanpak kan leiden tot de ontdekking van nieuwe biomarkers voor prikkelbare darmsyndroom.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This multiplexed high-throughput gene expression platform enables robust, amplification-free quantification of circulating miRNAs, supporting biomarker discovery in digestive disorders such as irritable bowel syndrome. By providing high sensitivity and reproducibility in detecting low-expression miRNA perturbations, the method enhances target validation confidence and reduces mechanistic ambiguity in early discovery. Its automated workflow and digital counting approach improve assay standardization and scalability for cross-functional R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying dysregulated circulating miRNAs as potential biomarkers in IBS.
- Operational Value: Supports biological de-risking through precise, amplification-free quantification that minimizes technical variability.
- Predictive Value: Facilitates detection of subtle miRNA perturbations, improving confidence in target relevance and portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates highly reproducible, quantitative miRNA expression data suitable for assay standardization and biomarker panel development.
- Operational Value: Reduces investigator effects via largely automated sample preparation and robotic processing, enhancing throughput and consistency.
- Scalability: Permits multiplexed analysis of up to 800 transcripts per reaction, enabling efficient screening of miRNA signatures across cohorts.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports validation of circulating miRNA biomarkers discovered in human samples for further preclinical investigation.
- Mechanistic De-risking: Allows correlation of miRNA expression changes with disease subtypes, aiding in pathophysiological understanding.
- Predictive Confidence: Enables reliable detection of low-abundance miRNAs, improving biomarker sensitivity and reducing false-negative risk in translational studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis-driven biomarker screening to assay validation, supporting progression from early discovery to lead identification in digestive disorder research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing by quantifying miRNA expression changes in whole blood, clarifying dysregulated molecular pathways in IBS.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs with high linearity and sensitivity, supporting reliable compound or biomarker evaluation.
- Analytics: Provides digital barcode counts and normalized expression data that facilitate statistical comparison across conditions and cohorts.
- Translational Research: Connects circulating miRNA findings to disease relevance, supporting biomarker continuity into preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, automated platform for miRNA profiling applicable across multiple therapeutic areas beyond gastrointestinal disorders.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing technical noise and enabling detection of low-expression miRNA changes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through automation, minimizing batch effects and user variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust biomarker data, reducing late-stage failure risk due to poorly validated targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of miRNA biomarkers based on reproducible, quantifiable expression changes in clinically relevant samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling, automated liquid handling systems, and digital image analysis for accurate miRNA quantification.
- Dependent on access to robotic prep stations, digital analyzers, and proprietary fluorescent probe sets with color-coded barcodes.
- Necessitates cross-team standardization of sample collection, RNA normalization, and hybridization protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the assay to different biofluids or tissue types beyond whole blood.
- Limited by the need for specialized reagents and equipment, which may constrain adoption in low-resource settings despite high reproducibility.
