Name: Analyse van eiwit import in chloroplasten Geïsoleerd van Stressed Planten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Leer een snelle methode voor eiwitimport in chloroplasten van stress-geëxposeerde planten met Arabidopsis thaliana. Deze techniek onthult regulerende mechanismen en is aanpasbaar voor gewassen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​aan PJ van de Biologie en Biotechnologie Sciences Research Council (BBSRC; verlenen ref BB / K018442 / 1.).

1. Groei van Arabidopsis planten en de stressbehandeling <ol><li> Bereid 1 l Murashige en Skoog (MS) medium door toevoeging van 4,3 g MS basaal zoutmengsel, 10 g sucrose, 0,5 g 2- (N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES) met gedeïoniseerd water tot 1 l, en pas de pH op 5,7 met kaliumhydroxide (KOH). Voeg 6 g phytoagar en autoclaaf gedurende 20 minuten bij 120 ° C. <ol><li> Voordat stollen, giet het medium in round Petri platen (diameter 9 cm, hoogte 1,5 cm, met 20 - 25 ml MS-medium per plaat). Laat de platen voor ~ 1 uur in een laminaire stroming kap drogen voordat het sluiten van de deksels. </li></ol></li><li> Plaats Arabidopsis thaliana zaden in een 1,5 mL reageerbuis oppervlaktesterilisatie door toevoeging van 1 ml 70% (v / v) ethanol dat 0,02% (v / v) Triton X-100 en voortdurend schudden gedurende 5-10 min. Voor elk genotype / conditie, bereiden 10 Petri platen die elk ~ 100-150 zaailingen. </li><li> Wacht ongeveer 10 seconden totdat de zaden af ​​te wikkelen naar debodem van de buis, en dan gooi het supernatant door pipetteren. Voeg 1 ml 100% ethanol, en schud de buis opnieuw voor 10 min. </li><li> Bereid de laminaire stroming kap, terwijl de zaden zijn steriliseren. Neem een ​​stuk filterpapier per monster, vouw het in de helft van de inzaai te vergemakkelijken, en laat deze in 100% ethanol in de kap. Wacht tot het droogt volledig uit. Merk op dat 100% ethanol wordt gebruikt als het sneller dan 70% ethanol verdampt. </li><li> Breng de zaden op het filterpapier door pipetteren met een 1 ml pipet tip cut ~ 5 mm van het fijne einde. Laat ze drogen, die ongeveer 10 moet nemen - 15 min. </li><li> Zaai ~ 100-150 gesteriliseerde zaden gelijkmatig op elke MS-medium Petri plaat, en sluit elke plaat met chirurgische tape. </li><li> Bewaar de platen ondersteboven op 4 ° C gedurende 2 - 4 d aan te moedigen en te synchroniseren kieming. Oude zaden kan nodig zijn om langer bij 4 ° C blijven (tot een week). </li><li> Breng de platen om een ​​plant weefselkweek kamer en laat ze op zijn kop op.Groeien de planten gedurende 8 d onder een lange-daagse cyclus (16 h 100 umol m · - · 2 s - 1 licht, 8 uur donker) bij 20 ° C. </li><li> Tegen stress behandeling, wanneer de planten zijn 8 d oud, in de stroom kap, breng ze uit het agar medium, door ze voorzichtig af te schrapen met de hand dragen-ethanol gesteriliseerde handschoenen, in een gesteriliseerde fles van vloeibaar MS medium dat de stressor (bv , 200 mM mannitol). Vermijd overdracht agar medium. Bedek de kolf mond gesteriliseerde folie en laat de planten groeien onder dezelfde omstandigheden als in stap 1,8 gedurende nog 2 d op een orbitale schudder onder zacht schudden (-100 rpm). </li></ol> 2. Het maken van een Precursor eiwit door in vitro transcriptie / translatie Opmerking: Dit protocol veronderstelt het gebruik van Arabidopsis fotosysteem I subeenheid D precursor (pPsaD) als de matrijs / preproteïne, maar de methode is geschikt voor anderen. <ol&gt; <li> Kloon de coderende sequentie (CDS) van pPsaD in de meervoudige kloneringsplaats (MCS) van het pBlueScript II SK vector (of een soortgelijke vector met een stroomopwaartse T7-promoter) 13. Zuiveren het plasmide (pBSK-pPsaD) met behulp van een DNA-isolatie kit en controleer de sequentie door DNA-sequencing. LET OP: Al deze stappen maken gebruik van standaard moleculaire kloontechnieken. </li><li> Bepaal de pBSK-pPsaD plasmide-DNA-concentratie onder toepassing van een spectrofotometer ingesteld op absorptie gemeten bij 260 nm. Verdun het plasmide tot een eindconcentratie van 10 ng / ul. </li><li> Voer een 20 ul PCR (35 cycli) met de verdunde plasmide als matrijs. Bereid de reactie als volgt: 2 gl 10 x polymerase buffer, 2 pl 2 mM dNTP, 1 ul 5 mM M13 voorwaartse primer (5&#39;-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 &#39;), 1 ui 5 mM M13 reverse primer (5 &#39;-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3&#39;), 1 pl verdund pBSK-pPsaD plasmide, 1 U Taq polymerase en gedestilleerd water om het totale reactievolume aan te20 pi. Gebruik een standaard PCR-programma, als volgt: 95 ° C, 5 min; 35 cycli van [95 ° C, 30 sec; 56 ° C, 30 sec; 72 ° C, 30 sec); en 72 ° C, 5 min. </li><li> Run 5 pi van het PCR product op een 1% (w / v) agarosegel in TAE buffer (Tris-HCl, pH 7,6, 20 mM azijnzuur, 1 mM EDTA) om correcte amplificatie van het cDNA controleren en kwantificeren van de relevante band opzichte van normen om de concentratie te bevestigen. Bewaar de rest van het product bij -20 ° C voor verdere toepassingen. </li><li> Bereid een 50 pi reactie met een konijnen reticulocyten lysaat gebaseerde celvrije transcriptie / translatiesysteem compatibel met PCR DNA, als volgt: 40 pl reticulocytlysaat van het transcriptie / translatiesysteem, 2,5 gl radioactief gemerkt [35S] methionine, 11 uCi / ml (specifieke activiteit&gt; 1000 Ci / mmol), 2,5 ui steriel gedistilleerd water en 5 ui pPsaD PCR product (100-800 ng). Let op: Draag handschoenen, laboratorium kleding en veiligheid glasses bij de omgang met radioactief materiaal. Bewaken en te ontsmetten het werkoppervlak en de uitrusting. Gooi alle radioactief afval in een erkende afvalcontainer. </li><li> Incubeer het reactiemengsel gedurende 90 min in een 30 ° C waterbad. Stop de reactie door het plaatsen van het monster op het ijs. </li><li> Verwijderen 1 pi van de reactie als een testmonster (hetzelfde volume kan ook dienen als input control voor stap 5,7) ter controle op standaard natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) gevolgd door autoradiografie, fluorografie en fosfor beeldvorming. Een goed resultaat wordt aangegeven door de waarneming van een duidelijke en sterke band die overeenkomt met het molecuulgewicht van pPsaD (~ 23 kD). Bewaar de rest van het reactiemengsel bij -80 ° C voor verdere toepassingen. </li></ol> 3. Chloroplast Isolation <ol><li> Bereid de volgende voorraad oplossingen: <ol><li> Bereid Chloroplast Isolation Buffer (CIB, 2x): 0,6 M sorbitol, 10 mM magnesiumchloride(MgCl2), 10 mM ethyleenglycol-azijnzuur (EGTA), 10 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 20 mM natriumbicarbonaat (NaHCO3), 40 mM 4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethaansulfonzuur (HEPES) ; op pH 8,0 met KOH. Bereid 2 L van 2x CIB, maken aliquots en bewaar ze bij -20 ° C voor langdurige opslag, of bij 4 ° C voor de korte termijn opslag. Om 1x CIB te maken, verdunnen de 2x CIB 1: 1 met gedestilleerd water; Dit kan vers worden bereid op de dag van chloroplast isolatie experiment. </li><li> Bereid HEPES-MgSO4 -sorbitol buffer (HMS, 1x): 50 mm HEPES, 3 mM magnesiumsulfaat (MgSO4), 0,3 M sorbitol; op pH 8,0 met natriumhydroxide (NaOH). Bereid 400 ml buffer, maken aliquots en bewaar ze bij -20 ° C voor langdurige opslag, of bij 4 ° C voor de korte termijn opslag. </li></ol></li><li> Voeren alle van de volgende procedures in de koude kamer of op ijs. Te koelen alle oplossingen, inrichtingen, uitrusting, en rotors voor de starting. </li><li> Bereid een continue dichtheidsgradiënt door het mengen van 13 ml Percoll, 13 ml 2x CIB buffer en 5 mg glutathion in een 50 ml centrifugebuis en centrifugeren van het mengsel bij 43.000 xg gedurende 30 min (rem uit) bij 4 ° C. Na centrifugeren, omgaan met de buis met zorg om te voorkomen dat het verstoren van de gradiënt en houd het op het ijs voor later gebruik. </li><li> Breng 100 ml 1x CIB per genotype / voorwaarde om een ​​1 liter beker. <ol><li> Verwijder de zaailingen van het vloeibare medium door het kantelen van ze in een zeef en zet ze in een ander-CIB met beker; Vervolgens, spoel het weefsel met CIB om het resterende vloeibaar medium alvorens te vervangen door 100 ml vers CIB verwijderen. </li></ol></li><li> Voor homogenisatie gebruikt in totaal 100 ml 1x CIB per monster in vijf achtereenvolgende ronden van homogenisering, elke ronde gebruik 20 ml vers CIB gehouden in een 50 ml bekerglas. <ol><li> Voor de eerste ronde van homogenisatie Breng het plantenweefsel in de 50 ml beker met de hand, waardoor devorige Holding buffer om uit te lekken door je vingers. Probeer om het grootste deel van het weefsel te gebruiken in de eerste ronde, maar zorg ervoor dat het wordt ondergedompeld met buffer; Als dit niet mogelijk is, dient de onbeschreven weefsel bij de tweede ronde. </li></ol></li><li> Plaats probe van het weefsel in het weefsel homogenisator gehomogeniseerd en met twee pulsen van 1-2 s elk. Filter de homogenaat door middel van twee lagen van filtratie doek in een 250 ml centrifugebuis door zachte knijpen. Bewaar het filtraat, en het weefsel transfer terug naar de 50 ml beker. </li><li> Plaats een tweede 20 mL aliquot CIB in de 50 ml beker, toevoeging restmateriaal niet in de eerste ronde van homogenisatie en herhaal de homogenisering en filtratiestappen. Aldus Herhaal stap 3,5 en 3,6 totdat alle 100 ml CIB is uitgeput (dat wil zeggen 5 aliquots van 20 ml) en voeg de resulterende filtraten. </li><li> Centrifugeer de samengevoegde homogenaat bij 1000 x g gedurende 5 min (rem) bij 4 ° C en gietde supernatant onmiddellijk na voltooiing van het centrifugeren, verzorgen de pellet te verstoren. Resuspendeer de pellet in de resterende supernatant links in de buis door zachtjes schudden van de buis op ijs. Niet krachtig mengen door pipetteren of vortexen. </li><li> Zacht overdracht het homogenaat op de bovenkant van de premade continue dichtheidsgradiënt, met behulp van een Pasteur pipet toe te passen via de wand van het ontvangende buis. Vermijd verstoren het verloop. Centrifugeer in een swinging-bucket rotor bij 7800 xg gedurende 10 min (rem uit) bij 4 ° C. OPMERKING: Twee groene banden kan worden gezien in het verloop na het centrifugeren: de onderste band bevat intact chloroplasten, en de bovenste band bevat gebroken chloroplasten. </li><li> Gooi de bovenste band door pipetteren en breng de onderste band met een Pasteur pipet in een verse 50 ml centrifugebuis, behouden een inhoud tot 8 ml per gradiënt. </li><li> Voeg ~ 25 ml 1x HMS buffer in de buis en draai de buis tweemaal to Was de Percoll van de chloroplasten. Plaats de buis opnieuw in de swinging-bucket rotor en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten (rem) bij 4 ° C. </li><li> Giet het supernatant voorzichtig resuspendeer de pellet in de chloroplast residuele HMS links in de buis door zachtjes schudden van de buis op ijs. Voeg een extra 100-300 pl HMS eventueel (gebaseerd op de grootte van de pellet en de telling in hoofdstuk 4), maar niet proberen het monster te veel verdund. <ol><li> Houd de chloroplasten op het ijs. Elke keer voordat de chloroplasten worden gebruikt voor downstream-toepassingen, schud de buis om ze te mengen. Gebruik altijd een cut pipet tip (met een vergrote poriën) aan de chloroplasten te dragen. </li></ol></li></ol> 4. Analyse van de opbrengst en op beschadigingen van chloroplasten <ol><li> Voeg 5 ul van geïsoleerde chloroplasten tot 495 ul van 1x HMS buffer in een 1,5 ml buis, en dan meng voorzichtig door het omkeren van de buis om een ​​1 te verkrijgen: 100 verdunning. </li><li> Place een cover glas op de top van de telkamer van de hemocytometer. Langzaam pipet ~ 40 - 60 pi van de verdunde suspensie chloroplast in de spleet tussen het dekglaasje en telkamer. Met behulp van een fase-contrast microscoop met een 10X of 20X objectief, intacte chloroplasten kijk rond en helder en worden omgeven door een aureool van licht. OPMERKING: Onder de microscoop is een 1 mm 2 tellen met 25 grote vierkanten, elk met 16 kleine vierkantjes in het midden van de telkamer. </li><li> Tel het aantal chloroplasten in 10 grote pleinen. Het aantal chloroplasten per vierkante moet gemiddeld tussen de 10 en 30. Als er te weinig of te veel chloroplasten aanwezig zijn, stel de verdunningsfactor (stap 4.1 hierboven) dienovereenkomstig, en herhaal de procedure. </li><li> Bereken het aantal chloroplasten per ml (concentratie) als volgt: n (het gemiddelde aantal chloroplasten per grote vierkante berekend in stap 4.3) × 25 (totaal aantal grote pleinen) X 100 (de verdunningsfactor) × 10 4 (schaalfactor gegevens per 1 ml tot expressie, aangezien het volume boven de 25 vierkanten is 0,1 mm 3). </li><li> Berekent de werkelijke opbrengst van chloroplasten door de concentratie te vermenigvuldigen met het volume van chloroplast suspensie verkregen in stap 3.12. Gewoonlijk kan meer dan 50 x 10 6 chloroplasten worden verkregen. </li></ol> 5. Chloroplast Protein Import <ol><li> Bereid de volgende voorraad oplossingen: <ol><li> Bereid 10x HMS buffer: 500 mM HEPES, 30 mM MgSO4, en 3,0 M sorbitol; op pH 8,0 met NaOH. Bereid 50 ml van deze buffer, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C voor langdurige opslag en bij 4 ° C voor korte-termijn opslag. </li><li> Bereid Import stop buffer: 50 mM EDTA opgelost in 1x HMS buffer. Bereid 50 ml van deze buffer, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C. </li><li> Bereid 2x eiwit laadbuffer: 60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (v / v) glycerol, 2% (w/ V) SDS, 0,005% (w / v) broomfenolblauw. Maak 50 ml, en bewaar bij 4 ° C. Net voor gebruik, voeg 100 ul van 1 M 1,4-dithiothreitol (DTT) tot 900 ul van buffer. </li></ol></li><li> Om een ​​tijdsverloop uitgevoerd met 3 tijdstippen, voor te bereiden 3 tubes met elk een 130 ul monster van import stop buffer, en laat ze op ijs. Bereid een 450 ul import reactie in een 2 ml buis (per genotype / conditie). Ontdooien alle ingrediënten vlak voor gebruik. <ol><li> Voor een import reactie gebruiken meestal 10 × 10 6 chloroplasten in A pi volume; bijvoorbeeld als de chloroplast concentratie 2,5 x 10 8 / ml, 40 ul gebruikt chloroplast suspensie. Drie tijdstippen zal 3 × A pi nodig (dat wil zeggen, 120 pl in ons voorbeeld). </li><li> Meng de reacties componenten op het ijs in de volgende volgorde: gedestilleerd water (om het totale volume 600 pi te maken), B ul 10x HMS buffer (waarbij B = [600-3 × A] / 10, dwz 48 in ons voorbeeld), 12 pi1 M gluconzuur (kaliumzout), 6 pl 1 M NaHCO3, 6 pl 20% (w / v) BSA, 30 pl 100 mM adenosine 5&#39;-trifosfaat magnesiumzout (MgATP), 24 ul 250 mM methionine (niet radioactief gelabeld ) en 30 pi voorlopereiwit. Onmiddellijk vóór het begin van de import reactie, voeg 3 × A pi van chloroplasten en meng door voorzichtig de buis te tikken. </li></ol></li><li> Incubeer de reactiebuis bij 25 ° C in een waterbad onder 100 umol m · - · 2 s - 1 licht. Af en toe flick de buizen chloroplasten mengen. </li><li> Om een ​​tijdsverloop te voeren, in te trekken 130 pi monsters uit de reactie op de vereiste tijdstippen binnen het lineaire gebied van import, die voor pPsaD is tot ~ 12 min (4, 8 en 12-min tijdstippen zijn geschikt in dit geval). Het lineaire bereik termijn kan variëren voor verschillende eiwitten 14. Derhalve wordt voorgesteld om voor elk individueel preproteïne testen t optimaliserenHij tijdstippen. </li><li> Onmiddellijk na de intrekking, overdragen elk 130 pi hoeveelheid om een ​​buis van ijskoude import stop buffer, meng door voorzichtig de buis te tikken, en behouden alle buizen op ijs tot het tijdsverloop is afgerond. </li><li> Centrifugeer alle monsters gedurende 30 seconden bij 12.000 x g in een microfuge, gooi de supernatanten door pipetteren en resuspendeer pellets in 15 ul 2x eiwit laadbuffer door vortexen. </li><li> Analyseer de monsters plus de pPsaD invoerbesturingselement (met pPsaD gelijk aan 10% van de toegevoegde elke invoer reactie bedrag uit stap 2,7) door middel van standaard SDS-PAGE en autoradiografie, fluorografie of fosfor beeldvorming 15. Gebruik beeldanalyse software te kwantificeren en analyseren van de resultaten. Om een ​​indicatie van de import efficiëntie, de hoeveelheid geïmporteerde eiwit in verschillende genotypen / voorwaarden kan worden beoordeeld door het meten van de radioactiviteit in verband met elke volwassen band. </li></ol>

<ol><li>Jarvis, P., Lòpez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Saibo, N. J., Lourenco, T., Oliveira, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+and+regulation+of+photosynthetic+and+related+metabolism+under+environmental+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Bot%22%5BJournal%5D)">Transcription factors and regulation of photosynthetic and related metabolism under environmental stresses.</a> Ann. Bot. 103 (4), 609-623 (2009).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chloroplast+protein+import+by+the+ubiquitin+E3+ligase+SP1+is+important+for+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants.</a> Curr Biol. 25 (19), 2527-2534 (2015).</li>
<li>Chua, N. H., Schmidt, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+synthesis%2C+transport%2C+and+assembly+of+ribulose+1%2C5-bisphosphate+carboxylase+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro synthesis, transport, and assembly of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase subunits.</a> Basic Life Sci. 11, 325-347 (1978).</li>
<li>Highfield, P. E., Ellis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+transport+of+the+small+subunit+of+chloroplast+ribulose+bisphosphate+carboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthesis and transport of the small subunit of chloroplast ribulose bisphosphate carboxylase.</a> Nature. 271, 420-424 (1978).</li>
<li>Aronsson, H., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+isolating+import-competent+Arabidopsis+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts.</a> FEBS Lett. 529 (2-3), 215-220 (2002).</li>
<li>Froehlich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+Arabidopsis+envelope+protein+localization+and+topology+using+thermolysin+and+trypsin+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying Arabidopsis envelope protein localization and topology using thermolysin and trypsin proteases.</a> Methods Mol Biol. 774, 351-367 (2011).</li>
<li>Flores-Pérez, Ú, Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+suborganellar+fractionation+of+Arabidopsis+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and suborganellar fractionation of Arabidopsis chloroplasts.</a> Methods Mol. Biol. 1511, 45-60 (2017).</li>
<li>Kubis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+ppi1+mutant+is+specifically+defective+in+the+expression+chloroplast+import%2C+and+accumulation+of+photosynthetic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis ppi1 mutant is specifically defective in the expression chloroplast import, and accumulation of photosynthetic proteins.</a> Plant Cell. 15 (8), 1859-1871 (2003).</li>
<li>Kubis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specialization+amongst+the+Arabidopsis+Toc159+family+of+chloroplast+protein+import+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional specialization amongst the Arabidopsis Toc159 family of chloroplast protein import receptors.</a> Plant Cell. 16 (8), 2059-2077 (2003).</li>
<li>Aronsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+binding+and+dimerization+at+the+chloroplast+pre-protein+import+receptor%2C+atToc33%2C+are+not+essential+in+vivo+but+do+increase+import+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Nucleotide binding and dimerization at the chloroplast pre-protein import receptor, atToc33, are not essential in vivo but do increase import efficiency.</a> Plant J. 63 (2), 297-311 (2010).</li>
<li>Huang, W., Ling, Q., Bédard, J., Lilley, K., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analyses+of+the+roles+of+essential+Omp85-related+proteins+in+the+chloroplast+outer+envelope+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo analyses of the roles of essential Omp85-related proteins in the chloroplast outer envelope membrane.</a> Plant Physiol. 157 (1), 147-159 (2011).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual.+Second+edn%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edn</a>. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Aronsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monogalactosyldiacylglycerol+deficiency+in+Arabidopsis+thaliana+affects+pigment+composition+in+the+prolamellar+body+and+impairs+thylakoid+membrane+energization+and+photoprotection+in+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Monogalactosyldiacylglycerol deficiency in Arabidopsis thaliana affects pigment composition in the prolamellar body and impairs thylakoid membrane energization and photoprotection in leaves.</a> Plant Physiol. 148, 580-592 (2008).</li>
<li>Aronsson, H., Jarvis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+Arabidopsis+chloroplasts+and+their+use+for+in+vitro+protein+import+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of Arabidopsis chloroplasts and their use for in vitro protein import assays.</a> Methods Mol. Biol. 774, 281-305 (2011).</li>
<li>Haldrup, A., Lunde, C., Scheller, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+thaliana+plants+lacking+the+PSI-D+subunit+of+photosystem+I+suffer+severe+photoinhibition%2C+have+unstable+photosystem+I+complexes%2C+and+altered+redox+homeostasis+in+the+chloroplast+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis thaliana plants lacking the PSI-D subunit of photosystem I suffer severe photoinhibition, have unstable photosystem I complexes, and altered redox homeostasis in the chloroplast stroma.</a> J. Biol. Chem. 278 (35), 33276-33283 (2003).</li>
<li>Kubis, S. E., Lilley, K. S., Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+preparation+of+chloroplasts+from+Arabidopsis+thaliana+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and preparation of chloroplasts from Arabidopsis thaliana plants.</a> Methods Mol. Biol. 425, 171-186 (2008).</li>
<li>Chen, X., Smith, M. D., Fitzpatrick, L., Schnell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+the+role+of+atTic20+in+protein+import+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of the role of atTic20 in protein import into chloroplasts.</a> Plant Cell. 14, 641-654 (2002).</li>
<li>Miras, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+transit+peptide+for+import+into+the+chloroplast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-canonical transit peptide for import into the chloroplast.</a> J. Biol. Chem. 277 (49), 47770-47778 (2002).</li>
<li>Nada, A., Soll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+envelope+protein+32+is+imported+into+chloroplasts+by+a+novel+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Inner envelope protein 32 is imported into chloroplasts by a novel pathway.</a> J. Cell Sci. 117 (17), 3975-3982 (2004).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

We hebben onlangs aangetoond dat chloroplast eiwitimport actief kan worden geregeld door stress, wat essentieel is voor chloroplast functie en overleving van planten 3. In deze studie, om een dergelijke verordening te controleren, aangepast we onze chloroplast isolatie en in vitro import assay procedures met het oog op de beoordeling van de importcapaciteit van planten onder stress omstandigheden mogelijk te maken. De resultaten gaven een belangrijke rol voor SP1 in chloroplast eiwitimport regelgeving. Conventionele in vitro import assays gebruiken planten gekweekt op standaard MS agarmedium 6,17,18. Bij de sp1 mutant hier beschreven, heeft deze bekende bepalingen geen verschil in eiwitimport opzichte van de WT 3 onthullen. Echter, de rol van SP1 in het reguleren eiwitimport duidelijk onthuld wanneer eiwitimport onder stressomstandigheden toepassing van de hierin beschreven werkwijzen (figuur 1) wordt beoordeeld. Hoewel het may niet mogelijk om rechtstreeks importeren vergelijken van stresscondities assay met die verkregen uit conventionele testen (zoals de werkwijzen maken gebruik planten gekweekt in vloeibare kweek en op agar medium, respectievelijk), vergelijkingen tussen stress en niet- stresscondities haalbaar mits de planten zijn allemaal gekweekt in hetzelfde kweekmedium vloeistof, met of zonder stressoren. Vergeleken met de stressbehandeling op agar medium, vloeibare kweek is meer geschikt voor de behandeling van grote aantallen van planten vereist voor in vitro assays invoer. Bovendien vergemakkelijkt de uniforme toepassing van de stressor alle planten, wat vooral belangrijk is voor kortstondige stress behandelingen. De hier gepresenteerde methode werd toegepast op de osmotische stress bestuderen vanuit mannitol behandeling, maar kan gemakkelijk worden aangepast aan een breed scala van andere belastingen; bijvoorbeeld kortdurende zoutstress en oxidatieve stress, waarvoor de overeenkomstige stressoren kan be op dezelfde manier toegepast via vloeibaar MS-medium. Voor andere vormen van stress, raden we de mate van stress wordt eerst geoptimaliseerd; overdreven ernstige behandelingen kunnen nadelige effecten op de opbrengst en / of bekwaamheid invoer van de geïsoleerde organellen hebben. Er zijn een aantal belangrijke stappen in het protocol waaraan men moet speciale aandacht besteden, zoals hieronder beschreven. De optimale concentratie van de agar medium MS kunnen verschillen (0,6-0,9% w / v) afhankelijk van de fabrikant. Zo is het raadzaam om de agar concentratie empirisch te optimaliseren voordat u begint met experimenten. Het medium moet niet zo zacht dat het vasthoudt aan het weefsel op het oogsten (stap 1.9) te zijn, noch moet het zo hard dat het remt plantenwortel ontwikkeling. De sucrose concentratie kan worden aangepast aan de gebruikte planten. Bij het werken met name zieke mutanten, MS-medium aangevuld met 2 - 3% (w / v) sucrose kan helpen planten groeien beter. wanneer appliegen stress-behandelingen, is het niet goed tot zeer oude planten over te dragen aan het vloeibare medium (bijvoorbeeld&gt; 14 dagen oud). Dit komt omdat de meer ontwikkelde wortels oudere planten gemakkelijker tijdens overdracht beschadigd zijn. Wat de transcriptie / translatiesysteem, zijn er 2 belangrijke systemen: op basis van tarwekiemen, en op basis van konijnen reticulocyten. Deze kits kunnen verschillende sjablonen, zoals gelineariseerde plasmiden, unlinearized plasmiden of PCR producten. De kits zijn ook specifiek voor de T3, T7 en SP6 promoters. Merk op dat de kit raden hier alleen geschikt voor PCR-producten en de T7 promoter. Echter, om onbekende redenen, sommige radioactief gemerkt preproteins gemaakt met dit systeem misschien niet efficiënt in de import assay werken; in dergelijke gevallen kan men overwegen om een ​​tarwekiem extract systeem of een reticulocyten lysaat systeem bedoeld voor plasmide templates. Men kan ook de resultaten van de transcriptie / translatie reoptreden door wijziging van de reactiecondities volgens de handleiding van de fabrikant. Het is belangrijk om chloroplast isolatie beginnen vroeg in de ochtend (of vroeg in de lichtcyclus van de groeikamer) om accumulatie van zetmeel voorkomen in de chloroplasten door fotosynthese, die de isolatie van intacte organellen kan belemmeren. De chloroplast isolatie procedure moet snel worden gedaan zonder onnodige vertraging, en de geïsoleerde chloroplasten moet altijd koud worden gehouden. Dit om beperken van de waarneming dat geïsoleerde chloroplasten geleidelijk hun levensvatbaarheid, wat niet goed verliezen. Bij gebruik van nieuw ontdooide CIB of HMS buffer, moet u de buffer te mengen voor gebruik goed om een ​​homogene oplossing te verkrijgen. De optimale omstandigheden voor het homogeniseren van plantenmateriaal zijn empirisch vastgesteld, en kan variëren als een ander weefsel homogenisator gebruikt. Als de andere plant genotypen bevatten similar chlorofyl niveaus, kan chlorofyl kwantificering worden gebruikt als een alternatieve manier om de monsters te normaliseren voor het uitvoeren van de invoer assays. (Vol / vol) Chlorofyl kan spectrofotometrisch worden bepaald na extractie van een monster van de geïsoleerde chloroplasten in 80% waterig aceton 19,20. Indien de invoer tarieven pootaardappelen met verschillende chlorophylgehalte (bijvoorbeeld mutanten met chloro- fenotypes) zijn te vergelijken, gebruikt chloroplast aantal tellen in de chloroplast monsters normaliseren de import assays. Het is bijzonder belangrijk de chloroplasten grondig mengen in stap 3.11. Onvoldoende resuspensie kunnen aggregaten van chloroplasten, waardoor het moeilijk om cijfers nauwkeurig te tellen reactie en zal dus de juiste lading hinderen import reacties. Als ernstige aggregatie wordt gezien onder de microscoop (bijvoorbeeld aggregaten met&gt; 10 chloroplast samengevoegd), blijven schudden van de chloroplast monster op ijs tot de aggregates verwijderd. Het is gemakkelijker om de chloroplasten resuspenderen in een kleiner volume buffer. Het is belangrijk om te beseffen dat eiwitimport reacties (hoofdstuk 5) moeten worden uitgevoerd met de juiste voorzorgsmaatregelen vanwege hun radioactieve aard. Noodzakelijke maatregelen houden in: het dragen van wegwerphandschoenen, laboratorium kleding en een veiligheidsbril, monitoring en ontsmetten van het werkoppervlak en apparatuur, en de verwijdering van al het radioactief afval in een erkende afvalcontainer. Ook in gedachten houden dat de juiste osmotische druk is van cruciaal belang voor het behoud van de intactheid van chloroplasten tijdens het importeren reacties, en dit wordt voornamelijk onderhouden door de HMS buffer. Omdat 10x HMS is stroperige, moet eerst worden opgewarmd tot kamertemperatuur, en vervolgens grondig gemengd en aangebracht met een cut pipet tip om het meten van nauwkeurige volumes garanderen. In de import reactie wordt koud methionine toegevoegd aan de opname van vrije radioactief gemerkt methionine remmen in ongerelateerde chloroplast eiwitten door middel vertaling organellen tijdens de incubatiestap, terwijl BSA gebruikt om proteolyse te minimaliseren door als substraat voor proteasen.

Chloroplasten veel voorkomt organellen die bestaan ​​in de groene weefsels van planten. Ze zijn bekend om hun cruciale rol in de fotosynthese, een proces dat licht energie gebruikt om kooldioxide om te zetten in suiker en dus ondersteunen vrijwel alle leven op aarde 1. Bovendien, chloroplasten (en de bredere familie van gerelateerde organellen genoemd plastiden) spelen vele cruciale rollen in planten, zoals de biosynthese van aminozuren, lipiden, pigmenten, en de detectie van signalen uit de omgeving zoals de zwaartekracht en pathogeen uitdaging. Fotosynthese genereert reactieve zuurstofsoorten (ROS) als bijproducten, die onder bepaalde omstandigheden nuttig rollen, maar als overproductie kan beschadigen of zelfs dodelijke effecten veroorzaken. De overproductie van ROS wordt vooral gepromoot door ongunstige omstandigheden, en dus chloroplasten zijn nauw verbonden met de reacties op abiotische stress, zoals zoutgehalte en osmotische stress 2. chloroplasts een complexe structuur. Elk chloroplast is omgeven door een dubbele membraan buitenlaag genoemd de omhulling, bestaande uit buitenste en binnenste membranen. Intern is er nog een membraan systeem genaamd de thylakoiden, waar het licht van de fotosynthese plaatsvinden. Tussen de twee membraan systemen is er een waterig compartiment oproep van de stroma, dat betrokken is bij carbon fixatie. Een chloroplast kan tot ~ 3000 verschillende eiwitten, en de meeste van deze eiwitten worden gesynthetiseerd in de cytosol precursor vorm en moeten via speciale eiwitten translocons in de omhulling membranen 1 in het organel te voeren. Interessant is recent werk aangegeven dat chloroplast eiwitimport actief wordt gereguleerd, en is dus in staat om een ​​belangrijke niveau van controle over de chloroplast proteoom uit te oefenen. Zo werd gemeld in 2015 dat eiwit import kunnen reageren op abiotische stress door de directe regulering van de overvloed van the translocatie bij de buitenomhulling membraan van chloroplasten (TOC) van het ubiquitine-proteasoom-systeem 3. Met behulp van gezuiverde chloroplasten en in vitro gesynthetiseerde voorloper eiwitten, kan eiwitimport worden opgelost in vitro 4,5. Zo kan in vitro methoden worden toegepast om de tarieven van de import in verschillende mutant planten 6, dat een kritische benadering voor de analyse van mogelijke onderdelen van het eiwit import machines en voor het ontdekken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan eiwit import en de regelgeving is te beoordelen. Bovendien kunnen chloroplasten worden verwerkt met verdere fractionering of protease de vertering, na in vitro import, die studies over de sub-organellen lokalisatie en topologie van chloroplast proteïnen 7,8 kan faciliteren. Om de regulering van eiwit import door stress te bestuderen, hebben we onze routine chloroplast isolatie methode aangepast zoals we zullen beschrijvenhier. Belangrijk, werden chloroplasten geïsoleerd uit planten die op standaard Murashige en Skoog (MS) agarmedium gekweekt waren voor 8 dagen en vervolgens overgebracht naar vloeibaar MS-medium aangevuld met stressor, voor een relatief korte, gecontroleerde stressbehandeling. De opbrengst en de competentie van de chloroplasten geïsoleerd uit dergelijke stress behandelde planten zijn compatibel met de downstream in vitro eiwit import assay 3. Naast de chloroplast isolatieprotocol presenteren we onze routine werkwijze voor in vitro eiwitimport, die voldoende stevig is en wordt veel gebruikt 3,9-12.

<table><tbody><tr><td>Murashige and Skoog basaal zout&nbsp;</td><td>Melford</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>phytoagar</td><td>Melford</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino) ethaan sulfonzuur (MES)</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BPE151-500</td><td></td></tr><tr><td>chirurgisch pleister (bijv. Micropore, 3M)</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>filterpapier</td><td>Fisher</td><td>FB59023</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Fisher</td><td>10607095</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleen Glycol Tetraazijnzuur (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>D/0700/53</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethaansulfonzuur (HEPES)</td><td>Melford</td><td>B2001</td><td></td></tr><tr><td>filtratiedoek (Miracloth)</td><td>Calbiochem</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifugeerbuis</td><td>Fisher</td><td>CFT-595-040M</td><td></td></tr><tr><td>250 mL centrifugeerfles</td><td>Fisher</td><td>CFT-891-V</td><td></td></tr><tr><td>Polytron (bijv., Kinematica PT10-35)</td><td>Fisher</td><td>11010070</td><td></td></tr><tr><td>Polytron sonde (bijv., Kinematica PTA20S)</td><td>Fisher</td><td>11030083</td><td></td></tr><tr><td>centrifuge (bijv., Beckman Coulter Avanti JXN-26, voor 50 en 250 mL buizen)</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34182</td><td></td></tr><tr><td>vaste hoek rotor voor 250&nbsp;mL flessen (bijv., JLA-16.250)</td><td>Beckman Coulter</td><td>363930</td><td></td></tr><tr><td>vaste hoek rotor voor 50&nbsp;mL buizen (bijv., JA-25.50)</td><td>Beckman Coulter</td><td>363058</td><td></td></tr><tr><td>roterende emmer rotor voor 50 mL buizen (bijv., JS-13.1)</td><td>Beckman Coulter</td><td>346963</td><td></td></tr><tr><td>radioactief gelabeld [35S] methionine</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG072002MC</td><td></td></tr><tr><td>konijnen reticulocyten lysate gebaseerd cel-vrij translatiesysteem (TNT T7 Quick kit voor PCR DNA)</td><td>Promega</td><td>L5540</td><td></td></tr><tr><td>fasecontrastmicroscoop (bijv., Nikon Eclipse 80i)</td><td>Nikon</td><td>niet beschikbaar</td><td></td></tr><tr><td>hemocytomeer (verbeterde Neubauer BS748 kamer)</td><td>Hawksley Technology</td><td>AC1000</td><td>0.1 mm diepte, 1/400 mm2</td></tr><tr><td>dekglasjes</td><td>VWR</td><td>16004-094</td><td>22 mm &times; 22 mm, dikte 0.13-0.17 mm</td></tr><tr><td>1.5 mL microfuge buisjes</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2 mL microfuge buisjes</td><td>Starlab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>microfuge (bijv., Eppendorf 5415D)</td><td>Eppendorf</td><td>niet beschikbaar</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 spectrofotometer of vergelijkbaar</td><td>Thermo Fisher</td><td>SPR-700-310L</td><td></td></tr><tr><td>gluconzuur (kaliumzout)</td><td>Fisher</td><td>22932-2500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>methionine</td><td>Sigma</td><td>M6039</td><td></td></tr><tr><td>bromofenolblauw</td><td>Fisher</td><td>B/P620/44</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Fisher</td><td>G/0650/17</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher</td><td>S/5200/53</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base&nbsp;</td><td>Melford</td><td>B2005</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol (DTT)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td></td></tr><tr><td>beeldanalysesoftware (bijv., Aida Image Analyzer)</td><td>Raytest</td><td>niet beschikbaar</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van eiwit import in chloroplasten geïsoleerd van stressed planten

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Chloroplasten zijn organellen met vele vitale functies in planten, die niet alleen de fotosynthese, maar talrijke andere metabole en signaleringsfuncties omvatten. Verder chloroplasten zijn van cruciaal belang voor de plantaardige reacties op verschillende abiotische stress, zoals zoutgehalte en osmotische stress. Een chloroplast kan tot ~ 3000 verschillende eiwitten, waarvan sommige worden gecodeerd door de eigen genoom. De meerderheid van chloroplast-eiwitten worden gecodeerd in de kern en gesynthetiseerd in het cytosol en deze eiwitten moeten in de chloroplast door middel translocons de chloroplast envelop membranen worden ingevoerd. Recente studies hebben aangetoond dat de chloroplast eiwitimport actief kan worden geregeld door stress. Om biochemisch onderzoek dergelijke regulering op eiwitimport onder stressomstandigheden, ontwikkelden we de methode beschreven als een snelle en eenvoudige procedure die gemakkelijk in een laboratorium kunnen worden bereikt. In deze methode worden planten gekweekt onder normale conditions en vervolgens blootgesteld aan omstandigheden in vloeibare cultuur te benadrukken. Plantaardige materiaal wordt verzameld en chloroplasten worden vervolgens vrijgegeven door homogenisatie. Het ruwe homogenaat wordt gescheiden door dichtheidsgradiënt centrifugatie, waardoor isolatie van de intacte chloroplasten. Chloroplast opbrengst wordt bepaald door het tellen en chloroplast intactheid wordt gecontroleerd onder een microscoop. Voor het eiwit import assays, worden gezuiverd chloroplasten geïncubeerd met 35S radioactief gemerkt in vitro vertaald voorloper eiwitten en tijdsverloop experimenten worden uitgevoerd om een vergelijking van de tarieven import tussen genotypen in staat onder stress omstandigheden. We presenteren gegevens die met deze methode waaruit blijkt dat het aantal eiwitimport in chloroplasten van een regulerende mutant specifiek onder osmotische stressomstandigheden veranderd.

Een voorbeeld chloroplast eiwitimport experiment 3 tijdstippen wordt weergegeven in figuur 1. PSAD een ~ 18 kD component van fotosysteem I blootgesteld aan de stroma, een voorloper vorm van 23 kD ~ 16. PSAD werd hier voor de in vitro assay eiwitimport gekozen omdat de steady-state niveaus worden verhoogd in de sp1 mutant ten opzichte van WT onder stressomstandigheden, wat wijst op een verandering van de invoer efficiëntie in de mutant 3. De sp1 mutant draagt een defect in een belangrijke regulator van de chloroplast eiwit import van machines - de SP1-proteïne 3. Voor chloroplasten geïsoleerd uit planten gekweekt onder normale omstandigheden is er geen duidelijke verschil tussen PSAD import sp1 en WT (gegevens niet getoond) 3. Bij gebruikmaking van de hier beschreven werkwijzen voor PSAD invoer beoordelen chloroplasten geïsoleerd uit osmotischgestresste planten, werd een duidelijk verschil waargenomen. Terwijl we de accumulatie van het rijpe eiwit vorm op een tijdsafhankelijke wijze met beide genotypen waargenomen, de snelheid van invoer was significant lager voor WT chloroplasten dan sp1 chloroplasten (figuur 1), hetgeen consistent is met onze eerdere resultaten 3 en onthult een belangrijke rol voor de SP1-eiwit in de chloroplast reguleren invoer van pSAD onder stressomstandigheden. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54717/54717fig1.jpg" /> Figuur 1. Een eiwitimport Assay uitgevoerd met chloroplasten geïsoleerd uit planten gekweekt onder osmotische stressomstandigheden. Chloroplasten werden geïsoleerd uit een 10 dagen oude WT (Col-0) en een sp1 mutante Arabidopsis-planten gekweekt onder stresscondities (200 mM mannitol) voor 2 d. (A) eiwitimport werd uitgevoerd met [35S] -Met-Hionine gemerkte pPsaD en men gedurende 4, 8 en 12 minuten vóór de analyse met SDS-PAGE en fosfor beeldvorming. Parallel, de pPsaD 10% input control omvat in vitro vertaald eiwit (IVT) werd geanalyseerd. De voorloper (pre) en volwassen (mat) vormen van pPsaD zijn aangegeven, terwijl in tussen zijn er twee bands die waarschijnlijk overeenkomen met afgeknotte of geproteolyseerd translatieproducten omdat hun intensiteit niet veranderen tijdens het tijdsverloop (*). (B) om de tarieven van invoer te vergelijken in de chloroplasten van WT en sp1 planten onder stress omstandigheden, de intensiteit van elke band die overeenkomt met geïmporteerde rijp eiwit in A werd gekwantificeerd. Alle gegevens worden uitgedrukt als percentage van het bedrag van de ingevoerde eiwit in chloroplasten van WT planten na 12 min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54717/54717fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Hier beschrijven we een nieuwe methode om eiwit import te bestuderen in geïsoleerde chloroplasten onder stress. De werkwijze is eenvoudig en snel, en kan worden toegepast op de gevolgen van verschillende stress voor chloroplast eiwitimport en de overeenkomstige regulerende mechanismen te bestuderen.

Analyse van eiwit import in chloroplasten Geïsoleerd van Stressed Planten

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. ...

Het algemene doel van deze methodologie is het bestuderen van de import van in de nucleus gecodeerde eiwitten in chloroplasten, met een specifieke focus op de effecten van stress. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de chloroplasten, zoals de vraag hoe de eiwitimport in chloroplasten wordt gereguleerd. Een bijzonder voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om de effecten van stress op de eiwitimport in chloroplasten te beoordelen.Hoewel deze methode is ontwikkeld voor gebruik met de modelplant Arabidopsis thaliana, kan deze worden aangepast en toegepast op andere systemen, zoals gewassen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Qihua Ling, een postdoc uit mijn laboratorium. Om te beginnen, kweek eerst de Arabidopsis-planten zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.Voer vervolgens een stressbehandeling uit wanneer de planten acht dagen oud zijn. Schraap de planten voorzichtig met de hand van de agarplaat en plaats ze in een gesteriliseerde kolf met vloeibaar MS-medium dat de stressor bevat. Afhankelijk van de aard van het experiment kan het ook nodig zijn om extra planten in een soortgelijke kolf zonder stressor te plaatsen als controle.Bedek de opening van de kolven met gesteriliseerd folie en laat de planten nog twee dagen groeien op een orbitale schudder met zachte schudbewegingen. Bereid een continue dichtheidsgradiënt voor door eerst 13 milliliters Percoll, 13 milliliters twee x chloroplast isolatiebuffer en vijf milligram glutathione te mengen in een 50 milliliter centrifugebuis. Centrifugeer vervolgens het mengsel.Hanteer de buis na centrifugatie voorzichtig om te voorkomen dat de gradiënt wordt verstoord, en bewaar deze op ijs voor later gebruik. Breng vervolgens per conditie 100 milliliters chloroplast-isolatiebuffer over in een bekerglas van één liter. Verwijder de zaailingen uit het vloeibare medium door ze in een zeef te gieten.Breng ze vervolgens over naar het bekerglas met chloroplastisolatiebuffer. Spoel het weefsel met de buffer om eventueel resterend medium te verwijderen en vervang de buffer daarna door 100 milliliters verse isolatiebuffer. Voor de eerste homogeniseringsronde brengt u het plantweefsel handmatig over naar een bekerglas van 50 milliliter, waarbij u de vorige buffer door uw vingers laat weglopen.Plaats vervolgens de sonde van de weefselhomogenisator in het weefsel en homogeniseer met twee pulsen van elk één tot twee seconden. Filtreer het homogenaat door twee lagen filterdoek in een centrifugebuis van 250 milliliter. Beëindig de procedure door de doek voorzichtig uit te knijpen.Bewaar het filtraat en breng het plantweefsel terug naar het bekerglas van 50 milliliter. Voeg vervolgens een tweede hoeveelheid van 20 milliliters chloroplastisolatiebuffer toe aan het bekerglas van 50 milliliter en voeg eventueel resterend weefsel toe dat niet in de eerste ronde van homogenisatie is gebruikt. Herhaal de homogenisatie- en filtratiestappen nog vier keer.Centrifugeer het samengevoegde homogenaat bij 1.000 ×g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Giet het supernatant direct na centrifugatie af, waarbij u er zorg voor draagt dat de pellet niet wordt verstoord. Plaats de buis op ijs en resuspendeer de pellet in het resterende supernatant door de buis voorzichtig te schudden.Gebruik vervolgens een Pasteurpipet om het homogenaat voorzichtig via de wand van de ontvangstbuis bovenop de vooraf gemaakte continue dichtheidsgradiënt over te brengen. Centrifugeer het monster en de gradiënt vervolgens in een swinging bucket rotor bij 7,800 ×g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius met de rem uitgeschakeld. Observeer na voltooiing de twee groene banden die in de gradiënt zichtbaar zijn.Verwijder de bovenste band, die gebroken chloroplasten bevat, en gebruik een Pasteurpipet om de onderste band met intacte chloroplasten over te brengen naar een nieuwe centrifugebuis van 50 milliliter. Voeg vervolgens 25 milliliters HMS-buffer toe aan de buis en keer de buis twee keer om om de Percoll van de chloroplasten af te wassen. Plaats de buis daarna terug in de swinging bucket rotor en pellet de chloroplasten opnieuw.Giet het supernatant af en resuspendeer het pellet in de resterende buffer door de buis voorzichtig op ijs te schudden. Voeg indien nodig nog 100 tot 300 microliter van de HMS-buffer toe, maar probeer het monster niet te veel te verdunnen. Bewaar de geresuspendeerde chloroplasten op ijs.Begin met het toevoegen van 5 µL van de geïsoleerde chloroplasten aan 495 µL HMS-buffer in een buisje van 1,5 mL. Keer het buisje om om de oplossing voorzichtig te mengen. Plaats vervolgens een dekglas op de telkamer van een hemocytometer.Pipette langzaam 40 tot 60 µL van de verdunde chloroplastsuspensie in de opening tussen het dekglas en de telkamer. Beeld de chloroplasten af met een fasecontrastmicroscoop met een 20x objectief. Intacte chloroplasten zien er rond en helder uit en zijn omgeven door een lichtkrans.Gebruik vervolgens het 10x objectief om het aantal chloroplasten in 10 grote vakken te tellen. Het gemiddelde aantal chloroplasten per groot vak moet tussen de 10 en 30 liggen. Als er te weinig of te veel chloroplasten aanwezig zijn, pas dan de verdunningsfactor aan en herhaal de procedure.Zodra de juiste range is bereikt, wordt het aantal chloroplasten per milliliter berekend zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Om een tijdreeks met drie tijdstippen uit te voeren, worden drie buisjes voorbereid, elk met een aliquot van 130 µL import stop buffer, die op ijs worden bewaard. In een buisje van twee milliliter wordt de importreactie voorbereid, bestaande uit de reactiebuffer en het radioactief gelabelde precursor-eiwit.Let op dat er één reactie moet zijn voor elke te testen conditie. Gebruik ongeveer 10 miljoen chloroplasten per tijdstip. Incubeer de reactiebuis bij 25 °C in een waterbad onder een beperkte hoeveelheid licht.Tik de buisjes af en toe aan om de chloroplasten opnieuw te suspenderen. Om een tijdserie uit te voeren, worden aliquots van 130 microliter van de reactie afgenomen op de vereiste tijdstippen binnen het lineaire bereik van de import. Draag direct na afname elke aliquot van 130 microliter over naar een buisje met ijskoud import-stopbuffer, meng dit door zachtjes tegen het buisje te tikken, en plaats de buisjes op ijs totdat de tijdserie is voltooid.Zodra het laatste monster is verwijderd, worden alle monsters 30 seconden gecentrifugeerd bij 12 000 ×g in een Microfuge. Verwijder vervolgens de supernatanten en resuspendeer de pellets in 15 µL van een twee x eiwitlaadbuffer. Meng de monsters daarna door middel van vortexen.Analyse tot slot alle monsters, inclusief een precursor-inputcontrole, met behulp van standaard SDS-PAGE en autoradiografie, fluorografie of fosforimaging. PsaD is een component van 18 kilodalton van fotosysteem I die wordt gesynthetiseerd als een grotere precursor van 23 kilodalton. Verwerking naar de mature vorm van 18 kilodalton geeft aan dat import in de chloroplasten heeft plaatsgevonden.De hier bestudeerde sp1-mutant van Arabidopsis vertoont een defect in het sp1-eiwit, een belangrijke regulator van het importmechanisme voor chloroplasteiwitten. Onder stressomstandigheden is de hoeveelheid geïmporteerd PsaD-eiwit in chloroplasten van de sp1-mutant verhoogd ten opzichte van het wildtype, maar dit is niet het geval onder normale, stressvrije omstandigheden. Hoewel de volwassen eiwitvorm van PsaD op een tijdsafhankelijke manier accumuleerde in chloroplasten van beide plantengenotypen, was de importsnelheid significant hoger voor chloroplasten van de sp1-mutant dan voor chloroplasten van het wildtype.Deze resultaten suggereren een belangrijke rol voor het sp1-eiwit bij de regulatie van de import van chloroplast-eiwitten onder stressomstandigheden. Eenmaal onder de knie, kan deze methode — van de isolatie van chloroplasten tot de voltooiing van de importassay — in vijf tot zes uur worden afgerond, mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat alle stappen van de chloroplast-isolatie bij 4 °C moeten worden uitgevoerd om te garanderen dat de chloroplasten hun maximale activiteit behouden.Na de initiële ontwikkeling enkele decennia geleden, baande de in vitro chloroplast-eiwitimportanalyse de weg voor onderzoekers in het vakgebied om vele verschillende aspecten van het chloroplast-eiwitimportmechanisme te verkennen. De hier gepresenteerde verfijning maakt onderzoek mogelijk naar de effecten van stresscondities op de eiwitimport. Vergeet niet dat het werken met radioactief materiaal speciale zorg vereist.Tijdens het uitvoeren van deze procedure moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het dragen van handschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril.

analysis-protein-import-into-chloroplasts-isolated-from-stressed

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De beschreven vergelijkende, kwantitatieve proteomics aanpak is gericht op het verkrijgen van inzicht in de samenstelling van multiprotein complexen onder verschillende omstandigheden en wordt aangetoond door het vergelijken van genetisch verschillende stammen. Voor kwantitatieve analyse gelijke volumes van verschillende fracties van een sucrose dichtheidsgradiënt gemengd en geanalyseerd met massaspectrometrie.

Een nieuwe aanpak voor de Vergelijkende analyse van de multiprotein Complexen Gebaseerd op<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling en kwantitatieve massaspectrometrie

Vorming van eiwitcomplexen in vivo kan worden gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie complementatie. Interactie partners gefuseerd aan complementaire delen van fluorescente labels en tijdelijk tot expressie gebracht in tabaksbladeren, waardoor een opnieuw fluorescentiesignaal op nabijheid van de twee eiwitten.

Eiwit-eiwit interacties gevisualiseerd door Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie in Protoplasten en Bladeren Tabak

Wij presenteren protocollen hierin voor hoog rendement isolatie van fysiologisch actief ze en eiwit vervoer testen voor de chloroplast twin arginine translocatie (cpTat), secretoire (cpSec1) en signaal erkenning deeltje (cpSRP) trajecten.

Isolatie van fysiologisch actief thylakoiden en hun gebruik in energie-afhankelijke proteÃ¯ne vervoer Assays

Hier beschrijven we een protocol om het uiten van eiwitten in protoplasten met behulp van PEG-gemedieerde transformatie methode. De methode biedt eenvoudige uitdrukking van proteïnen van belang, en efficiënte opsporing van eiwit lokalisatie en het importproces voor verschillende experimentele omstandigheden in vivo.

Eiwit invoer in chloroplasten met behulp van protoplasten studeren

Hier presenteren we een bewezen en geteste protocol voor de zuivering van chloroplast importeren eiwitcomplexen (TOC-TIC complex) met behulp van de TAP-tag. Het protocol van de verwantschap-isolatie one-step potentieel kan worden toegepast op elke proteïne en worden gebruikt om nieuwe interactie partners door massaspectrometrie.

Affiniteit zuivering van Chloroplast Translocon eiwitcomplexen met behulp van de Tag van de TAP

Hier beschrijven we een methode om te zuiveren intact chloroplasten van Arabidopsis bladeren en hun drie belangrijkste sub compartimenten (envelop, stroma en thylakoiden), met behulp van een combinatie van differentiële centrifugations, continue Percoll verlopen, en discontinue sacharose verlopen. De methode is waardevol voor subplastidial en subcellular localisatie van eiwitten door immunoblotting en proteomics.

Voorbereiding van Chloroplast sub compartimenten van Arabidopsis voor de analyse van eiwit lokalisatie door Immunoblotting of Proteomics

Het hier gepresenteerde protocol omvat polysomale profilering om translatom, mRNA's geassocieerd met ribosomen, te isoleren in niet-polysomale en polysomale RNA's van Arabidopsis door middel van sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie. Deze methode toont de translatie-efficiëntie van hitte-gestreste Arabidopsis.

Translatie-efficiëntietest met behulp van polysoomprofielen onder hittestress

Een kort protocol voor eiwitkleuring met Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels wordt beschreven zonder gebruik te maken van organische oplosmiddelen of azijnzuur als in de klassieke kleuren procedures met CBB.

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

De bijhorende video beschrijft het gebruik van de GELFREE 8100 Fractionation System, welke partities complex eiwit monsters op basis van moleculair gewicht en herstelt de fracties in de vloeibare fase. De video beschrijft hoe de technologie werkt, hoe het wordt gebruikt, en biedt resulterende data, met polyacrylamidegelelektroforese analyse van gefractioneerde runderen leverhomogenaat.

Met behulp van de GELFREE 8100 Fractionering System for Molecular Weight-Based Fractionering met Liquid Phase Recovery

Een gestroomlijnde benadering screening op de expressie van recombinant membraaneiwitten in Escherichia coli gebaseerd op fusie met groen fluorescent proteïne gepresenteerd.

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

Leer een snelle methode voor eiwitimport in chloroplasten van stress-geëxposeerde planten met Arabidopsis thaliana. Deze techniek onthult regulerende mechanismen en is aanpasbaar voor gewassen.

Analyse van eiwit import in chloroplasten Geïsoleerd van Stressed Planten

Meer video's verkennen