detectie van

Het algemene doel van deze methode is om trypanosomen die een specifiek variant surface glycoprotein of VSG tot expressie brengen te isoleren van de rest van de populatie, en om parasieten te identificeren die zijn overgeschakeld van het startende dominante VSG naar een ander VSG. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de biologie van trypanosomen, zoals welke factoren of gebeurtenissen de VSG-switching in een populatie parasieten beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze sneller is dan eerder gepubliceerde methoden en een eenvoudige kwantificering van switch- versus non-switch-cellen mogelijk maakt.

Toen het laboratorium voor het eerst onderzoek deed naar antigenvariatie, was het eerste probleem hoe zeldzame 'switchers' gedetecteerd konden worden. Dit soort probleem was een aantal jaar geleden in de immunologie al opgelost door middel van magnetisch geactiveerde cel sortering om cellen te verrijken die negatief waren voor een bepaald kenmerk. Het overzetten van dit non-selectieproces naar antigenvariatie leek een zeer veelbelovend idee.

Om te beginnen moeten bloodstream trypanosomen van de Lister 427-stam worden gekweekt tot een dichtheid van 0,5 tot 100.000 per milliliter. Aliquoteer een monster van 50 × 10⁶ cellen in een buis van 15 milliliter en centrifugeer deze vervolgens. Bewaar 1 × 10⁶ cellen en kweekmedium om later te gebruiken als positieve en negatieve antilichaamcontroles.

Pipette het grootste deel van het supernatant af, waarbij ongeveer 750 µL in de buis achterblijft. Breng de cellen over naar een centrifugebuis van 1,5 mL. Centrifugeer de cellen ten slotte vier minuten bij 4 °C bij 2800 ×g.

Pipette vervolgens al het supernatant af. Resuspendeer de cellen in 150 µL kweekmedium, aangevuld met het primaire anti-variant surface glycoprotein antilichaam of anti-VSG in de juiste verdunning. Vortex de cellen daarna gedurende 10 minuten bij 4 °C.

Was met 800 tot 1000 µL koud cultuurmedium. Centrifugeer de cellen bij 4 °C gedurende vier minuten bij 5200 ×g. Nadat het supernatant is afgezogen, worden de cellen gewassen met 1 mL cultuurmedium en opnieuw gecentrifugeerd.

Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 100 µL kweekmedium. Voeg 110 µL magnetisch-geactiveerde cel-sorteringsmicrobeads toe van het type dat geschikt is voor het primaire antilichaam. Meng goed door herhaaldelijk te pipetteren en vortex vervolgens.

Terwijl de cellen worden gevortexd, wordt een magnetisch geactiveerde scheidingskolom klaargezet. Plaats een buis van 15 milliliter eronder om het primingmedium op te vangen. Voeg twee milliliter kweekmedium toe om de kolom te primen.

Verwijder vervolgens het monster uit de vortexmixer en voeg 800 tot 1000 µL koud kweekmedium toe. Centrifugeer het monster en verwijder daarna het supernatant om ongebonden antilichamen te verwijderen. Was de gepelletteerde cellen met 1 mL kweekmedium en centrifugeer opnieuw.

Aspireer ditmaal het supernatant, maar laat 100 µL in de buis achter. Tik stevig tegen de centrifugebuis totdat de pellet volledig is geresuspendeerd. Voeg 1 mL kweekmedium toe en pipetteer dit op en neer om de cellen volledig te resuspenderen.

Verwijder de conische buis van 15 millimeter die is gebruikt voor het opvangen van het primingmedium en vervang deze door een nieuwe conische buis van 15 milliliter om het doorstroomvolume met de geswitchte parasieten op te vangen. Breng de celsuspensie aan op de geprimede kolom. Vang het doorstroomvolume op in een 15 milliliter buis eronder; dit duurt doorgaans zes tot zeven minuten voor 1 milliliter medium plus trypanosomen.

Was daarna de kolom twee keer met één milliliter kweekmedium en verzamel het doorstroomvolume in dezelfde buis. Verdeel het doorstroomvolume, dat in totaal ongeveer drie milliliter moet zijn, over twee microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter. Plaats de buisjes vervolgens op ijs.

Voeg drie milliliters kweekmedium toe aan de kolom en plaats de kolom in een centrifugebuis van 15 milliliter. Hiermee worden de cellen verkregen die het startende dominante VSG tot expressie brengen. Neem 300 microliters van dit eluaat op en bewaar dit op ijs; de rest kan worden weggegooid.

Om een positieve controle te maken, neemt u ongeveer 100.000 cellen van de startcultuur en pipetteert u deze in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter. Herhaal dit om een negatieve controle te maken. Centrifugeer de flow-through monsters en het monster van de positieve controle.

Verwijder vervolgens het supernatant en gooi dit weg. Resuspendeer de positieve controlecellen in 100 µL kweekmedium met primair fluorofoor-gelabelde anti-VSG-antilichaam in de juiste verdunning. Resuspendeer daarna één flow-throughpellet in 100 µL kweekmedium met primair fluorofoor-gelabelde anti-VSG-antilichaam in de juiste verdunning.

Gebruik de suspensie om vervolgens de pellet opnieuw te suspenderen in de tweede doorstroombuis, resulterend in één poolbuis. Meng goed door herhaaldelijk op te pipetteren. Vortex de cellen en voeg vervolgens 800 tot 1000 microliters koud cultuurmedium toe.

Centrifugeer de monsters vier minuten bij 5200 ×g bij vier graden Celsius en verwijder vervolgens het supernatant om ongebonden antilichamen te verwijderen. Was de cellen met één milliliter kweekmedium en centrifugeer de cellen vervolgens. De positieve en negatieve controles en de geëlueerde cellen werden vooraf op ijs bewaard.

Verwijder het supernatant. Voeg daarna 148,5 µL kweekmedium toe aan de monsters. Voeg vervolgens 25 µL absolute telkralen toe, gevolgd door 1,5 µL Propidiumjodide-kleuringsoplossing.

Resuspendeer de pellets van de positieve en negatieve controle in 175 µL kweekmedium. De monsters kunnen nu in de flowcytometer worden geanalyseerd. Deze flowcytometrie-plots tonen de resultaten van de celseparatie van populaties trypanosomen die zijn geïnduceerd om een dubbelstrengs DNA-breuk te veroorzaken, vergeleken met niet-geïnduceerde cellen.

De linkerpanelen tonen de forward scatter tegenover de side scatter, wat inzicht geeft in de levende versus dode cellen en de aan het monster toegevoegde beads. Er kunnen vervolgens gates worden aangemaakt die deze bepalen op basis van de scatter-kenmerken. De rechterpanelen tonen uitsluitend die cellen die op basis van de in de linkerpanelen aangemaakte scatter-gates als levend konden worden geclassificeerd.

De dominante start-VSG in dit geval was VSG twee. Cellen die positief kleuren voor Propidiumjodide zijn dode cellen. Deze zijn te zien in de Q1- en Q2-regio's van de plot.

Cellen die positief kleuren voor het dominante VSG en negatief voor PI vallen in de Q drie-regio en zijn contaminanten. Ten slotte zijn cellen in Q vier levende cellen die negatief kleuren voor het dominante VSG, welke worden beschouwd als switchers. Deze grafiek toont de berekende waargenomen switchfrequenties van de trypanosome-populaties met versus zonder geïnduceerde breuken.

Het niveau van stochastische switching in vitro is vrij laag. Hoewel het induceren van een breuk resulteert in significant meer cellen die overschakelen naar de niet-dominante VSG. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer drie uur worden uitgevoerd.

tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de monsters gedurende het hele proces koud te houden en de pellets adequaat te resuspenderen, vooral voorafgaand aan de isolatie op de kolom. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals RNA-sequencing, worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke VSG's tot expressie komen in een switch-populatie. Hoewel deze methode doorgaans wordt gebruikt om VSG-switching te meten, kan deze ook worden ingezet voor de isolatie en kwantificering van parasieten die elk gewenst oppervlakte-eiwit tot expressie brengen.