Een muizenmodel van groep B Streptococcus Vaginale Kolonisatie

Het algemene doel van dit diermodel is om Streptococcus van groep B, of GBS kolonisatie van de muisine vaginale tractus te vestigen. Deze methode kan ons helpen belangrijke vragen over groep B Streptococcal kolonisatie te begrijpen, zoals, wat zijn de bacteriële factoren die belangrijk zijn voor kolonisatie, evenals hoe gastherenreacties de vaginale persistentie beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat inoculatie, meestal, resulteert in meer dan 90 procent kolonisatie zonder het gebruik van anesthesie, immunosuppressiva of verdikkingsmiddelen.

Begin door 0,5 milligram beta-Estradiol, per muis, in een 15 milliliter conische buis te vortexen totdat alle klonters zijn verwijderd en het beta-Estradiol als een fijn poeder verschijnt. Spuit vervolgens 100 microliters sesamolijfolie, per muis, in de buis door een 0,45 micron zeef en vortex de buis opnieuw. Wanneer de hormoon als een homogene suspensie door de olie is verdeeld, trek de reagentia in een nieuwe 10 milliliter spuit en bevestig een 18 gauge, een inch naald.

Deel 100 microliters van de suspensie in één, een milliliter tuberculine spuit, per muis, en bevestig elke tuberculine spuit met een steriele, 26 gauge, een halve inch naald. Lever vervolgens 100 microliters beta-Estradiol af in de onderste linker of rechterkwadrant van de buikholte van elk dier. Op dezelfde dag als de injectie, laat een vijf milliliter, overnachts vloeistofcultuur van de GBS stam van interesse groeien in Todd Hewitt bouillon, of THB, bij 37 graden Celsius.

De volgende ochtend, subcultuur de GBS bij een een op tien volume in verse THB voor een twee tot drie uur incubatie bij 37 graden Celsius, totdat de bacteriën de mid-log fase bereiken. Breng vervolgens de subcultuur over in een steriele, 15 milliliter conische buis en centrifugeer de bacteriecellen. Breng de pellet opnieuw op in 200 microliters steriele PBS.

Breng vervolgens het totale volume van de suspensie op één milliliter PBS per 10 muizen, om een OD600 van 0,4 te bereiken in een nieuwe, vijf milliliter cultuurbuis. Breng de cultuur over in een nieuwe, 15 milliliter buis en pellet de bacteriën opnieuw. Breng vervolgens de cellen opnieuw op in PBS bij één tiende van het oorspronkelijke volume.

Reserveer 50 microliter van de bacteriën voor seriële verdunning en plateren op THB agar, om de exacte CFU van het inoculum te bepalen. Trek vervolgens 10 microliters GBS op in een 200 microliter gel-loading pipettepunt en zet de losse huid bij de nek van het eerste dier vast, tussen de duim en wijsvinger, gevolgd door immobilisatie van de staart. Breng de pipettepunt 5 tot 10 millimeter in het vaginale lumen in en doseer het gehele volume van het inoculum.

Laat vervolgens onmiddellijk de nek los en til de staart op om het achterste deel van het dier te verhogen, terwijl de voorpoten op een hard oppervlak worden geleid. Inspecteer na een minuut de vaginale opening visueel op eventuele inoculum terugvloeiing. Vlak voordat wordt gewist, bevochtig de watten in PBS en houd een van de muizen vast zoals zojuist is gedemonstreerd.

Breng de doek 10 millimeter in het vaginale lumen in en draai voorzichtig vier keer met de klok mee en vier keer tegen de klok in, terwijl u lichte druk op de vaginale wand uitoefent. Plaats de doek in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis met 100 microliters PBS en vortex de buis en doek ongeveer 15 seconden om de bacteriën van de katoenvezels los te maken. Verdun vervolgens elk monster serieel in PBS en plateer 20 microliters van één op tien tot één op tienduizend verdunning op differentieel medium agar plaat, bereid volgens de instructies van de fabrikant, voor incubatie bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur.

GBS kolonies zullen verschijnen als helder roze of mauve in kleur. Om de vaginale lavage te verzamelen, gebruik een 200 microliter gel-loading pipettepunt om 20 microliters PBS in het vaginale lumen te doseren. Pipetteer het gehele volume voorzichtig vier keer op en neer in het lumen.

Trek vervolgens met dezelfde punt het gehele volume terug. Voor downstream lavage vloeistof analyse, doseer de lavage in een 0,7 milliliter microcentrifugebuis. Voor weefsel dissectie homogenisatie, spuit de ventrale buik van een geëuthanaseerd dier af met 70 procent ethanol en gebruik steriele schaar om de abdominele holte te openen.

Verplaats de darmen zodat het voortplantingsorgaan wordt blootgelegd. Snijd vervolgens beide baarmoeders, op de halve lengte, tussen het baarmoederlichaam en de eierstokken. Gebruik schaar en pincetten om het viscerale vet, membranen en urineblaas van het voortplantingsorgaan te scheiden en beweeg de weefsels naar de staart toe.

Snijd vervolgens het vagina dwars zo dicht mogelijk bij de vulva, om het voortplantingsorgaan te scheiden van het lichaam. Breng het intacte voortplantingsorgaan over in een steriele petrischaal en gebruik een nieuw scheermes om de baarmoeder van de baarmoederhals te scheiden in een enkele, dwars snede. Scheid de baarmoederhals van de vagina met een andere dwars snede.

Gebruik vervolgens steriele pincetten om elk van de weefsels over te brengen in individuele, vooraf gewogen, twee milliliter buisjes met 500 microliters PBS en homogenisatie kralen. Weeg elk 2 milliliter buisje om de weefselgewichten te bepalen. Vervolgens sluit u de schroefdopbuisjes goed af en homogeniseert u de weefsels gedurende één minuut, op de maximale snelheid, in een weefselhomogenisator.

Om de bacteriële belasting te kwantificeren, verdunt u serieel 25 microliter weefselhomogenaat en plateert u één op tien tot één op tienduizend verdunning op differentiële medium agar platen, voor een 24 uur incubatie bij 37 graden Celsius. Om monsters voor citokine kwantificering te bewaren, bevriest u de homogenaten bij min 20 graden Celsius. In deze afbeeldingen worden de vier stadia van de muis oestrus cyclus, zoals bepaald door nat-mont vaginale lavage vloeistof, gedemonstreerd.

Muizen geïnocul