Name: Generating De Novo Antigeen-specifieke menselijke T-cel receptoren door Retrovirale Transductie van Centric Hemichain (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Leer hoe u de novo antigeen-specifieke T-celreceptoren genereert door retrovirale transductie van centric hemiketens. Deze methode vereenvoudigt TCR-isolatie voor gentherapie en immunotherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie R01 CA148673 (NH); de Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH); BioCanRX Catalyst Grant (NH); The Princess Margaret Cancer Foundation (MOB, NH); Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship (TG); Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Postgraduate Scholarship (TG); Province of Ontario (TG, MA); en Guglietti Fellowship Award (TO). HLA- en CD1d-monomeren werden vriendelijk ter beschikking gesteld door de NIH tetramer core facility.

1. Voorbereiding Retrovirale Construct Encoding TCR Hemichain Interessante <ol><li> Lineariseren PMX vector de insertie van een TCR gen in opeenvolgende stappen laten. Digest het plasmide DNA met EcoRI en NotI restrictie-enzymen bij 37 ° C gedurende 3 uur (Tabel 1) 8. </li><li> Het uitvoeren van elektroforese van de verteerde plasmide op 1,2% agarosegel. Accijnzen band van ongeveer 4500 basenparen (bps) en elueren in 30 ul steriel water met behulp van commercieel verkrijgbare gel extractie kits 9. </li><li> Ontwerp 5 &#39;en 3&#39; primers voor de TCR gen van interesse dat ook 15-20 bp overlappen de EcoRI en Notl digestie plaats van PMX vector, respectievelijk 8 coderen. </li><li> TCR gen amplificeren met primers. Voer elektroforese van het PCR-product en elueer band van ongeveer 1000 bp, zoals beschreven in stap 1.2. </li><li> Kloon TCR gen in gedigereerde vector combineert elke lineaire fragment met in de handel verkrijgbare plasmidesamenstel hoofdmengsel reagens en incuberen bij 50 ° C gedurende 1 uur. OPMERKING: Raadpleeg het protocol van de fabrikant voor de relatieve hoeveelheden van elke component. Deze montagemethode is gebaseerd op de techniek die oorspronkelijk is beschreven door Gibson et al. 10. </li><li> (Optioneel) Tag TCR gen markeren getransduceerde cellen met de afgeknotte vorm van humane zenuwgroeifactor receptor (ΔNGFR, aminozuren 1-277) 11 gescheiden door furine splitsingsplaats, serine-glycine-linker en 2A sequenties 12,13. Ontwerp primers coderende sequenties overlappen het fragment eindigt en assembleren plasmide zoals beschreven in de stappen 1,3-1,5. LET OP: Deze sequenties kunnen worden gevonden in de referenties 11-13. </li><li> Transformeer chemisch competente E. coli met geassembleerde plasmide na 14 protocol van de fabrikant. Zaad getransformeerde bacteriën op agarplaten (20 mg / ml lysogenie bouillon (LB), 15 mg / ml agar en 1 ug / ml ampicilline) en incubeer bij 37 ° C gedurende 18 uur. </li&gt; <li> Cultuur één bacterie kolonie in 50 ml LB medium (20 mg / ml LB en 1 ug / ml ampicilline) gedurende 16 uur in een schudincubator bij 37 ° C en 200 toeren per minuut. </li><li> Zuiver plasmiden behulp van commercieel verkrijgbare kits Midiprep volgende protocol van de fabrikant. Verdun plasmide concentratie van ongeveer 1 ug / ul. OPMERKING: Het plasmide zuiveringsprotocol gebaseerd op de alkalische extractiewerkwijze 15. </li></ol> 2. Het genereren van stabiele verpakkende cellijn OPMERKING: Zowel 293GPG en PG13 cellen hechtende. Kweekcellen in Dulbecco&#39;s Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS) en 50 ug / ml gentamicine. Cultuur 293GPG cellen met 1 ug / ml tetracycline voor transfectie. Incubeer cellen bij 37 ° C met 5% CO 2 tussen alle stappen. <ol><li> Transfecteren 293GPG inpakcellen 16 gekweekt in T75 fles met de hemichain-encoding vector verkregen in stap 1.9, using handel verkrijgbare transfectiereagens volgende protocol van de fabrikant 1 7. OPMERKING: Transfecteren 293GPG cellen bij 50-60% confluentie. </li><li> Zuig medium voor 293GPG cellen en voeg 10 ml vers DMEM medium 1 dag na transfectie. </li><li> Harvest transient geproduceerde virus uit getransfecteerde 293GPG cellen 2 dagen na stap 2.2 door de overdracht van kweekmedium spuit en door 0,45 pm filter. OPMERKING: Virus kan onmiddellijk worden gebruikt of opgeslagen bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. </li><li> Cultuur 1 x 10 5 cellen in PG13 T25 fles. Aantal cellen met een hemocytometer. Na een dag, aspireren kweekmedium en voeg 1,5 ml 293GPG afgeleide virus van stap 2,3 en 1,5 ml DMEM medium met 8 ug / ml polybreen. </li><li> Verander het medium zoals beschreven in stap 2,4 keer per dag gedurende 4 dagen, PG13 stabiele verpakkingscellijn produceert retrovirus dat codeert voor de TCR hemichain plaats vast. </li><li> Zuig medium en vervangmet verse DMEM medium voor PG13 cellijnen 24 uur na de laatste infectie voor verdere cultuur. LET OP: Freeze of subcultuur cellen door het losmaken met 0,05% trypsine-EDTA-oplossing. </li><li> Virus van PG13 getransduceerde cellijnen, cultuur 2 x 10 6 cellen in T75 kolf met 10 ml DMEM medium en oogsten virus produceren zoals beschreven in stap 2.3 drie dagen na het zaaien van de cellen. OPMERKING: Virus best onmiddellijk gebruikt, maar tot twee maanden kunnen worden bewaard bij -80 ° C. </li></ol> 3. Activering en transductie van menselijke T-cellen LET OP: De menselijke monsters worden verkregen en gebruikt in overeenstemming met de institutionele ethische commissie goedgekeurd protocollen. Kweken primaire humane cellen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium aangevuld met 10% humaan serum in plaats van FCS en 50 ug / ml gentamicine. Incubeer cellen bij 37 ° C met 5% CO 2 tussen alle stappen. <ol><li> Isoleer humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) van dichtheidgradiëntscheiding volgende protocol van de fabrikant 18. </li><li> Activeren van T-cellen om proliferatie vereist voor retrovirale infectie veroorzaken. Cultuur 2 x 10 7 verse of ontdooide PBMC per putje in 6-well plaat, in 5 ml RPMI-medium met 100 IU / ml recombinant humaan interleukine-2 (rhIL-2) en 50 ng / ml anti-CD3 monoklonaal antilichaam (kloon OKT3). </li><li> Drie dagen na stimulering, laat T-cellen door pipetteren en centrifugeer bij 350 xg gedurende 4 min. Verwijder het supernatant en zaden 0,5-1 x 10 6 T cellen per putje in 24-putjes plaat gehersuspendeerd in 1 ml PG13 virus van stap 2,7, en 1 ml RPMI medium aangevuld met 200 IU / ml rhIL-2. Centrifugeer plaat bij 1000 x g en 32 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Na 24 uur, laat T-cellen door pipetteren en centrifugeer bij 350 xg gedurende 4 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer cellen in 1 ml PG13 virus van stap 2,7, en 1 ml RPMI medium aangevuld met 200 IU / ml rhIL-2. Herhaal deze procedure voor een totaal van 6 infectionen. Opmerking: aantal infecties worden geoptimaliseerd afhankelijk titer van virus door verpakkingscellijn. Eventueel passage T-cellen door het verwijderen van 20-30% van de cellen elke dag om overgroei te voorkomen. </li><li> 24 uur na de laatste besmetting, laat T-cellen door pipetteren en centrifugeer bij 350 xg gedurende 4 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer cellen in RPMI-medium met 100 IU / ml rhIL-2 voor verdere kweek. </li><li> 2-3 dagen na stap 3,5, vlek T-cellen met HLA multimeer bij 4 ° C gedurende 30 min, vervolgens anti-humaan CD3 en co-receptor monoklonale antilichamen (mAbs) bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Analyseren door flowcytometrie. Gebruik irrelevant multimeer en / of niet getransduceerde cellen als negatieve controle (Figuur 1-3) 19. </li><li> Als de ingevoerde centric hemichain een TCRα keten analyseren Vp gebruik van de novo multimeer positieve cellen met behulp van commercieel verkrijgbaar Vp-antilichaam panel door 20 flowcytometrie. </li></ol> 4. Klonering De Novo TCR Counter-hemichains <ol><li> Sorteer de novo multimeer positieve populatie in stap 3.6 door-stroming bijgestaan celsortering. </li><li> Isoleren van RNA gesorteerd T cellen met behulp van de zure guanidinium thiocyanaat-fenol- chloroform extractie methode 21,2 2. OPMERKING: RNA kan worden opgeslagen bij -80 ° C, maar moeten worden gebruikt om cDNA te genereren zo spoedig mogelijk. </li><li> Synthetiseren cDNA-bibliotheek van RNA geëxtraheerd met behulp van commercieel beschikbare reverse transcriptase-PCR kit volgens het protocol van de fabrikant 23,24. </li><li> Als het klonen TcR contra-ketens, ontwerpen Vp-gen en TcR constante gebied van specifieke primers, zoals bepaald in stap 3.7, en kloon full-length TcR genen als in stappen 1,3-1,9 beschreven. Zie stap 4.5 als contra-keten is TCRα, anders verder met stap 5.1. </li><li> Commercieel verkrijgbare Va-specifieke antilichamen worden beperkt, waardoor Va gengebruik kan nietbepaald door flow cytometrie. Clone TCRα contra-ketens via 5&#39;-snelle amplificatie van cDNA-uiteinden (RACE) 25, met behulp van in de handel verkrijgbare 5 &#39;RACE kits 6. <ol><li> Synthetiseren 5 &#39;RACE compatibel cDNA uit RNA geëxtraheerd in stap 4.2 volgende protocol van de fabrikant. </li><li> Voer 1 st door PCR zoals beschreven in tabel 2. </li><li> Voer elektroforese van het PCR-product en elueer band van ongeveer 1100 bp, zoals beschreven in stap 1.2. </li><li> Voer 2 nd door PCR zoals beschreven in Tabel 3, middels 1 st round PCR-product als matrijs. LET OP: Primer sequenties weergegeven in tabel 3 zijn ontworpen voor het kloneren in EcoRI en Notl geknipt PMX vector. </li><li> Voer elektroforese van het PCR-product en elueer band van ongeveer 1000 bp, zoals beschreven in stap 1.2. </li><li> Clone TCRα genen in EcoRI en Notl geknipt PMX vector en Purify plasmiden zoals beschreven in de stappen 1,5-1,9. </li></ol></li></ol> 5. reconstitueren Novel Antigeen-specifieke TCR Clones OPMERKING: Culture Jurkat cellen 76 en volgende cellijnen in RPMI medium aangevuld met 10% FCS en 50 ug / ml gentamicine. Incubeer cellen bij 37 ° C met 5% CO 2 tussen alle stappen. <ol><li> Transduceren Jurkat 76 cellen 26 (of gelijkwaardig TCR - / - menselijke T-cellijn) met centrische TCR hemichain behulp 293GPG virus geproduceerd in stap 2.3. Voor Jurkat 76, zaad 5 x 10 4 cellen per putje in 24-well plaat met 1 ml virus en 1 ml RPMI medium. Centrifugeer plaat bij 1000 x g en 32 ° C gedurende 1 uur. </li><li> 24 uur na infectie, verzamelen hemichain getransduceerde Jurkat-cellen 76 door pipetteren en centrifugeer bij 350 xg gedurende 4 min. Gooi supernatant en resuspendeer in verse RPMI medium voor verdere cultuur. </li><li> Zuiver getransduceerde cellen als de hemichain is moleculair gelabeld 2-3 dagen na stap 5.2, door vleking met fluorofoor geconjugeerd anti-NGFR mAb gevolgd door-stroming bijgestaan of magnetische-geassisteerde celsortering (optioneel) 27. </li><li> De volgende stappen 2,1-2,3, produceren 293GPG virus dat codeert voor een TCR contra-keten gekloond uit stappen 4.4 of 4.5. </li><li> Om volledig te reconstrueren de TCR, transduceren T-cellijn stabiel tot expressie de centric TCR hemichain gegenereerd in de stappen 5,1-5,3 met behulp van virus uit stap 5.4. Voer transductie zoals beschreven in de stappen 5,1-5,2. </li><li> Zuiver CD3 + transfectanten middels anti-CD3 magnetische ondersteunde celsortering volgende protocol van de fabrikant, 2-3 dagen na stap 27 5,5. </li><li> Om antigeenspecificiteit valideren vlekken de transfectanten expressie clonotypic TCRs bestaande uit centric TCR hemichain gekoppeld aan verschillende contra-ketens met anti-CD3 en / of co-receptor mAb en HLA multimeer 3-5 dagen na CD3 zuivering. Analyseer cellen door flowcytometrie (Figuur 4-5) 19. </li></ol>

<ol><li>Maus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+for+cancer+or+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy for cancer or viruses.</a> Annu. Rev. Immunol. 32, 189-225 (2014).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. Predominant role of T cell receptor (TCR)-alpha chain in forming preimmune TCR repertoire revealed by clonal TCR reconstitution system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYokosuka%2C+T+%22J.Exp.Med%22">J.Exp.Med</a>. , 195, 991-1001 (2002).</li>
<li>Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+TCRs+bind+MHCs%2C+peptides%2C+and+coreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">How TCRs bind MHCs, peptides, and coreceptors.</a> Annu. Rev. Immunol. 24, 419-466 (2006).</li>
<li>Shimizu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+TCR+and+antigen+complexes+at+an+immunodominant+CTL+epitope+in+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Structure of TCR and antigen complexes at an immunodominant CTL epitope in HIV-1 infection.</a> Sci. Rep. 3, 3097(2013).</li>
<li>Nakatsugawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+roles+of+each+TCR+hemichain+in+generating+functional+chain-centric+TCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Specific roles of each TCR hemichain in generating functional chain-centric TCR.</a> J. Immunol. 194 (7), 3487-3500 (2015).</li>
<li>Ochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+T-cell+Reactivity+by+Exploiting+TCR+Chain+Centricity+for+the+Purpose+of+Safe+and+Effective+Antitumor+TCR+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Res%22%5BJournal%5D)">Optimization of T-cell Reactivity by Exploiting TCR Chain Centricity for the Purpose of Safe and Effective Antitumor TCR Gene Therapy.</a> Cancer Immunol. Res. 3 (9), 1070-1081 (2015).</li>
<li>Chamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDR3beta+sequence+motifs+regulate+autoreactivity+of+human+invariant+NKT+cell+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">CDR3beta sequence motifs regulate autoreactivity of human invariant NKT cell receptors.</a> J. Autoimmun. 68, 39-51 (2016).</li>
<li>Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+plasmid+vectors+expressing+FLAG-tagged+proteins+under+the+regulation+of+human+Elongation+Factor-1%CE%B1+promoter+using+Gibson+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human Elongation Factor-1α promoter using Gibson Assembly.</a> J. Vis. Exp. (96), e52235(2015).</li>
<li>Beshiri, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+using+ChIP+to+identify+isoform-specific+gene+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis using ChIP to identify isoform-specific gene targets.</a> J. Vis. Exp. (41), e2101(2010).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Johnson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+structure+of+the+human+NGF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression and structure of the human NGF receptor.</a> Cell. 47 (4), 545-554 (1986).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PloS one. 6, e18556(2011).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+optimal+bicistronic+lentiviral+vectors+facilitates+high-level+TCR+gene+expression+and+robust+tumor+cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition.</a> Gene Ther. 15 (21), 1411-1423 (2008).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J. Vis. Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Birnboim, H. C., Doly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+alkaline+extraction+procedure+for+screening+recombinant+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).</li>
<li>Ory, D. S., Neugeboren, B. A., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+human-derived+packaging+cell+line+for+production+of+high+titer+retrovirus%2Fvesicular+stomatitis+virus+G+pseudotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A stable human-derived packaging cell line for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (21), 11400-11406 (1996).</li>
<li>Imataki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+can+supplement+suboptimal+Lck-independent+MAPK+activation+in+a+STAT-3-dependent+manner+in+human+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-21 can supplement suboptimal Lck-independent MAPK activation in a STAT-3-dependent manner in human CD8(+) T cells.</a> J. Immunol. 188 (4), 1609-1619 (2012).</li>
<li>Davies, J. K., Barbon, C. M., Voskertchian, A. R., Nadler, L. M., Guinan, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+alloantigen-specific+anergy+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+by+alloantigen+stimulation+with+co-stimulatory+signal+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction of alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells by alloantigen stimulation with co-stimulatory signal blockade.</a> J. Vis. Exp. (49), e2673(2011).</li>
<li>Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+immune+cells+within+murine+aortas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas.</a> J. Vis. Exp. (53), e2848(2011).</li>
<li>Butler, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+antitumor+memory+in+humans+using+in+vitro-educated+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Establishment of antitumor memory in humans using in vitro-educated CD8+ T cells.</a> Sci. Transl. Med. 3 (80), 80ra34(2011).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal. Biochem. 162 (1), 156-159 (1987).</li>
<li>Peterson, S. M., Freeman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+isolation+from+embryonic+zebrafish+and+cDNA+synthesis+for+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">RNA isolation from embryonic zebrafish and cDNA synthesis for gene expression analysis.</a> J. Vis. Exp. (30), e1470(2009).</li>
<li>Ying, S. Y. Complementary DNA Libraries. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYing%2C+SY+%22Generation+of+cDNA+Libraries%3A+Methods+and+Protocols%22">Generation of cDNA Libraries: Methods and Protocols</a>. Ying, S. Y. 221, Humana Press. 1-12 (2003).</li>
<li>Hirano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engagement+of+CD83+ligand+induces+prolonged+expansion+of+CD8%2B+T+cells+and+preferential+enrichment+for+antigen+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engagement of CD83 ligand induces prolonged expansion of CD8+ T cells and preferential enrichment for antigen specificity.</a> Blood. 107 (4), 1528-1536 (2006).</li>
<li>Scotto-Lavino, E., Du, G., Frohman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27+end+cDNA+amplification+using+classic+RACE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">5' end cDNA amplification using classic RACE.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 2555-2562 (2006).</li>
<li>Heemskerk, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirection+of+antileukemic+reactivity+of+peripheral+T+lymphocytes+using+gene+transfer+of+minor+histocompatibility+antigen+HA-2-specific+T-cell+receptor+complexes+expressing+a+conserved+alpha+joining+region%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redirection of antileukemic reactivity of peripheral T lymphocytes using gene transfer of minor histocompatibility antigen HA-2-specific T-cell receptor complexes expressing a conserved alpha joining region.</a> Blood. 102 (10), 3530-3540 (2003).</li>
<li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+cell+sorting+and+flow+cytometry+sorting+methods+for+the+isolation+and+function+analysis+of+mouse+CD4%2B+CD25%2B+Treg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Zhejiang+Univ.+Sci.+B%22%5BJournal%5D)">Magnetic cell sorting and flow cytometry sorting methods for the isolation and function analysis of mouse CD4+ CD25+ Treg cells.</a> J. Zhejiang Univ. Sci. B. 10, 928-932 (2009).</li>
<li>Padovan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+two+T+cell+receptor+alpha+chains%3A+dual+receptor+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression of two T cell receptor alpha chains: dual receptor T cells.</a> Science. 262 (5132), 422-424 (1993).</li>
<li>Johnson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transfer+of+tumor-reactive+TCR+confers+both+high+avidity+and+tumor+reactivity+to+nonreactive+peripheral+blood+mononuclear+cells+and+tumor-infiltrating+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes.</a> J. Immunol. 177 (9), 6548-6559 (2006).</li>
<li>Chinnasamy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TCR+targeting+the+HLA-A%2A0201-restricted+epitope+of+MAGE-A3+recognizes+multiple+epitopes+of+the+MAGE-A+antigen+superfamily+in+several+types+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A TCR targeting the HLA-A*0201-restricted epitope of MAGE-A3 recognizes multiple epitopes of the MAGE-A antigen superfamily in several types of cancer.</a> J. Immunol. 186 (2), 685-696 (2011).</li>
</ol>

Het University Health Network heeft een octrooi ingediend met betrekking tot deze methodologie waarop N.H., M.N. en T.O. als uitvinders zijn genoemd. De andere auteurs hebben geen financiële belangenconflicten.

De eerste vereiste voor succesvolle toepassing van deze werkwijze is het bereiken van voldoende transductie efficiëntie van de primaire T-cellen met de hemichain plaats. In onze ervaring, de combinatie van het gebruik van PG13 als verpakkingscellijn en retrovirale vector pmx als resultaten in een stabiele en efficiënte expressie van het geïntroduceerde gen in primaire T-cellen. PG13 packaging cellen kunnen eencellige gekloond om te selecteren op hoge titer inpakcellen transductie efficiëntie verbeteren. Bovendien is de ...

T-celreceptoren (TCR&#39;s) zijn heterodimere adaptieve immuun receptoren door T-lymfocyten tot expressie gebracht, bestaande uit een TCRα en TcR keten. Ze optreden via somatische herschikking van V (D) J-gensegmenten, die een zeer divers repertoire kan herkennen vrijwel onbegrensde configuratie van HLA / peptide-complexen produceert. Klinisch T cellen ontworpen om clonotypic TCRs die specifiek zijn voor met tumor geassocieerde antigenen tot expressie aangetoond werkzaamheid bij verschillende kankers 1. Veel TCRs gekloneerd hiertoe onvoldoende affiniteit voor het antigeen van belang, waardoor hun therapeutische toepassing te beperken. We beschrijven een werkwijze om deze beperking te overwinnen bestaande TCRs door gebruik keten centricity. Vermeld is dat een TCR hemichain een dominante rol in herkenning van het doelantigeen 2 kan spelen, hier genoemd centraal stellen. Crystal structurele analyses blijkt dat een centraalhemichain van een TCR kan verantwoordelijk voor het merendeel van de voetafdruk op het MHC / peptidecomplex 3,4. Dit begrip te gebruiken, hebben we eerder aangetoond dat het SIG35α TCRα kan koppelen met een divers repertoire van TcR ketens en onderhouden reactiviteit tegen MART1 27-35 peptide gepresenteerd door HLA-A2 5. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met de TCR TAK1, waarbij de centrische TcR hemichain gekoppeld aan allerlei TCRα ketens en onderhouden reactiviteit voor WT1 235-243 peptide gepresenteerd door HLA-A24 6. Zowel MART1 en WT1 zijn tumor-geassocieerde antigenen. Chain-centricity werd ook toegepast op antigeen erkenning van CD1d-beperkte invariante natural killer (iNKT) TCR&#39;s te bestuderen, door het koppelen van de invariante Vα24-Jα18 (Vα24i) TCRα keten van humaan iNKT TCR&#39;s met verschillende Vβ11 TcR ketens 7. In alle gevallen konden we een de novo repertoire van TCRs genereren van transducing de centric TCR hemichain perifere bloed T-cellen, waarbij het ingebrachte hemichain gepaard met de endogene TCRα of TcR contra-ketens. In wezen centric hemichain dient als lokaas die kan worden gebruikt om de juiste contra-ketens, die bij elkaar gekoppelde vormen TCRs die de antigeenspecificiteit van belang, maar variërend in affiniteit te identificeren. Van deze nieuwe repertoires, waren we in staat om clonotypic TCR&#39;s te isoleren met een verbeterde interactie sterkte tegen het doelantigeen in vergelijking met reeds bestaande TCR&#39;s. Daarom geloven wij deze methode zal de pijpleiding identificeren optimale TCR&#39;s voor klinische toepassing te versnellen.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>325-043-CL</td><td></td></tr><tr><td>293GPG cellen</td><td>Gemaakt door Ory et al. (ref 8)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-010-CG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-015-CG</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline natriumzout</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>400-110-IG</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>BioShop</td><td>CCL402</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) oplossing mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoge glucose, pyruvaat</td><td>Life Technologies</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>EZ-10 Spin Column DNA Gel Extractie Kit</td><td>BS353</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Life Technologies</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Corning</td><td>431220</td><td>0.45 mm porie SFCA membraan</td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerd anti-menselijke CD271 (NGFR) mAb</td><td>Biolegend</td><td>345104</td><td>clone ME20.4</td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerd anti-menselijk CD3 mAb</td><td>Biolegend</td><td>300440</td><td>clone UCHT1</td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Life Technologies</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611L</td><td>gebruikt voor multi-piece DNA assemblage</td></tr><tr><td>HLA-A2 pentameer</td><td>Proimmune</td><td>afhankelijk van antigeen peptide</td><td>HLA-A2/MART1 multimeer gebruikt hier werd gekocht van Proimmune</td></tr><tr><td>HLA/CD1d monomeren</td><td>NIH Tetramer Core Facility</td><td></td><td>multimeer monomeren volgens het protocol dat wordt verstrekt door NIH tetramer core facility</td></tr><tr><td>Humaan AB serum</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>menselijke CD3 microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-101</td><td></td></tr><tr><td>IOTest Beta Mark TCR V beta Repertoire Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM3497</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat 76 cellen</td><td>Gemaakt door Heemskerk et al. (ref 10)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>800-060-LG</td><td></td></tr><tr><td>LS MACS kolom</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td>gebruikt voor EcoRI en NotI digestie</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td>gebruikt voor plasmide zuivering</td></tr><tr><td>PC5-geconjugeerd anti-menselijk CD8 mAb</td><td>Beckman Coulter</td><td>B21205</td><td>clone B9.11</td></tr><tr><td>PG13 cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-10686</td><td></td></tr><tr><td>Phusion HF Buffer Pack</td><td>New England Biolabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion&nbsp;High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>pMX retrovirale vector</td><td>Cell Biolabs</td><td>RTV-010</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-9268</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin (recombinant humaan interleukine-2)</td><td>Novartis</td><td>alleen op recept</td><td>gelijkwaardig product kan worden gekocht bij Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Gezuiverde anti-menselijke CD3 antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>317301</td><td>clone OKT3, gebruikt voor T-cel stimulatie</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>SA-PE</td><td>Life Technologies</td><td>S866</td><td>gebruikt voor het multimeriseren van monomeren van NIH tetramer core facility</td></tr><tr><td>SMARTer RACE 5'/3'&nbsp; Kit</td><td>Clontech</td><td>634858</td><td></td></tr><tr><td>Steriele water</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>809-115-LL</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesesysteem</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td>voor cDNA synthese</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>BD</td><td>301604</td><td>10 ml, slip tip</td></tr><tr><td>Tetracycline hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-293</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2700</td><td>gebruikt om 293GPG cellen te transfecteren</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td></td></tr></tbody></table>

generating<em&gt; de novo</em&gt; antigeen-specifieke menselijke t-cel receptoren door retrovirale transductie van centric hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T-celreceptoren (TCR&#39;s) worden klinisch gebruikt om de specificiteit van T-cellen direct naar tumoren te richten als een veelbelovende modaliteit van immunotherapie. Daarom heeft TCRs klonen specifiek voor verschillende tumor-geassocieerde antigenen het doel van vele studies. Een effectieve T-cel op te wekken, moet de TCR het doelantigeen optimale affiniteit herkennen. Echter, klonen dergelijke TCRs uitdaging en vele beschikbare TCRs geweest bezitten suboptimaal affiniteit voor de verwante antigeen. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het kloneren van de novo hoge affiniteit antigeenspecifieke TCRs Bestaande TCRs door gebruik hemichain centricity. Het is bekend dat sommige TCRs, elk TCRα of TcR hemichain niet gelijk bijdragen aan antigeen herkenning, en de dominante hemichain wordt aangeduid als centraal hemichain. We hebben aangetoond dat door het koppelen van de centrische hemichain met tegenstroom ketens verschillen van de oorspronkelijke contra-keten, kunnen wij het antigeen en handhavenpecificity, terwijl de interactie moduleren kracht voor de verwant antigeen. Aldus kan het therapeutisch potentieel van een bepaalde TCR worden verbeterd door het optimaliseren van de koppeling tussen de centrische en tegen hemichains.

Zonder voorkennis waarvan hemichain is keten-centric, de TCRα en TcR keten afzonderlijk worden gekloneerd en getransduceerd perifere bloed T-cellen, die werd uitgevoerd bij HLA-A24 / WT1 reactieve TAK1 TCR (figuur 1). Transductie van TAK1β leverde een aanzienlijk hogere frequentie van antigenspecifieke T-cellen. Omgekeerd transductie van een non-centric hemichain niet op de novo multimeer positieve T-cellen, zoals gezien met TAK1α keten (figuur 1).</stro...

Hierin beschrijven we een nieuwe methode om antigeenspecifieke T-celreceptoren (TCR&#39;s) door het koppelen van de TCRα of TcR van een bestaande TCR, bezit de antigeen-specificiteit van interesse, met aanvullende hemichain van de perifere T-cel receptor repertoire genereren. De novo geproduceerde TCRs behouden antigeen-specificiteit met verschillende affiniteit.

Generating<em&gt; De Novo</em&gt; Antigeen-specifieke menselijke T-cel receptoren door Retrovirale Transductie van Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Het algemene doel van deze experimentele procedure is het genereren van de novo T-celreceptoren of TCR's die een specifiek antigeen van belang herkennen. Deze methode kan helpen bij het isoleren van optimale T-celreceptoren binnen het vakgebied van gen-engineered immunotherapie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er slechts een enkele alfa- of bèta-hemiketting geïsoleerd hoeft te worden om nieuwe antigeenspecifieke T-celreceptoren te genereren.Na het elueren van het TCR-PCR-product wordt het gen gekloneerd door elk lineair fragment te combineren met een commercieel verkrijgbare assembly master mix en het mengsel gedurende één uur te incuberen bij 50 °C. Na afloop van de incubatie worden chemisch competente E. coli getransformeerd met het geassembleerde plasmide volgens het protocol van de fabrikant, waarna de getransformeerde bacteriën op agarplaten worden gezaaid voor een incubatie van 18 uur bij 37 °C. De volgende dag wordt een enkele bacteriële kolonie overgebracht naar 50 mL lysogeny broth-medium voor 16 uur in een schudincubator bij 37 °C en 200 rpm.Zuiver vervolgens het plasmide met een commercieel verkrijgbare Midiprep-kit, volgens het protocol van de fabrik

generating-de-novo-antigen-specific-human-t-cell-receptors-retroviral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We presenteren een protocol om antigeen-specifieke muis T-cellen te produceren met behulp van retrovirale...

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

Een snelle, eenvoudige en kosteneffectieve protocol voor het genereren van donor-afgeleide multivirus-specifieke CTL (rCTL) voor infusie aan allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) ontvangers risico op het ontwikkelen CMV, Adv of EBV infecties. Dit productieproces is GMP-compliant en moet zorgen voor de bredere implementatie van T-cel-immunotherapie voorbij gespecialiseerde centra.

Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie

This video demonstrates a technique to manufacture chimeric antigen receptor (CAR) T cells ex vivo. Human T cells are incubated with magnetic beads coated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, along with a medium supplemented with interleukin-2 (IL-2), leading to T cell activation and proliferation. Transgenic lentiviral vectors are introduced, allowing the transgenic RNA to integrate into the host genome and express the transgene. This results in the transduced T cells expressing chimeric...

An Ex Vivo Technique to Manufacture Chimeric Antigen Receptor T Cells

This video demonstrates a technique for generating antigen-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells through retroviral transduction. Activated murine CD8+ T cells are added to a microwell plate coated with recombinant fibronectin fragments. Retroviral vectors containing transgenic RNA encoding an antigen-specific chimeric antigen receptor (CAR) are then introduced, and the plate is centrifuged to facilitate transduction. After incubation, the transduced cells express antigen-specific...

A Technique for the Generation of Antigen-Specific CAR T Cells

Adenovirale genoverdracht in naïeve CD4 T-cellen met transgene expressie van de Coxsackie adenovirus receptor kan de moleculaire analyse van regulatoire T...

Adenovirale transductie van Naïeve CD4 T-cellen aan Treg Differentiatie Studie

Dit artikel beschrijft een methode voor de generatie en proliferatie van humane T-celklonen die specifiek reageren op een gedefinieerd allo-antigen. Dit protocol kan worden aangepast voor het klonen van humane T-cellen die specifiek zijn voor een verscheidenheid aan peptide-MHC-liganden.

Genereren van menselijke allogeen-specifieke T-cellen uit perifeer bloed

We presenteren een snel en flexibel protocol voor een enkelvoudig T-celreceptor (TCR) retroviraal-gebaseerd in vivo expressiesysteem.  Retrovirale vectoren worden gebruikt om beenmerg-progenitorchellen te transduceren om T-celontwikkeling en functie van een enkele TCR in vivo te bestuderen als een alternatief voor TCR-transgene muizen.

Retrovirale Transductie van beenmerg stamcellen voor het genereren van T-cel Receptor Retrogenic Muizen

De huidige protocol combineert eencellige gekoppeld menselijke TCR alpha en beta keten sequencing met gestroomlijnd generatie van retrovirale vectoren compatibel met in vitro en in vivo TCR expressie.

Gestroomlijnd eencellige TCR isolatie en generatie van retrovirale vectoren voor In Vitro en In Vivo expressie van menselijke TCRs

Dit protocol stroomlijnt de productie van retrovirale vectoren en de transductie van T-cellen bij muizen, waardoor de efficiënte generatie van CAR-T-cellen van muizen wordt vergemakkelijkt.

Efficiënte generatie van muizen chimere antigeenreceptor (CAR)-T-cellen

Dit protocol biedt een gestroomlijnde workflow voor het genereren en testen van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen (CAR Tregs).

Generatie van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen

Er is een gedetailleerd protocol voorzien voor het gebruik van CRISPR/Cas9-technologie om zeer efficiënte, gerichte knock-in van grote, multicistronische constructies in primaire menselijke T-cellen te bereiken via de homologie-gemedieerde eindjoining (HMEJ) DNA-reparatieroute. T-cellen die met dit cGMP-aanpasbare protocol zijn ontwikkeld, behouden een uitstekende celexpansie, cytotoxiciteit en cytokineproductie.

Niet-virale engineering van primaire menselijke T-cellen via homologie-gemedieerde end-joining gerichte integratie van grote DNA-sjablonen

Leer hoe u de novo antigeen-specifieke T-celreceptoren genereert door retrovirale transductie van centric hemiketens. Deze methode vereenvoudigt TCR-isolatie voor gentherapie en immunotherapie.

Generating

Meer video's verkennen