Name: Een muizenmodel van groep B Streptococcus Vaginale Kolonisatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Leer een muizenmodel voor vaginale kolonisatie van groep B Streptococcus (GBS) om gastheer-pathogeen interacties en therapeutische strategieën te bestuderen. Deze methode bereikt meer dan 90% kolonisatie zonder verdoving.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen de vivariummanager en het personeel van de San Diego State University bedanken voor hun ondersteuning bij de dierverzorging. Tijdens dit werk werd K.A.P. ondersteund door een ARCS-beurs en een fellowship van de Inamori Foundation. K.S.D. wordt ondersteund door een R01-subsidie, NS051247, van de National Institutes of Health.

Alle dierlijke werk werd goedgekeurd door het Bureau van Lab Animal Care in San Diego State University en uitgevoerd onder aanvaarde veterinaire normen. Vrouwelijke muizen, leeftijd 8-16 weken werden gebruikt voor de ontwikkeling van deze methode. 1. Voorbereiding en intraperitoneale injectie van β-estradiol <ol><li> Meet β-estradiol (0,5 mg / muis) op weeg papier, terwijl het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM). LET OP: β-oestradiol kan worden geabsorbeerd door de huid en slijmvliezen. </li><li> Transfer β-estradiol een 15-ml conische buis en vortex totdat alle klonten worden verwijderd en de β-estradiol is een fijn poeder. Het opstellen van sesamolie (100 pl / muis) in een 10-ml spuit. Spuit-filter sesamolie in de 15 ml conische buis met het β-estradiol met een 0,45 urn filter. Vortex de 15-ml conische buis dienovereenkomstig β-estradiol is een homogene suspensie in de sesamolie. </li><li> Het opstellen van de β-estradiol suspensie in een nieuwe 10-ml spuit. Met een 18 G, 1-in. naald, monster 100 ul van de suspensie in de 1-ml tuberculine injectiespuiten. Bereid een spuit voor elke muis. Plaats een nieuwe, steriele 26 G, ½-in. naald op elk tuberculine spuit. </li><li> Dien 0,5 mg van het β-estradiol gesuspendeerd in 100 ui sesamolie (5 mg / ml) aan elke muis 24 uur vóór bacteriële inoculatie. Injecteer elke muis in de buikholte, in de onderbuik kwadranten, net rechts of links van de middellijn, zoals eerder beschreven 28. OPMERKING: Geen schoonmaak of knippen van de plaats van injectie nodig is. </li></ol> 2. Vaginale Inenting met GBS <ol><li> Eén dag voor enting, groeien een 5-ml overnacht vloeibare cultuur van een GBS-stam van belang, zoals de A909 (serotype Ia), in Todd Hewitt bouillon (THB) bij 37 ° C. </li><li> Subcultuur de GBS overnacht cultuur op een 01:10 volume in de frisse mensenhandel en incubeer bij 37 ° C. groeien debacterie tot mid-log-fase (OD 600 = 0,4-0,5). LET OP: Dit zal meestal duren 2-3 uur, afhankelijk van de stam van de GBS. </li><li> Breng de subcultuur een steriele 15 ml conische buis en pellet bacteriën bij 3000 xg gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant. Resuspendeer de bacteriële pellet in 200 ui steriel fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Met de geresuspendeerde pellet, breng 3-5 ml PBS (1 ml per 10 muizen) precies OD 600 = 0,4 in een nieuwe cultuurbuis 5 ml. Dit zal een concentratie van 1 x 10 ~ 8 kolonievormende eenheden (CFU) / ml. Transfer naar een nieuwe 15 ml conische buis en opnieuw pellet de bacteriën bij 3000 x g gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant. </li><li> Resuspendeer de pellet in PBS bij 1/10 van het oorspronkelijke volume. Wanneer bijvoorbeeld 3 ml OD 600 = 0,4 werd gepelleteerd, opnieuw in suspensie vervolgens in 300 gl PBS. Opmerking: Dit is de laatste bacteriesuspensie (~ 1 × 10 9 CFU / ml) gebruikt voor dierlijke inoculatie. </li><li> Reserve 50 ul van deze suspensie voor seriële verdunning en uitplaten op mensenhandel agar om de exacte entstof te bepalen. </li><li> Inoculeren elke muis met 10 ul van de uiteindelijke bacteriesuspensie zodat 1 x 10 7 CFU wordt toegediend aan elke muis. <ol><li> Om te enten, handmatig beperken de muis door het veiligstellen van de losse huid aan het nekvel tussen duim van de handler en wijsvinger en vervolgens het immobiliseren van de staart, zoals eerder 28 beschreven. </li><li> Opstellen 10 ul van de GBS bereid in stap 2.6 in een 200-ul gel laden pipetpunt. Breng de punt 5 tot 10 mm in het vaginale lumen en verdeel de 10 pl inoculum. OPMERKING: Gel plaatsen Tips voorkeur boven standaard 200-ul tips om het risico van trauma of letsel orgaan minimaliseren, vooral bij jonge muizen of kleiner. </li><li> Onmiddellijk na inenting, laat de nekvel en verheffen het achterste einde van de muis, het opheffen van de muis bij de staart en walking de voorpoten op een harde ondergrond voor ~ 1 min. </li><li> Inspecteer de vaginale opening voor eventuele terugstroom van entstof. Als terugstroom wordt waargenomen, kan een frisse pipettip worden gebruikt om te manipuleren of te vergroten de vaginale opening, het vergemakkelijken van de opname van het terugstromen in het lumen. Bovendien kan terugstroming worden afgezogen via een pipet en opnieuw geïnoculeerd. LET OP: Als het toedienen van lokale agenten, probiotische organismen, of eiwitten van belang, een volume tot 20 pi in een fysiologische buffer kan worden gegeven in de vaginale-darmkanaal. </li></ol></li></ol> 3. het schoonvegen van de Vaginale Lumen om GBS Load kwantificeren <ol><li> Bereid een 1,5-ml micro-centrifugebuis per muis door toevoeging van 100 pi PBS. Net voor zwabberen, pre-nat het staafje in PBS. </li><li> Beperken de muis zoals beschreven in stap 2.7.1 en plaats het staafje 10 mm in de vaginale lumen. Voorzichtig draai de swab 4 keer met de klok mee en 4 keer tegen de klok in, onder lichte druk om de vaginawand.</li><li> Breng het wattenstaafje om de 1,5-ml microcentrifuge buis met 100 ui PBS. Vóór plating, vortex de microcentrifugebuis van ~ 15 seconden om de bacteriën los te maken van het staafje. Serieel verdund elk monster in PBS en de plaat 20 pl verdunningen 1:10 tot 1: 10.000 voor de differentiële medium agarplaten bereid volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 24 uur. GBS kolonies zal ofwel fel roze of paars van kleur verschijnen. Andere endogene flora wordt geremd, of zal verschijnen als blauw, wit of grijs kolonies. </li></ol> 4. Het verzamelen van vaginale wasvloeistof <ol><li> Restrain de muis zoals beschreven in stap 2.7.1. Met behulp van een 200-gl gel-lading pipetpunt Pipetteer 20 ul PBS in de vaginale lumen. Voorzichtig pipet het volledige volume omhoog en omlaag 4 keer in het lumen, en vervolgens het gehele volume in dezelfde pipet tip in te trekken. OPMERKING: Als de spoelvloeistof is dik met slijm, een standaard 200 ul pipetpuntkan worden gebruikt om de uiteindelijke spoelvloeistof verzamelen. </li><li> Als het opslaan van lavage vloeistof voor cytokine analyse of CFU kwantificering, afzien in een 0,7 ml microcentrifugebuis. Indien het bepalen van het stadium van estrus afzien tenminste 5 ul lavage vloeistof op een glasplaatje en observeer de cellen onder 100x vergroting op een lichtmicroscoop. LET OP: Voor voorbeelden van estrous etappes, zie figuur 1. </li></ol> 5. Tissue Dissection en homogenisering <ol><li> Voor elke muis bereiden drie 2-ml schroefdopbuisjes (één voor elk weefsel: vagina, baarmoederhals en baarmoeder). Vul elke buis met voldoende (0,4-0,5 g) 1,0 mm zirkoniumoxide kralen om de kegelvormige bodem van de buis te dekken. </li><li> Autoclaaf de bereide buisjes voorafgaand aan het verzamelen van weefsel voor 30 min bij 121 ° C, vooral als kwantificeren bacteriële verontreiniging. Voeg 500 pl steriel PBS aan elke buis. Weeg elke buis na een autoclaaf en record voor toekomstig gebruik te vorderen weefsel gewicht te berekenen. </li><li&gt; Sacrifice de muis met behulp van goedgekeurde institutionele methoden zoals CO 2 stikken en cervicale dislocatie. Spuit langs de ventrale buik met 70% EtOH. Met een steriele schaar, open de abdominopelvic holte, til de rug huid en de buikspieren, en verdringen de darmen, zodat de voortplantingsorganen wordt blootgesteld. </li><li> Steriliseer de schaar met 70% EtOH, schoon te vegen indien nodig, en snijd beide baarmoederhoorns mid-lengte tussen de baarmoeder lichaam en eierstokken. Met een schaar en een tang, aparte visceraal vet, membranen, en de urineblaas weg van de voortplantingsorganen, bewegende caudaal. </li><li> Steriliseren schaar zoals beschreven in stap 5.4. Dwars doorgesneden de vagina zo dicht mogelijk bij de vulva mogelijk het voortplantingskanaal te scheiden van het lichaam. Til en verwijder de intacte voortplantingsorganen en plaats deze in een steriele petrischaal. </li><li> Met een nieuw scheermesje, scheiden de baarmoeder van de cervix in een dwarse snede. Steriliseer de scheermesje met 70%EtOH en vervolgens scheiden van de baarmoederhals van de vagina in een dwarse snede. NB: Er zal een minimale hoeveelheid van de baarmoeder weefsel nog aan de baarmoederhals worden. Er is een minimale hoeveelheid vaginaal weefsel nog aan de cervix is. </li><li> Met steriele tang, overdracht elk van de weefsels in hun respectievelijke 2-ml buisjes met PBS en homogeniseren kralen. Reinig de tang met 70% EtOH in tussen de behandeling van elk weefsel. </li><li> Weeg elk 2 ml schroefdop tube en aftrekken van het oorspronkelijke gewicht van de buis aan het weefsel gewicht te bepalen. Tissue gewichten meestal variëren tussen 20-100 mg. Goed af de schroefdopbuisjes en homogeniseer de weefsels gedurende 1 minuut bij maximale snelheid in een weefsel homogenisator. </li><li> Om bacteriële verontreiniging te kwantificeren, serieel verdunnen 25 pi van weefsel homogenaat en plaat verdunningen 01:10 door middel van 1: 10.000 op differentiële medium agarplaten. Incubeer de platen zoals beschreven in stap 3.3. Monsters voor cytokine kwantificering opslaan, bevriezen weefsel homogenaten bij -20 ° C. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Om de voortgang van het begrijpen van GBS interactie met zowel de gastheer en andere microben in het kader van de gastheer te bevorderen, wordt een diermodel vereist. Dit werk beschrijft de technische aspecten van de oprichting van GBS vaginale kolonisatie in muizen. Dit protocol realiseert&gt; 90% kolonisatie van muizen zonder het gebruik van anesthetica bacteriën enten of swabmonsters, immuun-onderdrukkende verzamelen om kolonisatie mogelijk, vaginale voorwassen of additieven voor het inoculum verdikken. Bovendien is ...

Streptococcus agalactiae, groep B Streptococcus (GBS), een ingekapselde, Gram-positieve bacterie die vaak wordt geïsoleerd uit de darm en urogenitale tractus van gezonde volwassenen. In de jaren 1970, GBS naar voren als de belangrijkste agent van besmettelijke neonatale sterfte, met meer dan 7.000 gevallen van neonatale ziekte jaarlijks 1. Early-onset GBS-infectie (EOD) komt in de eerste uren of dagen van het leven, ontstaat als longontsteking of ademhalingsproblemen, en vaak ontwikkelt tot sepsis, terwijl de late vorm van de ziekte (LOD) ontstaat na enkele maanden en presenteert met bacteriëmie, die vaak voorschotten aan meningitis 2. Met ingang van 2002, de Centers for Disease Control and Prevention beveelt universele screening voor GBS vaginale kolonisatie in de late zwangerschap en de bevalling antibioticaprofylaxe (IAP) naar GBS-positieve moeders 1. Ondanks het terugdringen van de vorm van de ziekte tot ongeveer 1000 gevallen in de Verenigde Staten jaarlijks door IAP,GBS blijft de belangrijkste oorzaak van vroege-onset neonatale sepsis, en late-onset optreden blijft onaangetast 1. Of het nu in de baarmoeder, tijdens de bevalling, of zelfs in late-onset gevallen, neonatale blootstelling aan GBS moet overleven, transversale via een aantal host-omgevingen en barrières, het immuunsysteem fraude, en, in het geval van meningitis, kruising van de sterk gereguleerde bloed- hersenbarrière 2. Stroomopwaarts van deze virulente interacties binnen de pasgeborene is de eerste kolonisatie van de maternale vaginale kanaal. Maternale GBS vaginale kolonisatie tarieven variëren 8-18% in de ontwikkelde landen en ontwikkelingslanden, met een geschatte gemiddelde van 12,7% 3,4. GBS kolonisatie van de vaginale-darmkanaal tijdens de zwangerschap kan constant, intermitterend of voorbijgaande aard onder individuele vrouwen 5 zijn. Interessant is dat een leeftijd van de moeder&gt; 36 jaar in verband met aanhoudende kolonisatie 6. Tal van biologische en sociaal-economische risicofactoren voor GBS vaginale kolonisatiegeïdentificeerd. Biologische factoren omvatten gastrointestinale GBS kolonisatie en afwezigheid van Lactobacillus in de darm. Echter, etniciteit, obesitas, hygiëne en seksuele activiteit ook in verband gebracht met GBS vaginale wagen 7. Hoewel bekend voor het veroorzaken neonatale infecties GBS veroorzaakt ook verschillende maternale infecties zowel peripartum en postpartum. GBS slede is verhoogd bij vrouwen presenteren met vaginitis 8 en in sommige gevallen zelfs het ziektebeeld 9 zijn. Bovendien kan GBS hemelvaart van de voortplantingsorganen tijdens de zwangerschap leiden tot een intra-amniotische infectie of chorioamnionitis 10. Bovendien, tot 3,5% van de zwangerschappen, GBS verspreidt de urineblaas een urineweginfectie of asymptomatische bacteriurie 11 veroorzaken. GBS bacteriurie tijdens de zwangerschap is geassocieerd met een verhoogd risico op de bevalling koorts, chorioamnionitis, vroeggeboorte en premature breken van de vliezen 12. Samengevat, is de aanwezigheid van GBS in de vaginale kanaal houden met ontstekingen meerdere gastheerweefsels, en de mogelijkheid om GBS elimineren van deze niche is noodzakelijk voor zowel maternale en neonatale gezondheid. Tot voor kort, de meeste werkzaamheden onderzoeken GBS interacties met de cervicovaginal tract werd alleen in vitro celmodellen 13-15. Deze in vitro experimenten bacteriële factoren die belangrijk zijn voor hechting zijn, waaronder oppervlakte-eiwitten bleek zo&#39;n pili en serine-rijke repeats 17,18, evenals twee componenten regelsystemen 15,19 en de globale transcriptionele respons van het vaginale epitheel GBS 19. Echter, de gastheer-microbe interacties volledig helderen binnen het vaginale kanaal, een robuuste diermodel noodzakelijk. Vroeg werk aangetoond dat GBS uit de vaginale landstreek van geënte muizen 20,21 en ratten kunnen worden hersteld &lt;sup&gt; 22 in zowel de zwangere en niet-zwangere omstandigheden. In 2005 werd op korte termijn GBS vaginale kolonisatie gemodelleerd bij muizen om de werkzaamheid van een faag lytisch enzym te onderzoeken tot vaginale GBS behandelen gedurende een periode van 24 uur 23. Enkele jaren later, werd een lange-termijn GBS vaginale kolonisatie muismodel ontwikkeld om gastheer en bacteriële factoren die GBS doorzettingsvermogen te bestuderen. Dit model heeft talrijke GBS factoren die kolonisatie, waaronder oppervlak appendages 17,18 en GBS tweecomponentensystemen 19,24 geïdentificeerd. Dit model heeft bijgedragen tot de identificatie van gastheer respons mechanismen 19,25 en werd gebruikt om verschillende therapeutische strategieën, met inbegrip van immunomodulerende peptiden 26 en probiotica 27 te testen. Dit protocol geeft de nodige begeleiding om GBS te enten in de muis vaginale-darmkanaal en vervolgens kolonisatie te volgen en het verzamelen van monsters voor verdere analyse.

<table><tbody><tr><td>Sesame oil&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3547-250ML</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Estradiol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8875-1G</td><td>VOORZORG: Draag geschikte PPE. &beta;-estradiol kan worden opgenomen via de huid en slijmvliezen.&nbsp;</td></tr><tr><td>200 &mu;l gel loading pipette tips&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1252-0610</td><td></td></tr><tr><td>Urethro-genitaal, steriel, calcium alginate swabs</td><td>Puritan</td><td>25-801 A 50</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar StrepB</td><td>DRG International</td><td>SB282</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt Broth</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>7161C</td><td></td></tr><tr><td>18 G, 1,5 inch naalden</td><td>BD</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>26 G, 0,5 inch naalden</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>10 ml spuiten</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>1 ml spuiten</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu;m PVDF spuitfilters</td><td>Whatman</td><td>6900-2504</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

een muizenmodel van groep b<em&gt; streptococcus</em&gt; vaginale kolonisatie

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (groep B streptococcus, GBS) is een Gram-positieve, asymptomatische kolonisator van het menselijke maagdarmkanaal en vaginale kanaal van 10 - 30% van de volwassenen. In immuun-gecompromitteerde individuen, met inbegrip van pasgeborenen, zwangere vrouwen en ouderen, kan GBS overschakelen naar een invasieve ziekteverwekker die aan sepsis, artritis, longontsteking en hersenvliesontsteking. Omdat GBS is een toonaangevende bacterieel pathogeen van pasgeborenen, is de huidige profylaxe bestaat uit de late zwangerschap screening voor GBS vaginale kolonisatie en de daaropvolgende peripartum antibiotische behandeling van GBS-positieve moeders. Zware GBS vaginale last is een risicofactor voor zowel de neonatale ziekte en kolonisatie. Helaas is er weinig bekend over de gastheer en bacteriële factoren die bevorderen of toestaan ​​GBS vaginale kolonisatie. Dit protocol beschrijft een techniek voor zij hardnekkige GBS vaginale kolonisatie met één β-estradiol voorbehandeling en dagelijks bemonstering bacteriële loa bepalend. Het verdere details methoden om aanvullende therapieën of reagentia van belang te beheren en vaginale lavage vloeistof en voortplantingsorganen weefsels te verzamelen. Deze muis model zal het begrip van de GBS-gastheer interactie binnen de vaginale omgeving, die zal leiden tot een potentiële therapeutische doelen aan maternale vaginale kolonisatie controle tijdens de zwangerschap en de overdracht aan de kwetsbare pasgeboren voorkomen bevorderen. Het zal ook van belang zijn voor ons begrip van de algemene bacterie-gastheer interacties in de vrouwelijke vaginale-darmkanaal te verhogen.

Bij de ontwikkeling van dit model zijn verschillende opmerkingen over factoren die de duur van GBS vaginale kolonisatie beïnvloeden. Om te bepalen hoe estrous stadium bij enting gevolgen GBS bacteriële persistentie werden muizen gehouden op de dag van de inenting via vaginale lavage vloeistof. Figuur 1 illustreert de vier fasen van de muis loopsheid, zoals bepaald door middel van nat-mount vaginale lavage vloeistof, een bekende methode 29. Muizen werden verdee...

Het doel van dit protocol is voor de menselijke groep B Streptococcus (GBS) vaginale kolonisatie na te bootsen in een muismodel. Deze werkwijze kan worden gebruikt om immuunreacties van de gastheer en bacteriële factoren die GBS vaginale persistentie te onderzoeken, alsmede therapeutische strategieën testen.

Een muizenmodel van groep B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginale Kolonisatie

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Het algemene doel van dit diermodel is het vestigen van een kolonisatie van groep B streptokokken, of GBS, in het vaginale kanaal van muizen. Deze methode kan ons helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de kolonisatie door groep B streptokokken, zoals welke bacteriële factoren belangrijk zijn voor kolonisatie en hoe gastheerresponsen de vaginale persistentie beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat inoculatie doorgaans leidt tot meer dan 90 procent kolonisatie zonder het gebruik van anesthesie, immunosuppressiva of verdikkingsmiddelen.Begin met het vortexen van 0,5 milligram bèta-estradiol, per muis, in een conische buis van 15 milliliter totdat alle klontjes zijn verdwenen en de bèta-estradiol als een fijn poeder verschijnt. Filter vervolgens 100 microliter sesamolie, per muis, via een spuitfilter door een zeef van 0,45 micron in de buis en vortex de buis opnieuw. Wanneer het hormoon als een homogene suspensie in de olie is verspreid, wordt het reagens opgezogen in een nieuwe spuit van 10 milliliter waaraan een 18 gauge naald van één inch wordt bevestigd. Verdeel 100 µL van de suspensie per muis in één tuberculinespuit van 1 mL en voorzie elke tuberculinespuit van een steriele naald van 26 gauge en een halve inch. Dien vervolgens 100 µL bèta-Estradiol toe in het linker- of rechteronderkwadrant van de peritoneumholte van elk dier. Kweek op dezelfde dag als de injectie een vloeibare overnight-cultuur van 5 mL van de betreffende GBS-stam in Todd Hewitt-bouillon, of THB, bij 37 °C.Subcultuur de GBS de volgende ochtend in een volumeverhouding van 1:10 in verse THB voor een incubatie van twee tot drie uur bij 37 °C, totdat de bacteriën de mid-log fase bereiken. Breng de subcultuur vervolgens over in een steriele, conische buis van 15 milliliter en centrifugeer de bacteriële cellen. Resuspendeer het pellet in 200 µL steriele PBS.Breng vervolgens het totale volume van de suspensie aan tot één milliliter PBS per 10 muizen, om een OD600 van 0,4 te bereiken in een nieuwe kweekbuis van vijf milliliter. Breng de cultuur over naar een nieuwe buis van 15 milliliter en pelleteer de bacteriën opnieuw. Resuspendeer de cellen vervolgens in PBS bij één tiende van het oorspronkelijke volume.Reserveer 50 µL van de bacteriën voor seriële verdunning en uitplating op THB-agar, om het exacte CFU van het inoculum te bepalen. Neem vervolgens 10 µL GBS op in een gel-loading pipetpunt van 200 µL en fixeer handmatig de losse huid in de nekvel van het eerste dier tussen de duim en wijsvinger, gevolgd door immobilisatie van de staart. Voer de pipetpunt 5 tot 10 mm in het vaginale lumen in en breng het volledige volume van het inoculum over.Laat daarna onmiddellijk de nekscruff los en til de staart op om de achterkant van het dier te heffen, terwijl u de voorpoten op een hard oppervlak laat lopen. Inspecteer na een minuut visueel de vaginale opening op eventuele terugstroom van het inoculum. Bevochtig het wattenstaafje vlak voor het afnemen van het uitstrijkje met PBS en fixeer een van de muizen zoals zojuist gedemonstreerd.Voer het wattenstaafje 10 millimeter in het vaginale lumen in en draai het voorzichtig vier keer met de klok mee en vier keer tegen de klok in, terwijl er lichte druk op de vaginale wand wordt uitgeoefend. Plaats het wattenstaafje in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met 100 µL PBS en vortex de buis en het wattenstaafje gedurende ongeveer 15 seconden om de bacteriën van de katoenvezels te laten loskomen. Verdun vervolgens elk monster vervolgens serieel in PBS en plaats 20 µL van verdunningen van 1:10 tot 1:10.000 op een differentieel medium agarplaat, bereid volgens de instructies van de fabrikant, voor incubatie bij 37 °C gedurende 24 uur.GBS-kolonies zullen helderroze of mauve van kleur zijn. Om het vaginale lavage te verzamelen, gebruik een 200 microliter gel-laadpipetpunt om 20 microliters PBS in het vaginale lumen te dispensereren. Pipetteer het volledige volume voorzichtig vier keer op en neer binnen het lumen.Zuig vervolgens met dezelfde tip het volledige volume op. Voor verdere analyse van het spoelvloeistof monster, breng de spoelvloeistof over in een microcentrifugebuis van 0,7 milliliter. Voor homogenisatie bij dissectie van weefsel, bespuit de ventrale zijde van de buik van een geëuthanaseerd dier met 70% ethanol en gebruik steriele scharen om de abdominopelvische holte te openen.Verschuif de darmen zodat het voortplantingsstelsel zichtbaar wordt. Snijd vervolgens beide uterine hoorns halverwege door, tussen het uterine lichaam en de eierstokken. Verwijder met een schaar en een pincet het visceraal vet, de membranen en de urineblaas van het voortplantingsstelsel door de weefsels caudaal te verschuiven.Maak vervolgens een transversale insnijding in de vagina zo dicht mogelijk bij de vulva, om het voortplantingsstelsel van het lichaam te scheiden. Plaats het intacte voortplantingsstelsel in een steriele Petrischaal en gebruik een nieuw scheermesje om de uterus met één enkele transversale snede van de cervix te scheiden. Scheid de cervix van de vagina met nog een transversale snede.Gebruik vervolgens een steriele pincet om elk van de weefsels over te brengen naar individuele, vooraf gewogen buisjes van 2 milliliter die 500 µL PBS en homogenisatiekraaltjes bevatten. Weeg elk buisje van 2 milliliter om het weefselgewicht te bepalen. Sluit daarna de schroefdopjes stevig af en homogeniseer de weefsels gedurende één minuut op de maximale snelheid in een weefselhomogenisator.Om de bacteriële last te kwantificeren, worden 25 µL weefselhomogenaat serieel verdund en worden verdunningen van 1:10 tot 1:10.000 uitgeplaat op differentieelaagarplaten voor een incubatie van 24 uur bij 37 °C. Om monsters te bewaren voor cytokwinekwantificering, worden de homogenaten ingevroren bij -20 °C. In deze afbeeldingen worden de vier stadia van de oestruscyclus van de muis gedemonstreerd, zoals vastgesteld aan de hand van een nat-preparaat van vaginaal spoelvloeistof.Muizen die in het pro-estrusstadium waren geïnoculeerd, vertoonden een langere kolonisatie met GBS dan in elk ander stadium van de oestrus, in het bijzonder vergeleken met muizen die ten tijde van de inoculatie in diestrus waren. Een aanhoudende oestrus bevordert de persistentie van GBS A909 in CD-1 muizen, waarbij twee weken na inoculatie een kolonisatie van 90 procent werd waargenomen. In een typisch experiment met één dosis bèta-estradiol voorafgaand aan de inoculatie was slechts 40 tot 50 procent van de muizen één week na inoculatie gekoloniseerd, met een gemiddeld teruggewonnen hoeveelheid GBS die overeenkomt met het kolonisatiepercentage.Aantoonbaar dat het handhaven van een continue oestrus de vaginale persistentie van GBS bevordert bij de meerderheid van de CD-1 muizen. GBS A909 persisteert in het vaginale kanaal bij outbred CD-1 muizen en inbred FVB muizen gedurende ongeveer één week. Terwijl de meerderheid van de inbred BALB/c en C57BL/6 muizen na één week gedurende een maand of langer gekoloniseerd raken.Visualisatie van GFP-positieve GBS in geïnoculeerde dieren toont de aanwezigheid van GBS aan die gehecht is aan het muis-vaginale epitheel en zich in nauwe nabijheid van andere inheemse vaginale flora bevindt. Het is belangrijk om tijdens de inoculatie terugstroom te voorkomen om te garanderen dat alle muizen gekoloniseerd raken. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in één tot twee uur worden voltooid, afhankelijk van het aantal dieren.Dit model stelt onderzoekers op het gebied van gastheer/pathogeen-interacties in staat om de capaciteit van bacteriën, zoals groep B streptokokken, om het vrouwelijke voortplantingsstelsel te koloniseren te onderzoeken. Deze procedure kan worden gebruikt om nieuwe verbindingen of probiotische behandelingen te testen om aanvullende vragen over therapeutische interventies te beantwoorden.

a-murine-model-of-group-b-streptococcus-vaginal-colonization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Belangrijke technieken om te worden gebruikt bij de evaluatie...

Protocollen voor Vaginale Inenting en Sample Collection in het experimenteel muismodel van Candida Vaginitis

Source: Morrill, S. R., et al. Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates a protocol for modeling vaginal colonization in mice using antibiotic-resistant anaerobic bacteria. It begins with hormonal treatment to increase epithelial susceptibility, followed by vaginal inoculation and co-inoculation under anaerobic conditions. The procedure concludes with post-inoculation sampling and culture to evaluate bacterial colonization...

Modeling Murine Vaginal Colonization by Anaerobic Bacteria

Source: Patras, K. A., Doran, K. S. A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation and vaginal inoculation of a hormone-treated female mouse with Group B Streptococcus to model infection. It explains how to culture and prepare the bacteria, administer the inoculum into the vaginal lumen, and ensure successful infection.

Establishing a Mouse Model of Vaginal Group B Streptococcus Infection

Source: Patras, K. A. &amp; Doran, K. S. A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the quantification of vaginal Group B Streptococcus (GBS) load in a mouse model using swabbing and chromogenic culture. It outlines the steps involved in sample collection, plating, and colony counting to quantify GBS load in the mouse vaginal lumen.

Quantification of Group B Streptococcus Load in the Mouse Vaginal Lumen via Swabbing and Chromogenic Culture

This video demonstrates the establishment of uropathogenic Escherichia coli infection in a female mouse bladder through transurethral catheter instillation. The injected bacteria successfully establish a urinary tract infection within the bladder, providing a valuable platform for studying healthcare-associated diseases related to the urinary tract.

Establishment of a Urinary Tract Infection Model in Female Mice

Neisseria meningitidis is een humaan specifieke ziekteverwekker die de bloedvaten infecteert. In dit protocol menselijke bloedvaten in een muis worden geïntroduceerd door enten menselijke huid op immuungecompromitteerde muizen. Bacteriën zich uitgebreid naar menselijke vaten, waardoor vasculaire beschadiging en ontwikkeling van de purpura uitslag typisch waargenomen in menselijke gevallen.

Gehumaniseerd muismodel om te studeren Bacteriële infecties Targeting microvasculature

Een muismodel van uropathogene E. coli (UPEC) transurethrale inenting om latente intracellulaire blaasreservoirs en daaropvolgende blaasblootstelling aan G. vaginalis vast te stellen om terugkerende UPEC-UTI te induceren, wordt aangetoond. Ook aangetoond zijn de opsomming van bacteriën, urinecytologie en in situ blaasfixatie en -verwerking voor scanningelektronenmicroscopie.

Terugkerende Escherichia coli urineweginfectie veroorzaakt door Gardnerella vaginalis blaasblootstelling bij muizen

Het protocol presenteert een muismodel van vaginale kolonisatie met anaeroob gekweekte menselijke vaginale bacteriën. We richten ons op Gardnerella vaginalis, terwijl we suggesties opnemen voor Prevotella bivia en Fusobacterium nucleatum. Dit protocol kan ook worden gebruikt als een gids voor vaginale inentingen en levensvatbaar herstel van andere anaeroob gekweekte bacteriën.

Modellen van Murine Vaginale Kolonisatie door Anaeroob Gekweekte Bacteriën

Vroeggeboorte (bevalling &lt; 37 weken) is een urgent wereldwijd gezondheidsprobleem met suboptimale preventie- en behandelingsopties. We presenteren een muismodel van oplopende vaginale bacteriële infectie-geïnduceerde vroeggeboorte en schetsen hoe de resulterende neonatale morbiditeit en mortaliteit kunnen worden geanalyseerd.

Modellering van oplopende vaginale infectie, vroeggeboorte en neonatale morbiditeit bij muizen

Dit protocol beschrijft de noodzakelijke stappen voor kolonisatie van muizen met pks+ Escherichia coli onder niet-inflammatoire omstandigheden, evenals niet-invasieve methoden voor validatie van kolonisatie en beoordeling van de pks+ E. coli-expansie in ontlasting.

Kolonisatie met Murine pks+ Escherichia coli onder niet-inflammatoire omstandigheden

Leer een muizenmodel voor vaginale kolonisatie van groep B Streptococcus (GBS) om gastheer-pathogeen interacties en therapeutische strategieën te bestuderen. Deze methode bereikt meer dan 90% kolonisatie zonder verdoving.

Een muizenmodel van groep B

Meer video's verkennen