Analyse van eiwit import in chloroplasten Geïsoleerd van Stressed Planten
1 november 2016
Hier beschrijven we een nieuwe methode om eiwit import te bestuderen in geïsoleerde chloroplasten onder stress. De werkwijze is eenvoudig en snel, en kan worden toegepast op de gevolgen van verschillende stress voor chloroplast eiwitimport en de overeenkomstige regulerende mechanismen te bestuderen.
Het algemene doel van deze methodologie is om de import van nucleair gecodeerde eiwitten in chloroplasten te bestuderen, met een bijzondere focus op de effecten van stress. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van chloroplasten, zoals hoe de import van eiwitten in chloroplasten wordt gereguleerd. Een bijzonder voordeel van deze techniek is dat het de effecten van stress op de import van chloroplast-eiwitten mogelijk maakt om te beoordelen.
Hoewel deze methode is ontwikkeld voor gebruik met de modelplant Arabidopsis thaliana, zou het kunnen worden aangepast voor gebruik met andere systemen, zoals gewasplanten. De procedure zal worden gedemonstreerd door Qihua Ling, een postdoc uit mijn laboratorium. Om te beginnen, kweek eerst de Arabidopsis-planten zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.
Als de planten acht dagen oud zijn, voer een stressbehandeling uit. Schraap de planten voorzichtig met de hand van de agarplaat en plaats ze in een gesteriliseerde flacon met vloeibaar MS-medium dat de stressor bevat. Afhankelijk van de aard van het experiment kan het ook nodig zijn om extra planten in een vergelijkbare flacon zonder stressor als controle te plaatsen.
Dek de mond van de flessen af met gesteriliseerde folie en laat de planten nog twee dagen groeien op een orbitale shaker met zacht schudden. Bereid een continue dichtheidsgradiënt voor door eerst 13 milliliter Percoll, 13 milliliter van twee keer chloroplast-isolatiebuffer en vijf milligram glutathion in een 50 milliliter centrifugeerbuis te mengen. Centrifugeer vervolgens het mengsel.
Na centrifugatie, moet de buis voorzichtig worden gehanteerd om verstoring van de gradiënt te voorkomen, en moet deze op ijs worden bewaard voor later gebruik. Breng vervolgens 100 milliliter chloroplast-isolatiebuffer per conditie over naar een ene liter beker. Verwijder de zaailingen uit het vloeibare medium door ze in een zeef te kantelen.
Breng ze vervolgens over in de beker met chloroplast-isolatiebuffer. Spoel het weefsel met de buffer om eventueel restmedium te verwijderen en vervang vervolgens de buffer door 100 milliliter verse isolatiebuffer. Voor de eerste ronde homogenisatie, breng het plantenweefsel met de hand over in een 50 milliliter beker door het vorige buffer door uw vingers te laten lopen.
Plaats vervolgens de sonde van de weefselhomogenisator in het weefsel en homogeniseer met twee pulsen van één tot twee seconden. Filtreer het homogenaat door twee lagen filterdoek in een 250 milliliter centrifugeerbuis. Maak het af door voorzichtig het doek te knijpen.
Bewaar het filtraat en breng het plantenweefsel terug naar de 50 milliliter beker. Plaats vervolgens een tweede 20 milliliter chloroplast-isolatiebuffer in de 50 milliliter beker en voeg eventueel overgebleven weefsel toe dat niet in de eerste ronde homogenisatie is gebruikt. Herhaal de homogenisatie- en filtratiestappen nog vier keer.
Centrifugeer het verzamelde homogenaat bij 1.000 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Giet het supernatant onmiddellijk na centrifugatie af, zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort. Plaats de buis op ijs en suspendeer de pellet in het resterende supernatant door de buis voorzichtig te schudden.
Gebruik vervolgens een Pasteur-pipet om het homogenaat voorzichtig over te brengen naar de bovenkant van de voorbereide continue dichtheidsgradiënt via de wand van de ontvangende buis. Centrifugeer vervolgens het monster en de gradiënt in een zwaaiende emmerrotor bij 7.800 keer g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius met de rem uit. Wanneer u klaar bent, observeer de twee groene banden die in de gradiënt te zien zijn.
Gooi de bovenste band weg, die gebroken chloroplasten bevat, en gebruik een Pasteur-pipet om de onderste band met intacte chloroplasten over te brengen naar een nieuwe 50 milliliter centrifugeerbuis. Voeg vervolgens 25 milliliter HMS-buffer toe aan de buis en draai de buis twee keer om de Percoll van de chloroplasten te wassen. Plaats vervolgens de buis terug in de zwaaiende emmerrotor en centrifugeer de chloroplasten opnieuw.
Giet het supernatant af en suspendeer de pellet in het resterende buffer door de buis voorzichtig op ijs te schudden. Voeg indien nodig nog eens 100 tot 300 microliter van de HMS-buffer toe, maar probeer het monster niet te veel te verdunnen. Bewaar de gesuspendeerde chloroplasten op ijs.
Begin met het toevoegen van vijf microliter van de geïsoleerde chloroplasten aan 495 microliter HMS-buffer in een 1,5 milliliter buis. Draai de buis om de oplossing voorzichtig te mengen. Plaats vervolgens een dekglas op de telkamer van een hemocytometer.
Pipet langzaam 40 tot 60 microliter van de verdunde chloroplastensuspensie in de opening tussen het dekglas en de telkamer. Gebruik een fasecontrastmicroscoop om de chloroplasten te bekijken met een 20x objectief. Intact chloroplasten zien er rond en helder uit en zijn omgeven door een halo van licht.
Gebruik vervolgens het 10x objectief om het aantal chloroplasten in 10 grote vierkantjes te tellen. Het aantal chloroplasten per groot vierkantje zou tussen de 10 en 30 moeten zijn. Als er te weinig of te veel chloroplasten aanwezig zijn, pas dan de verdunningsfactor aan en herhaal de procedure.
Eenmaal binnen het juiste bereik, bereken het aantal chloroplasten per milliliter zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Om een tijdsverloop met drie tijdstippen uit te voeren, bereid drie buizen voor, elk met een 130 microliter aliquot van import stop buffer, en laat ze op ijs staan. Bereid in een twee milliliter buis de importreactie voor met de reactiebuffer en radioactief gelabeld precursor-eiwit.
Merk op dat er één reactie zou moeten zijn voor elke conditie die getest zal worden. Gebruik ongeveer 10 miljoen chloroplasten per tijdstip. Incubeer de reactiebuis bij 25 graden Celsius in een waterbad onder een beperkte hoeveelheid licht.
Schud de buizen af en toe om de chloroplasten opnieuw te suspenderen. Om een tijdsverloop uit te voeren, met 130 milliliter aliquots van de reactie op de ver
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe methode voor het bestuderen van eiwitimport in geïsoleerde chloroplasten, in het bijzonder onder stressomstandigheden. De techniek is ontworpen om snel en eenvoudig te zijn, waardoor onderzoekers de regulerende mechanismen die betrokken zijn bij de eiwitimport in chloroplasten kunnen onderzoeken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Plantbiologie
- Chloroplastfunctie
- Stressfysiologie
Achtergrond
- Chloroplasten zijn essentieel voor fotosynthese en metabole processen in planten.
- Het begrijpen van de eiwitimport in chloroplasten is cruciaal voor het ontrafelen van hun functie onder stress.
- Stressomstandigheden kunnen de mechanismen van eiwitimport in chloroplasten aanzienlijk beïnvloeden.
- Deze methode is ontwikkeld met behulp van Arabidopsis thaliana, maar kan worden aangepast voor andere plantensystemen.
Doel van de studie
- Om te onderzoeken hoe stress de import van in de kern gecodeerde eiwitten in chloroplasten beïnvloedt.
- Om de regulatiemechanismen te verkennen die de eiwitimport in chloroplasten aansturen.
- Om een betrouwbare methodologie te bieden voor toekomstig onderzoek in de chloroplastbiologie.
Gebruikte methoden
- Groei van Arabidopsis-planten gevolgd door een stressbehandeling.
- Preparatie van chloroplasten met behulp van een continue dichtheidsgradiënt.
- Homogenisatie en filtratie van plantenweefsel om chloroplasten te isoleren.
- Tijdsverloop-experimenten om de import van eiwitten in chloroplasten te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt het mogelijk om de import van chloroplasteiwitten onder verschillende stresscondities te beoordelen.
- Chloroplasten kunnen effectief worden geïsoleerd, waarbij hun integriteit behouden blijft voor verdere analyse.
- De resultaten tonen de impact van stress op de efficiëntie van de eiwitimport aan.
- Deze techniek kan worden toegepast op verschillende plantensoorten naast Arabidopsis.
Conclusies
- De nieuwe methode biedt inzicht in de effecten van stress op de chloroplastfunctie.
- Het biedt een waardevol instrument voor onderzoekers die chloroplastbiologie en stressresponsen bestuderen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methodologie om verdere regulatiemechanismen te onderzoeken.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Inzicht in hoe abiotische stress de import van chloroplasteiwitten reguleert, biedt mechanistische inzichten in de stressbestendigheid van planten, een cruciale factor voor de stabiliteit van de gewasopbrengst onder veldomstandigheden. Deze methode maakt een snelle beoordeling mogelijk van het transport van kerngecodeerde eiwitten naar chloroplasten, wat bijdraagt aan de validatie van targets in plantgebaseerde bioproductiesystemen. Door importpercentages onder gecontroleerde stress te kwantificeren, kunnen onderzoekers hypothesen over organelspecifieke stresssignaleringspaden die relevant zijn voor agrarische biotechnologie, verder valideren en risico's beperken.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door stress-geïnduceerde veranderingen in de import van chloroplast-eiwitten te koppelen aan regulatoire mutanten zoals sp1.
- Operationele waarde: Maakt functionele validatie mogelijk van chloroplast-enveloppetranslocons als stress-responsieve drug targets in de metabole engineering van planten.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door genotypen te identificeren met veranderde kinetiek van eiwitimport onder osmotische stress of zoutstress.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Levert geïsoleerde, intacte chloroplasten die geschikt zijn voor gestandaardiseerde importassays met gebruik van radioactief gemerkte precursorproteïnen.
- Kwantitatieve output: Genereert tijdreeksgegevens waardoor vergelijking van importrates tussen genotypen en stresscondities mogelijk is.
- Schaalbaarheid: Maakt gebruik van dichtheidsgradiëntcentrifugatie om chloroplasten uit vloeibare culturen te isoleren, aanpasbaar aan high-throughput formats.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelatie: Verbindt ontregeling van chloroplast-eiwitimport met abiotische stresffenotypes, wat bijdraagt aan transgene benaderingen voor stressbestendige gewassen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen importassays in de ontdekkingsfase en preklinische validatie van stressbeschermende eigenschappen in plantmodellen.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijkt of de waargenomen stresffenotypes voortkomen uit een gewijzigde eiwitimport in plaats van uit downstream metabole effecten.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode past binnen de workflow voor ontdekkingsbiologie, waarbij chloroplastisolatie en importassays voorafgaan aan de identificatie van lead-moleculen in synthetische biologie-pipelines voor planten.
- Discovery Biology: Test hypothesen over stressregulatie van eiwitimport door de verwerking van precursoren (bijv. PsaD-rijping) als functionele readout te meten.
- Screening: Produceert reproduceerbare chloroplast-preparaten die kwantitatieve beoordeling van importkinetiek over verschillende genetische achtergronden mogelijk maken.
- Analytics: Maakt gebruik van SDS-PAGE en autoradiografie om importafhankelijke eiwitverwerking te kwantificeren, ter ondersteuning van vergelijkende conditionele analyses.
- Translationeel Onderzoek: Koppelt resultaten van importassays aan stresstolerantie-fenotypes, wat beslissingen over de verdere ontwikkeling in trait-pipelines informeert.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerd chloroplast-isolatieprotocol dat toepasbaar is op meerdere stresscondities en plantensoorten.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door de functie van het sp1-eiwit te koppelen aan stressspecifieke importregulatie.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde chloroplastisolatie en verificatie van de intactheid via microscopie.
- Strategische waarde: Vermindert het risico op falen in een laat stadium door vroege risicoreductie van stressresponsimechanismen bij chloroplast-engineering.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van genetische targets mogelijk op basis van stressgemoduleerde eiwitimportfenotypes.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in plantencel-fractionering, de omgang met radiolabels en de beoordeling van de chloroplast-integriteit.
- Afhankelijk van centrifuges met een swing-out rotor, hemocytometers en fosforimagers voor kwantificering.
- Vereist gestandaardiseerde bereiding van chloroplast-isolatiebuffer en HMS-buffer tussen laboratoria.
- Moet rekening houden met variabiliteit in de opbrengst en intactheid van chloroplasten bij vergelijkingen tussen stresscondities of genotypen.
- Beperkt door de noodzaak van radioactieve precursor-eiwitten, wat gespecialiseerde veiligheidsprotocollen en afvalverwerking vereist.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
Growth of Arabidopsis Plants and the Stress Treatment
1:34
Chloroplast Isolation
5:06
Analysis of the Yield and the Intactness of Chloroplasts
6:19
Chloroplast Protein Import
8:04
Results: Chloroplast Import of the PsaD Protein Is Elevated in the sp1 Mutant under Stress Conditions
9:12
Conclusion
