Name: detectie van Trypanosoma brucei Variant oppervlakte glycoproteïne Schakelen van Magnetic Activated Cell Sorting en flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Leer hoe je Trypanosoma brucei met specifieke variant oppervlakte glycoproteïnen isoleert met magnetische celscheiding en flowcytometrie. Deze methode detecteert zeldzame switchers sneller dan eerdere technieken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag George Cross erkennen voor algemeen advies over trypanosome biologie. Dit werk werd ook gesteund door een Bill en Melinda Gates Foundation GCE subsidie ​​aan DS, een NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1.325.261) naar MRM en een NIH / NIAID (subsidie ​​# AI085973) naar FNP. Wij danken Galadriel Hovel-Miner voor het gebruik van de stam die de I-SCEI gen en erkenning ter plaatse.

OPMERKING: Gedurende de procedure moet worden cellen op ijs bewaren. Koude media moeten ook overal worden gebruikt. 1. Sample Oogsten <ol><li> Lister stam groeien 427 bloedstroom trypanosomen tot een dichtheid van 0,5-1.000.000 / ml. Het beste is om culturen te starten met een klein aantal parasieten. Spin down 50 x 10 6 cellen / monster gedurende 10 min bij 1500 x g. Zorg ervoor dat u 1 x 10 6 cellen te laten in de cultuur voor later te gebruiken als positieve en negatieve antilichaam controles. LET OP: Dit protocol kan ook gebruikt worden op trypanosomen geïsoleerd uit dierlijk bloed (zie bespreking voor details). </li><li> Pipet of giet het grootste deel van de bovenstaande vloeistof (laat ongeveer 750 ui). Overdracht van de cellen naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Spin cellen bij 4 ° C gedurende 4 min bij 5200 xg in een microcentrifuge en verwijder supernatant. </li></ol> 2. Magnetische Labeling <ol><li> Resuspendeer cellen in 150 pi kweekmedium (HMI-9 with serum bijvoorbeeld) + primaire anti-VSG-antilichaam op de juiste verdunning. LET OP: De anti-VSG-antilichaam is in huis en worden gebruikt bij een verdunning van 1:50. Het is belangrijk om een ​​primair anti-VSG antilichaam dat niet is gelabeld met een fluorofoor gebruiken. </li><li> Vortex cellen met behulp van een vortex-adapter 60 op snelheid 6-8 in een koude kamer bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Wassen met 800 - 1000 ul koud HMI-9 met serum. </li><li> Centrifugeren op 4 ° C gedurende 4 minuten bij 5200 xg en zuig de supernatant. Wassen met 1 ml HMI-9 met serum en draaien zoals hierboven. Zuig het supernatant. Resuspendeer pellet in 100 pl HMI-9 met serum. </li><li> Voeg 110 ul van magnetische-geactiveerde celsortering (MSC) microkralen. Met anti-muis anti-konijn of anti-biotine kralen afhankelijk van de primaire anti-VSG antilichaam. Goed mengen. Vortex cellen in een koude kamer bij 4 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Terwijl de cellen worden vortexen, het opzetten van een magnetische-geactiveerde kolom voor de scheiding / monster op een scheiding magneet. Zorg ervoor dat u een re hebbenceptacle (we een 15 ml centrifugebuis) onder de kolom doorstroom verzamelen. De proefopstelling in een koude kamer. </li><li> Voeg 2 ml van HMI-9 met serum aan premier kolom. Na priming plaats een 15 ml centrifugebuis onder de kolom doorstroom van elk monster te verzamelen. </li><li> Na 10 minuten incubatie in stap 2,4, voeg 800-1000 pl koud HMI-9 met serum. Centrifugeren op 4 ° C gedurende 4 minuten bij 5200 x g en verwijder supernatant om ongebonden antilichaam te verwijderen. Wassen met 1 ml HMI-9 met serum en herhaal verlaten 100 pi van het supernatant. </li><li> Flick de centrifugebuis krachtig en visueel te inspecteren de buis om ervoor te zorgen dat de pellet volledig geresuspendeerd. Voeg 1 ml van HMI-9 met serum en pipet op en neer om ervoor te zorgen dat cellen goed worden opnieuw gesuspendeerd. </li></ol> 3. Magnetische scheiding <ol><li> Controleer of de kolommen worden voorbereid zoals boven beschreven. Toepassen cellen kolom. Verzamel doorstroming met cellen die de niet-dominante VSG. 1 ml medium + trypanosomen duurt meestal 6-7 min door de kolom stromen. </li><li> Wassen met 2 x 1 ml HMI-9 met serum en laat doorstroming in dezelfde buis als in stap 3,1. </li><li> Verdeel doorstroom (3 ml) in twee 1,5 ml microcentrifugebuizen. Opmerking: Deze kunnen later worden gecombineerd of half kunnen worden gebruikt om RNA te isoleren, etc. </li><li> Kolom verwijderen uit magneet. Voeg 3 ml HMI-9 met serum kolom en kolom dompelen in een 15 ml centrifugebuis met cellen die het uitgangspunt, hooggelegen VSG expressie te verkrijgen. Verwijder 300 ui geëlueerde materiaal voor latere analyse. Houd deze cellen op ijs. </li><li> Voor gebruik als een positieve en een negatieve controle, duurt ongeveer 1.000.000 cellen van het uitgangsmateriaal controlecultuur cellen groeien bij 37 ° C (die naar verwachting niet vaak wisselt) en pipet ze in een 1,5 ml microcentrifugebuis. OPMERKING: Positieve controle cellen zullen worden gekleurd met fluorofoor gemerkte antilichaam in stap 4,1. Negatieve controlecellen remain onbesmet in de rest van het protocol. </li><li> Spin doorstroom monsters en positieve controles zonder antilichaam bij 4 ° C gedurende 4 minuten bij 5200 x g en verwijder supernatant. Opmerking: Een 300 pl aliquot van geëlueerde cellen kan worden gebruikt als een positieve controle voor anti-VSG kleuring. </li></ol> 4. kleuring om verontreinigingen en switchers identificeren <ol><li> Resuspendeer doorstroom monsters en de controle cellen in 100 pl HMI-9 met serum + primair-fluorofoor gemerkt anti-antilichaam VSG op het juiste verdunning. Opmerking: Het gemerkte anti-VSG-antilichaam is in huis en gebruikt bij een verdunning van 1: 1000. De fluorofoor gemerkt, kan anti-VSG uit dezelfde bron als het ongelabelde antilichaam in de MACS scheiding step.There moet 3 ml doorstroming monster in twee microcentrifugebuizen volgende stap 3,5. </li><li> Om alle doorstroming door flow cytometrie analyse, combineren de pellets in twee microcentrifugebuizen terwijl re-susafwachting van de monsters in 100 ui HMI-9 met serum + anti-VSG antilichaam. Goed mengen. </li><li> Vortex cellen in een koude kamer bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Voeg 800 - 1.000 III koud HMI-9 met serum. Spin monsters bij 4 ° C gedurende 4 minuten bij 5200 x g en verwijder supernatant om ongebonden antilichaam te verwijderen. </li><li> Was de cellen met 1 ml HMI-9 met serum. Spin monsters bij 4 ° C gedurende 4 minuten bij 5200 x g en verwijder supernatant. Tijdens deze laatste rotatie, spin down de geëlueerde-monsters uit stap 3.4 en de negatieve controle monster. </li><li> Resuspendeer alle doorstroming en geëlueerd monsters: 148,5 ul HMI-9 met serum, 25 ul absolute tellen van kralen en 1,5 ul propidiumjodide kleuring oplossing (175 ui totaal). Resuspendeer positieve en negatieve controle antilichaam monsters in 175 ul HMI-9 met serum. Zorg ervoor dat het aantal absolute tellen van kralen / 25 ul voor de specifieke gebruikte partij op te nemen. </li><li> Ren alle monsters door middel van een flowcytometer en het verzamelen van gegevens. Dode cellen vlek als PI <sup&gt; +. Verontreinigingen vlekken als PI - VSG +. Switchers vlekken als PI - VSG - 8. </li><li> Bereken schakelfrequenties met behulp van flowcytometrie data. LET OP: Voor instructies over hoe om te schakelen frequenties te berekenen, wordt verwezen naar de aanvullende bestand <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54715/Flow_Cytometry_Calculations.docx" target="_blank">Flowcytometrie Calculations.docx</a> en tabel 1. </li></ol>

<ol><li>Horn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in African trypanosomes.</a> Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).</li>
<li>Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigen+switching+rates+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).</li>
<li>Rudenko, G., McCulloch, R., Dirks-Mulder, A., Borst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+exchange+can+be+an+important+mechanism+of+variant+surface+glycoprotein+gene+switching+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Telomere exchange can be an important mechanism of variant surface glycoprotein gene switching in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 80 (1), 65-75 (1996).</li>
<li>Turner, C. M., Barry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei+rhodesiense+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections.</a> Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).</li>
<li>Miller, E. N., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+antigenic+types+appearing+in+first+relapse+populations+of+clones+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Analysis of antigenic types appearing in first relapse populations of clones of Trypanosoma brucei.</a> Parasitology. 82 (1), 63-80 (1981).</li>
<li>Horn, D., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Trypanosoma+brucei+vsg+expression+site+switching+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Trypanosoma brucei vsg expression site switching in vitro.</a> Mol Biochem Parasitol. 84 (2), 189-201 (1997).</li>
<li>Figueiredo, L. M., Janzen, C. J., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histone+methyltransferase+modulates+antigenic+variation+in+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A histone methyltransferase modulates antigenic variation in African trypanosomes.</a> PLoS Biol. 6 (7), e161(2008).</li>
<li>Boothroyd, C. E., Dreesen, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast-endonuclease-generated+DNA+break+induces+antigenic+switching+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast-endonuclease-generated DNA break induces antigenic switching in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 459 (7244), 278-281 (2009).</li>
<li>Engstler, M., Pfohl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Flow-Mediated+Protein+Sorting+on+the+Cell+Surface+of+Trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes.</a> Cell. 131 (3), 505-515 (2007).</li>
<li>Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+dynamics+of+antigenic+variation+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei.</a> Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Wat experimentele techniek, is de meest kritische component van het protocol houden alle monsters koude. Trypanosomen zeer snel internaliseren antilichaam gebonden aan hun oppervlak 9, maar dit proces is afhankelijk motiliteit, en heeft geen invloed op de bepaling zolang de cellen bij 4 ° C gehouden. Alle monsters moeten altijd worden bewaard op ijs, en pipetteren moet snel worden gedaan om de blootstelling aan de 25 ° C lab milieu te minimaliseren. Koud HMI-9 met serum moet beschikbaar zijn bij het begin van...

De protozoa parasiet, Trypanosoma brucei, is een verwekker van ziekten die de mens beïnvloeden (via Trypanosoma brucei gambiense en Trypanosoma brucei rhodesiense) en dieren (via Trypanosoma brucei brucei) gehele Sub-Sahara Afrika. Het is aan de zoogdiergastheer overgedragen via het speeksel van de tseetseevlieg vector. Zowel mens en dier Afrikaanse trypanosomiasis leiden tot een ernstige economische last in endemische gebieden, en weinig drugs zijn beschikbaar of in ontwikkeling voor de behandeling van beide ziekten. Inzicht in de mechanismen van immune fraude is cruciaal voor de ontwikkeling van geneesmiddelen voor trypanosomiasis. Antigene variatie van het dichte, variant oppervlakte glycoproteïne (VSG) jas die de parasiet bedekt, is een van de belangrijkste manieren waarop T. brucei ontwijkt de zoogdier antilichaam respons. Ongeveer 2000 varianten van de VSG-gen aanwezig in het genoom trypanosoom, maar slechts één wordt getranscribeerd op een bepaald moment uit een van ~ 15 expresSion sites. Switching van de VSG expressie kan plaatsvinden hetzij door het kopiëren van een VSG gen in de actieve expressie plaatsen of door transcriptionele activering van een eerder stille expressieplaats (besproken in 1). Hoewel veel werk is besteed aan het begrip van antigene variatie in T. brucei, de factoren die van invloed schakelfrequentie zijn nog steeds slecht begrepen. Studies tot op heden belemmerd door het feit dat hoewel omschakelen gebeurt stochastisch in vitro schakelfrequenties zeer laag, in de orde van 1 op ongeveer 10 6 cellen 2. Dit maakt het moeilijk te meten of een bepaalde factor verhoogt of verlaagt schakelfrequentie, omdat schakelen moeilijk te detecteren in de eerste plaats. Voorafgaand aan 2009, werkwijzen voor het isoleren overstappers in een bepaalde populatie waren langdurig en arbeidsintensief. Deze omvatten passeren van trypanosomen door de muizen ingeënt tegen de dominante VSG en dan oogsten van celleneen dag later 3, en tellen honderden cellen door immunofluorescentie 4,5. Een andere strategie is gebaseerd op selectie voor drug resistentie tegen switchers 6 isoleren. Omdat Afrikaanse trypanosomen gekweekt in vitro gewoonlijk bestaan uit een grote populatie expressie één belangrijke variant, en een veel kleinere populatie overstappers expressie alternatieve varianten wordt verwezen naar de belangrijkste variant in dit document als dominante vanaf VSG. Daarbij we geenszins willen impliceren dat deze belangrijke variant een grotere geschiktheid dan andere varianten in de populatie. Hier beschrijven we een werkwijze die betrouwbaar het aantal trypanosomen expressie een niet-dominante VSG in een bepaalde populatie te meten 3 - 4 uur. Deze werkwijze is bijzonder bruikbaar wanneer men wil nagaan of een bepaalde genetische manipulatie of medicatie verhoogt het aantal geschakelde cellen in een populatie. In plaats van bevrijden de populatie van cellen die de dominant Neem VSG door middel van drugs of immunologische middelen, worden deze cellen geëlimineerd door eerst te coaten met magnetische korrels gekoppelde antilichaam tegen de dominante VSG en isoleren ze op een magnetische kolom. De geschakelde populatie wordt vervolgens verzameld in de doorstroom en opnieuw gekleurd met een fluorofoor gemerkt anti-antilichaam VSG verontreinigingen identificeren. Kwantificering wordt bereikt door een bepaald aantal absolute tellen van kralen toevoegen aan elk monster zodat de verhouding van kralen cellen kan worden bepaald en gebruikt om het aantal overstappers kwantificeren de bevolking 7.

<table><tbody><tr><td>unlabeled anti-VSG antibody</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>VSG antibody is made in house</td></tr><tr><td>fluorophore labeled anti-VSG antibody</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>VSG antibody is made in house</td></tr><tr><td>HMI-9 media</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>HMI-9 is made in house</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>BD Pharmingen</td><td>556463</td><td></td></tr><tr><td>CountBright absolute counting beads</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>LD columns</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>MACS magnet</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS magnetic separator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>vortex adapter-60</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>AM10014</td><td></td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>Coulter</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>flow cytometer analysis software</td><td>FloJo</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van<em&gt; trypanosoma brucei</em&gt; variant oppervlakte glycoproteïne schakelen van magnetic activated cell sorting en flowcytometrie

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, een protozoa parasiet dat zowel Humane als Dieren Afrikaanse Trypanosomiasis (bekend als slaapziekte en nagana, respectievelijk) veroorzaakt, circuleert tussen een tseetseevector en een zoogdiergastheer. Het ontwijkt het immuunsysteem van de zoogdiergastheer door periodiek de dichte, variant oppervlakteglycoproteïne (VSG) die zijn oppervlak bedekt, te veranderen. De detectie van antigene variatie in Trypanosoma brucei kan zowel omslachtig als arbeidsintensief zijn. Hier presenteren we een methode voor het kwantificeren van het aantal parasieten dat is 'overgeschakeld' om een nieuwe VSG tot expressie te brengen in een bepaalde populatie. De parasieten worden eerst gekleurd met een antilichaam tegen de start-VSG en vervolgens gekleurd met een secundair antilichaam dat aan een magnetische parel is gekoppeld. Parasieten die de start-VSG tot expressie brengen, worden vervolgens gescheiden van de rest van de populatie door de parasieten over een kolom te laten lopen die aan een magneet is bevestigd. Parasieten die de dominante, start-VSG tot expressie brengen, worden vastgehouden in de kolom, terwijl de doorstroming parasieten bevat die een nieuwe VSG tot expressie brengen, evenals enkele contaminanten die de start-VSG tot expressie brengen. Deze doorstromende populatie wordt opnieuw gekleurd met een fluorescent gelabeld antilichaam tegen de start-VSG om contaminanten te labelen en propidiumjodide (PI), dat dode cellen labelt. Een bekend aantal absolute telperlen die zichtbaar zijn door middel van flowcytometrie, wordt toegevoegd aan de doorstromende populatie. De verhouding van parels tot het aantal verzamelde cellen kan vervolgens worden gebruikt om het aantal cellen in het hele monster te extrapoleren. Flowcytometrie wordt gebruikt om de populatie van switchers te kwantificeren door het aantal PI-negatieve cellen te tellen die niet positief kleuren voor de start-dominante VSG. De verhouding van switchers in de populatie kan vervolgens worden berekend met behulp van de flowcytometrie gegevens.

De hier beschreven methode werd gebruikt om aan te tonen dat dubbelstrengs breuken in de VSG expressieplaats verhoogde het aantal overstappers in een populatie 8. Hier tonen we representatieve resultaten uit een populatie van trypanosomen die op soortgelijke wijze zijn opgewekt om een ​​dubbele breuken aan de uitdrukking website te genereren. Vergelijken we deze trypanosomen die die niet zijn geïnduceerd om een dubbelstrengs breuken gegenereerd. Figuur 1 toont...

Afrikaanse trypanosomen die in vitro gekweekt worden, ondergaan antigeenvariatie met een lage snelheid, zodat populaties bestaan uit parasieten die een dominante variant van het oppervlakteglycoproteïne (VSG) en een kleine populatie van 'geschakelde' varianten tot expressie brengen. Dit protocol beschrijft een snelle methode voor het detecteren en kwantificeren van deze populaties.

detectie van<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant oppervlakte glycoproteïne Schakelen van Magnetic Activated Cell Sorting en flowcytometrie

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Het algemene doel van deze methode is om trypanosomen die een specifiek variant surface glycoprotein of VSG tot expressie brengen te isoleren van de rest van de populatie, en om parasieten te identificeren die zijn overgeschakeld van het startende dominante VSG naar een ander VSG. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de biologie van trypanosomen, zoals welke factoren of gebeurtenissen de VSG-switching in een populatie parasieten beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze sneller is dan eerder gepubliceerde methoden en een eenvoudige kwantificering van switch- versus non-switch-cellen mogelijk maakt.Toen het laboratorium voor het eerst onderzoek deed naar antigenvariatie, was het eerste probleem hoe zeldzame 'switchers' gedetecteerd konden worden. Dit soort probleem was een aantal jaar geleden in de immunologie al opgelost door middel van magnetisch geactiveerde cel sortering om cellen te verrijken die negatief waren voor een bepaald kenmerk. Het overzetten van dit non-selectieproces naar antigenvariatie leek een zeer veelbelovend idee.Om te beginnen moeten bloodstream trypanosomen van de Lister 427-stam worden gekweekt tot een dichtheid van 0,5 tot 100.000 per milliliter. Aliquoteer een monster van 50 × 10⁶ cellen in een buis van 15 milliliter en centrifugeer deze vervolgens. Bewaar 1 × 10⁶ cellen en kweekmedium om later te gebruiken als positieve en negatieve antilichaamcontroles.Pipette het grootste deel van het supernatant af, waarbij ongeveer 750 µL in de buis achterblijft. Breng de cellen over naar een centrifugebuis van 1,5 mL. Centrifugeer de cellen ten slotte vier minuten bij 4 °C bij 2800 ×g.Pipette vervolgens al het supernatant af. Resuspendeer de cellen in 150 µL kweekmedium, aangevuld met het primaire anti-variant surface glycoprotein antilichaam of anti-VSG in de juiste verdunning. Vortex de cellen daarna gedurende 10 minuten bij 4 °C.Was met 800 tot 1000 µL koud cultuurmedium. Centrifugeer de cellen bij 4 °C gedurende vier minuten bij 5200 ×g. Nadat het supernatant is afgezogen, worden de cellen gewassen met 1 mL cultuurmedium en opnieuw gecentrifugeerd.Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 100 µL kweekmedium. Voeg 110 µL magnetisch-geactiveerde cel-sorteringsmicrobeads toe van het type dat geschikt is voor het primaire antilichaam. Meng goed door herhaaldelijk te pipetteren en vortex vervolgens.Terwijl de cellen worden gevortexd, wordt een magnetisch geactiveerde scheidingskolom klaargezet. Plaats een buis van 15 milliliter eronder om het primingmedium op te vangen. Voeg twee milliliter kweekmedium toe om de kolom te primen.Verwijder vervolgens het monster uit de vortexmixer en voeg 800 tot 1000 µL koud kweekmedium toe. Centrifugeer het monster en verwijder daarna het supernatant om ongebonden antilichamen te verwijderen. Was de gepelletteerde cellen met 1 mL kweekmedium en centrifugeer opnieuw.Aspireer ditmaal het supernatant, maar laat 100 µL in de buis achter. Tik stevig tegen de centrifugebuis totdat de pellet volledig is geresuspendeerd. Voeg 1 mL kweekmedium toe en pipetteer dit op en neer om de cellen volledig te resuspenderen.Verwijder de conische buis van 15 millimeter die is gebruikt voor het opvangen van het primingmedium en vervang deze door een nieuwe conische buis van 15 milliliter om het doorstroomvolume met de geswitchte parasieten op te vangen. Breng de celsuspensie aan op de geprimede kolom. Vang het doorstroomvolume op in een 15 milliliter buis eronder; dit duurt doorgaans zes tot zeven minuten voor 1 milliliter medium plus trypanosomen.Was daarna de kolom twee keer met één milliliter kweekmedium en verzamel het doorstroomvolume in dezelfde buis. Verdeel het doorstroomvolume, dat in totaal ongeveer drie milliliter moet zijn, over twee microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter. Plaats de buisjes vervolgens op ijs.Voeg drie milliliters kweekmedium toe aan de kolom en plaats de kolom in een centrifugebuis van 15 milliliter. Hiermee worden de cellen verkregen die het startende dominante VSG tot expressie brengen. Neem 300 microliters van dit eluaat op en bewaar dit op ijs; de rest kan worden weggegooid.Om een positieve controle te maken, neemt u ongeveer 100.000 cellen van de startcultuur en pipetteert u deze in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter. Herhaal dit om een negatieve controle te maken. Centrifugeer de flow-through monsters en het monster van de positieve controle.Verwijder vervolgens het supernatant en gooi dit weg. Resuspendeer de positieve controlecellen in 100 µL kweekmedium met primair fluorofoor-gelabelde anti-VSG-antilichaam in de juiste verdunning. Resuspendeer daarna één flow-throughpellet in 100 µL kweekmedium met primair fluorofoor-gelabelde anti-VSG-antilichaam in de juiste verdunning.Gebruik de suspensie om vervolgens de pellet opnieuw te suspenderen in de tweede doorstroombuis, resulterend in één poolbuis. Meng goed door herhaaldelijk op te pipetteren. Vortex de cellen en voeg vervolgens 800 tot 1000 microliters koud cultuurmedium toe.Centrifugeer de monsters vier minuten bij 5200 ×g bij vier graden Celsius en verwijder vervolgens het supernatant om ongebonden antilichamen te verwijderen. Was de cellen met één milliliter kweekmedium en centrifugeer de cellen vervolgens. De positieve en negatieve controles en de geëlueerde cellen werden vooraf op ijs bewaard.Verwijder het supernatant. Voeg daarna 148,5 µL kweekmedium toe aan de monsters. Voeg vervolgens 25 µL absolute telkralen toe, gevolgd door 1,5 µL Propidiumjodide-kleuringsoplossing.Resuspendeer de pellets van de positieve en negatieve controle in 175 µL kweekmedium. De monsters kunnen nu in de flowcytometer worden geanalyseerd. Deze flowcytometrie-plots tonen de resultaten van de celseparatie van populaties trypanosomen die zijn geïnduceerd om een dubbelstrengs DNA-breuk te veroorzaken, vergeleken met niet-geïnduceerde cellen.De linkerpanelen tonen de forward scatter tegenover de side scatter, wat inzicht geeft in de levende versus dode cellen en de aan het monster toegevoegde beads. Er kunnen vervolgens gates worden aangemaakt die deze bepalen op basis van de scatter-kenmerken. De rechterpanelen tonen uitsluitend die cellen die op basis van de in de linkerpanelen aangemaakte scatter-gates als levend konden worden geclassificeerd.De dominante start-VSG in dit geval was VSG twee. Cellen die positief kleuren voor Propidiumjodide zijn dode cellen. Deze zijn te zien in de Q1- en Q2-regio's van de plot.Cellen die positief kleuren voor het dominante VSG en negatief voor PI vallen in de Q drie-regio en zijn contaminanten. Ten slotte zijn cellen in Q vier levende cellen die negatief kleuren voor het dominante VSG, welke worden beschouwd als switchers. Deze grafiek toont de berekende waargenomen switchfrequenties van de trypanosome-populaties met versus zonder geïnduceerde breuken.Het niveau van stochastische switching in vitro is vrij laag. Hoewel het induceren van een breuk resulteert in significant meer cellen die overschakelen naar de niet-dominante VSG. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer drie uur worden uitgevoerd.tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de monsters gedurende het hele proces koud te houden en de pellets adequaat te resuspenderen, vooral voorafgaand aan de isolatie op de kolom. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals RNA-sequencing, worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke VSG's tot expressie komen in een switch-populatie. Hoewel deze methode doorgaans wordt gebruikt om VSG-switching te meten, kan deze ook worden ingezet voor de isolatie en kwantificering van parasieten die elk gewenst oppervlakte-eiwit tot expressie brengen.

detection-trypanosoma-brucei-variant-surface-glycoprotein-switching

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Magnetische modulatie biosensing systeem wordt gebruikt om snel, gevoelig en eenvoudig te detecteren biologische assays, zoals DNA-moleculen en eiwitten.

Homogene snelle detectie van biologische testen met behulp van Magnetic Modulation biosensing System

Werkwijze voor isolatie van hechtende inflammatoire leukocyten uit hersenen...

Isolatie en analyse van Brain-afgezonderd Leukocyten uit<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-geïnfecteerde muizen

De malariaparasiet binnenvalt en herhalingen binnen de rode bloedcellen. Nauwkeurige vaststelling van de merozoïet invasie en parasitemia is daarom van cruciaal belang bij de beoordeling van het verloop van de malaria-infectie. Hier beschrijven we een flowcytometrie gebaseerd protocol voor het meten van deze parameters in een muismodel van malaria.

In vivo evaluatie van het knaagdier Plasmodium parasitemia en merozoïet Invasion van flowcytometrie

Dit manuscript beschrijft het gebruik van een bioluminescente stam van Afrikaanse trypanosomen om de tracking van een late infectiefase mogelijk te maken en demonstreert hoe in vivo live beeldvorming kan worden gebruikt om infecties binnen het centrale zenuwstelsel in real-time te visualiseren.

Bioluminescentie Imaging te laat stadium Infectie van Afrikaanse trypanosomiasis Detect

Het toevoegen van een tag aan een eiwit is een krachtige manier om inzicht te krijgen in zijn functie. Hier beschrijven we een protocol om honderden Trypanosoma brucei-eiwitten parallel endogenetisch te taggen, zodat tagging op genoomschaal haalbaar is.

High-throughput Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Virussen of extracellulaire blaasjes werden immunogevangen met 15 nm magnetische nanodeeltjes gekoppeld aan antilichamen die oppervlakte-antigenen herkennen. De gevangen virionen of blaasjes werden gelabeld met fluorescente antilichamen tegen andere oppervlakte-antigenen. De resulterende complexen werden gescheiden in een hoog magnetisch veld en geanalyseerd met conventionele flowcytometers die werden geactiveerd door fluorescentie.

Flow Virometry Analyseer antigene Spectra van Virions en extracellulaire blaasjes

Deze methode van trypanosoom afscheiding van bloed is afhankelijk van hun oppervlakte lading minder negatief dan bloed zoogdiercellen. Geïnfecteerd bloed is geplaatst en worden behandeld op een anionenwisselaar kolom. Deze methode, de meest passende diagnose voor slaapziekte, biedt gezuiverde parasieten voor immunologische, biologische, biochemische, farmaceutische en moleculaire biologie onderzoek.

Zuivering van extracellulaire trypanosomen, met inbegrip van Staten in Afrika, van bloed door Anion-wisselaars (Diethylaminoethyl-gemengd met cellulose kolommen)

Fijne naald aspiratie is een techniek, waarbij cellen worden verkregen uit een laesie of orgaan met behulp van een dunne naald. Aspirated materiaal is besmeurd, gekleurd en onderzocht onder een Microscoop voor diagnose of gebruikt voor moleculaire biologie, cytometrie of in vitro analyse. Het is goedkope, eenvoudig, snel en veroorzaakt een minimaal trauma.

Detectie van Extravasculaire Trypanosoma -parasieten door fijne naald aspiratie

Het algemene doel van dit protocol is om instructies te geven over het meten van de capaciteit van antilichamen aanwezig in sera of plasma van individuen, van nature blootgesteld aan Plasmodium falciparum infectie, om fagocytose van de parasiet-geïnfecteerde erytrocyten (IEs) te opsoniseren en induceren.

Het meten van natuurlijk verworven phagocytose-inducerende antilichamen tegen Plasmodium falciparum parasieten door een Flow Cytometrie-Gebaseerde Test

Wereldwijd werden medische bloedparasieten automatisch gescreend met behulp van eenvoudige stappen op een low-code AI-platform. De prospectieve diagnose van bloedfilms werd verbeterd door gebruik te maken van een objectdetectie- en classificatiemethode in een hybride deep learning-model. De samenwerking van actieve monitoring en goed getrainde modellen helpt bij het identificeren van hotspots van trypanosoomtransmissie.

Superieure automatische identificatie van trypanosoomparasieten door gebruik te maken van een hybride deep-learning-model

We beschrijven een methode om te bestuderen hoe pH reageert op omgevingssignalen in de glycosomen van de bloedbaanvorm van Afrikaanse trypanosomen. Deze aanpak omvat een pH-gevoelige erfelijke eiwitsensor in combinatie met flowcytometrie om de pH-dynamiek te meten, zowel als een tijdverlooptest als in een high-throughput screen-formaat.

Meten van dynamische glycosomale pH-veranderingen bij levende Trypanosoma brucei

Leer hoe je Trypanosoma brucei met specifieke variant oppervlakte glycoproteïnen isoleert met magnetische celscheiding en flowcytometrie. Deze methode detecteert zeldzame switchers sneller dan eerdere technieken.

detectie van Trypanosoma brucei Variant oppervlakte glycoproteïne Schakelen van Magnetic Activated Cell Sorting en flowcytometrie (Video) | JoVE Journal

detectie van

Meer video's verkennen