detectie van Trypanosoma brucei Variant oppervlakte glycoproteïne Schakelen van Magnetic Activated Cell Sorting en flowcytometrie
19 oktober 2016
Afrikaanse trypanosomen die in vitro gekweekt worden, ondergaan antigeenvariatie met een lage snelheid, zodat populaties bestaan uit parasieten die een dominante variant van het oppervlakteglycoproteïne (VSG) en een kleine populatie van 'geschakelde' varianten tot expressie brengen. Dit protocol beschrijft een snelle methode voor het detecteren en kwantificeren van deze populaties.
Het algemene doel van deze methode is om trypanosomen die een bepaalde variant oppervlakteglycoproteïne of VSG uitdrukken te isoleren van de rest van de populatie en parasieten te identificeren die zijn overgestapt van de startdominante VSG naar een andere VSG. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de trypanosoombiologie, zoals welke factoren of gebeurtenissen de VSG-switching in een populatie parasieten beïnvloeden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het sneller is dan eerder gepubliceerde methoden en gemakkelijke kwantificering mogelijk maakt van de switch naar niet-switch cellen.
Toen het lab voor het eerst begon met werken aan antigeenvariatie, was het eerste probleem hoe zeldzame switchers te detecteren. Dit soort probleem was eigenlijk al een aantal jaren geleden opgelost in de immunologie, door het gebruik van magnetisch geactiveerde celsortering om cellen te verrijken die negatief waren voor een bepaald kenmerk. Het overbrengen van niet-selectieproces naar antigeenvariatie leek een veelbelovend idee.
Om te beginnen, moeten Lister 427-stam bloedstroom trypanosomen worden gekweekt tot een dichtheid van 0,5 tot 100.000 per milliliter. Deel een 50 maal 10 tot de zesde celmonster op in een 15 milliliter buis en centrifugeer vervolgens. Bewaar een maal 10 tot de zesde cellen en kweek om later te worden gebruikt als positieve en negatieve antilichaamcontroles.
Pipetteer het grootste deel van het supernatant af en laat ongeveer 750 microliter in de buis. Breng de cellen over in een 1,5 milliliter centrifugeerbuis. Centrifugeer de cellen vervolgens bij vier graden Celsius gedurende vier minuten bij 2800 maal g.
En pipeteer vervolgens al het supernatant af. Resuspendeer cellen in 150 microliter kweekmedium, plus primaire anti variant oppervlakteglycoproteïne antilichaam of anti VSG bij de juiste verdunning. Vorm vervolgens de cellen bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.
Was met 800 tot 1000 microliters koud kweekmedium. Centrifugeer de cellen bij vier graden Celsius gedurende vier minuten bij 5200 maal g. Na het aspireren van het supernatant, was de cellen met één milliliter kweekmedium en centrifugeer opnieuw.
Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 100 microliter kweekmedium. Voeg 110 microliters magnetisch geactiveerde celsortering microbeads van het juiste type voor het primaire antilichaam toe. Meng goed door op en neer te pipetteren en vorm vervolgens.
Terwijl de cellen worden voorgevormd, zet een magnetisch geactiveerde scheidingskolom op. Plaats een 15 milliliter buis eronder om het primingmedium te verzamelen. Voeg twee milliliters kweekmedium toe om de kolom te primen.
Vervolgens verwijdert u het monster van de voorvorming en voegt u 800 tot 1000 microliters koud kweekmedium toe. Centrifugeer het monster en verwijder vervolgens het supernatant om ongebonden antilichaam te verwijderen. Was de gepelletiseerde cellen met één milliliter kweekmedium en centrifugeer opnieuw.
Aspirieer dit keer het supernatant maar laat 100 microliter in de buis. Draai krachtig met de centrifugeerbuis totdat het pellet volledig is gesuspendeerd. Voeg één milliliter kweekmedium toe en pipetteer op en neer om de cellen volledig te resuspenderen.
Verwijder de 15 millimeter conische buis die wordt gebruikt om het primingmedium te verzamelen en vervang het door een nieuwe 15 milliliter conische om de flow-through met de overgeschakelde parasieten te verzamelen. Breng de celsuspensie aan op de geprimeerde kolom. Verzamel de flow-through in een 15 milliliter buis hieronder, wat meestal zes tot zeven minuten duurt voor één milliliter medium plus trypanosomen.
Was vervolgens de kolom twee keer met één milliliter kweekmedium en verzamel de flow-through in dezelfde buis. Verdeel de flow-through, die ongeveer drie milliliter moet zijn, in twee 1,5 milliliter microcentrifugebuizen. Plaats vervolgens de buizen op ijs.
Voeg drie milliliters kweekmedium toe aan de kolom en dompel de kolom in een 15 milliliter centrifugeerbuis. Dit zal de cellen verkrijgen die het startdominante VSG uitdrukken. Verwijder 300 microliter van dit eluteerde materiaal en bewaar het op ijs, de rest kan worden weggegooid.
Om een positieve controle te maken, neem ongeveer 100.000 cellen uit de startcultuur van cellen en pipeteer ze in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Herhaal dit om een negatieve controle te maken. Centrifugeer de flow-through monsters en het positieve controlemonster.
En verwijder vervolgens en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de positieve controlecellen in 100 microliter kweekmedium met primaire fluorofoor-gelabeld anti VSG-antilichaam bij de juiste verdunning. Resuspendeer vervolgens één flow-through pellet in 100 microliter kweekmedium met primaire fluorofoor-gelabeld anti VSG-antilichaam bij de juiste verdunning.
Gebruik de suspensie om vervolgens het pellet in de tweede flow-throughbuis te resuspenderen, wat resulteert in één poolbuis. Meng goed door op en neer te pipetteren. Vorm de cellen en voeg vervolgens 800 tot 1000 microliters koud kweekmedium toe.
Centrifugeer de monsters bij vier graden Celsius gedurende vier minuten bij 5200 maal g en gooi vervolgens het supernatant weg om eventuele ongebonden antilichamen te verwijderen. Was de cellen met één milliliter kweekmedium, centrifugeer vervolgens de cellen. De positieve en negatieve controles en de eerder op ijs opgeslagen eluteerde cellen.
Gooi het supernatant weg. Voeg vervolgens 148,5 microliter kweekmedium toe aan de monsters. Voeg vervolgens 25 microliter absolute telbeads toe, gevolgd door 1,5 microliter Propidiumjodide-kleuringsoplossing.
Resuspendeer de positieve en negatieve controlepellets met 175 microliter kweekmedium. De monsters kunnen nu worden gebruikt op de flowcytometer. Deze flowcytometrieplotten tonen de resultaten van celscheiding uit populaties van trypanosomen die zijn geïnduceerd om een dubbelstrengs DNA-breuk te creëren versus niet-geïnduceerde cellen.
De linker panelen tonen de voorwaartse versus zijwaartse verstrooiing, wat toelichting geeft op de levende versus dode cellen en de parels die aan het monster zijn toegevoegd.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een snelle methode voor het isoleren van Afrikaanse trypanosomen die specifieke variant oppervlakteglycoproteïnen (VSG's) tot expressie brengen en het identificeren van gewisselde varianten binnen populaties. De techniek verbetert de detectie van zeldzame switchers, wat de studie naar antigene variatie bij deze parasieten faciliteert.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Microbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Afrikaanse trypanosomen vertonen antigene variatie, wat hun overleving en infectiviteit beïnvloedt.
- Inzicht in VSG-switching is essentieel voor het ontwikkelen van strategieën tegen trypanosomiasis.
- Eerdere methoden voor het detecteren van switchers waren tijdrovend en minder efficiënt.
- Deze studie maakt gebruik van magnetisch geactiveerde cel sortering voor een verbeterde detectie.
Doel van de studie
- Om trypanosomen die specifieke VSG's tot expressie brengen te isoleren uit gemengde populaties.
- Om parasieten te identificeren die zijn overgeschakeld van het dominante VSG-type.
- Om factoren te onderzoeken die VSG-switching beïnvloeden.
Gebruikte methoden
- Magnetisch geactiveerde cel sortering om specifieke celtypen te verrijken.
- Kwantitatieve analyse van VSG-expressie in trypanosoompopulaties.
- Isolatie van zeldzame switch-varianten uit dominante populaties.
- Vergelijking van switch-snelheden tussen verschillende VSG-typen.
Belangrijkste resultaten
- De methode isoleert en kwantificeert succesvol VSG-expresserende trypanosomen.
- Het demonstreert een snellere detectie van zeldzame switchers in vergelijking met eerdere technieken.
- Inzichten verkregen in de dynamiek van VSG-switching in trypanosomenpopulaties.
- Potentiële implicaties voor het begrijpen van trypanosomiasis en het ontwikkelen van behandelingen.
Conclusies
- Deze methode biedt een significante vooruitgang in het bestuderen van antigenische variatie bij trypanosomen.
- Het opent nieuwe wegen voor onderzoek naar de mechanismen van VSG-switching.
- De efficiëntie van de techniek kan toekomstige studies in de biologie van trypanosomen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het detecteren van zeldzame antigene varianten in pathogenpopulaties is cruciaal voor het begrijpen van mechanismen voor immuunontwijking en het informeren van therapeutische strategieën. Deze methode maakt een snelle kwantificering van switchers van variant surface glycoprotein in trypanosomenpopulaties mogelijk, wat bijdraagt aan het minimaliseren van risico's bij het selecteren van targets in de ontdekking van antiparasitaire geneesmiddelen. De aanpak biedt een schaalbare, reproduceerbare workflow voor het monitoren van fenotypische switching die relevant is voor preklinische targetvalidatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar antigenische variatie mogelijk als mechanisme voor immuunontwijking in pathogeenpopulaties.
- Operationele waarde: Biedt een snelle, kwantitatieve uitlezing van de schakelingsfrequentie ter ondersteuning van hypothesetests over genetische of omgevingsfactoren.
- Voorspellende waarde: Faciliteert een vroege beoordeling van de stabiliteit van het doelwit en resistentiemechanismen bij het screenen van antiparasitaire verbindingen.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert een gezuiverde flow-through populatie, verrijkt met switcher-fenotypes, die geschikt is voor downstream functionele of genomische analyse.
- Kwantitatieve output: Maakt gebruik van absolute telkralen en flowcytometrie om absolute kwantificering van de switcher-frequentie per monster mogelijk te maken.
- Reproduceerbaarheid: Magnetische scheiding en gestandaardiseerde kleuring verminderen de variabiliteit bij het isoleren van zeldzame varianten uit dominante populaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor de ziekte: Modelleert direct een belangrijk virulentiemechanisme bij Afrikaanse trypanosomiasis, wat de validiteit van het preklinische model ondersteunt.
- Mechanische risicoreductie: Maakt het mogelijk om schakelsnelheden te correleren met geïnduceerde genetische perturbaties (bijv. DNA-breuken) om causale relaties te valideren.
- Translationele continuïteit: Geïsoleerde schakelaarpopulaties kunnen worden gebruikt voor RNA-seq of proteomics om tot expressie gekomen VSG's te identificeren, waardoor het fenotype aan het genotype wordt gekoppeld.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot lead-optimalisatie door een fenotypische readout te bieden van targetmodulatie en het ontstaan van resistentie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-gestuurd onderzoek naar factoren die VSG-switching beïnvloeden, zoals DNA-schade of stressresponsen.
- Screening: Maakt de preparatie van populations verrijkt met switchers mogelijk voor tests van verbinding-gevoeligheid of resistentieprofilering.
- Analyses: Flowcytometrie met PI- en anti-VSG-kleuring levert kwantitatieve, multiparametrische gegevens over de live/dead-status en antigeenexpressie.
- Translationeel onderzoek: Geïsoleerde switcher-fracties ondersteunen vervolgonderzoek via omics om het antigenische repertoire in resistente subpopulaties te karakteriseren.
- Toepasbaarheid in andere contexten: De workflow voor magnetische scheiding en flowcytometrie kan worden aangepast om switching te monitoren in andere antigenisch variabele pathogenen of recombinante eiwitexpressiesystemen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij antigeenswitching door directe, kwantitatieve meting van zeldzame fenotypische varianten mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Standaardiseert de isolatie en kwantificering van switchers, waardoor de doorvoersnelheid verbetert in vergelijking met arbeidsintensieve klonerings- of sequentiemethoden.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door doelwitinstabiliteit of resistentiemechanismen vroegtijdig in de ontdekkingsfase te onthullen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van targets met een lage switchfrequentie of een hoge genetische barrière voor resistentie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in parasietkweek, antilichaamskleuring en magnetisch geactiveerde cel sortering.
- Afhankelijk van toegang tot flowcytometers met fluorescentie- en scatterdetectiecapaciteiten.
- Vereist gestandaardiseerde antilichaamreagentia en titratie voor specifieke VSG-isovormen om kruisreactiviteit te voorkomen.
- Aanpassing aan andere systemen vereist validatie van de efficiëntie van de magnetische kraalenscheiding en de toegankelijkheid van antilichamen voor oppervlaktetargets.
- Praktische beperkingen omvatten potentiële contaminatie door onvolledige scheiding en de noodzaak van levensvatbaarheidskleuring om dode cellen uit te sluiten.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
Sample Harvesting
2:05
Magnetic Labeling
4:05
Magnetic Separation
5:45
Staining and Identification of Contaminants and Switchers
7:32
Results: Induced Double-strand DNA Breaks Increase the Frequency of Switchers in a Population
9:01
Conclusion
