Snelle en efficiënte generatie van recombinant humaan pluripotente stamcellen door Recombinase-gemedieerde Cassette Exchange in de

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van snelle en efficiënte gerichte genoomredigering in de AAVS1 van humane pluripotente stamcellen, of humane PSC's, met behulp van een flippase, Recombinase-mediated Cassette Exchange-benadering, of RMCE. RMCE verbetert de gerichte insertie van een sequentie in de AAVS1-locus, wat van groot belang is voor de stamcelbiologie omdat het snelle tests naar de functie van een molecuul door overexpressie of knockdown mogelijk maakt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat humane PSC-lijnen zonder willekeurige integratiegebeurtenissen, die nog steeds pluripotent zijn en waarbij normale karyotypes kunnen worden gecreëerd, in slechts 15 dagen kunnen worden gegenereerd.

Deze methode biedt een nuttig hulpmiddel voor transgenese in de AAVS1-locus, maar kan ook worden toegepast op andere permissieve menselijke loci. Begin met het kweken van menselijke PSC-mastercellijnen volgens standaardprocedures, met of zonder geïnactiveerde embryonale muis-fibroblasten (iMEF's), in zes-wells platen. Wanneer de cellen een confluentie van 60% tot 70% bereiken, worden drug-resistente iMEF's uitgeplaat door eerst een 0,1% gelatinewijzing te gebruiken om de benodigde wells van een 12-wells plaat te coaten, waarna de plaat vijf minuten bij kamertemperatuur wordt geïncubeerd.

Planteer vervolgens 125.000 iDR4's per well en incubeer de culturen gedurende de nacht met iMEF-medium. Preincubeer de volgende dag de humane PSC-culturen gedurende één uur bij 37 °C met vers medium dat 10 µM ROCK-inhibitor bevat. Breng ondertussen de transfectie-oplossing voor humane ESC's en het celdissociatiemiddel naar kamertemperatuur.

Bereid één milliliter nucleofectie-plaatmedium voor per nucleofectieconditie. Verwijder vervolgens het iDR4-medium uit de putjes, gebruik één milliliter PBS op kamertemperatuur om de cellen te wassen en voeg het nucleofectie-plaatmedium toe. Draag 500 µL plaatmedium per monster over naar steriele buisjes van 1,5 milliliter en bewaar deze bij 37 °C tot het uitplaten.

Om de menselijke PSC's los te maken in een enkelcel-suspensie, verwijdert u het medium, wast u de cellen met PBS op kamertemperatuur en voegt u één milliliter 0,05% Trypsin of Accutase toe aan respectievelijk hPSC-culturen met of zonder feederlaag. Incubeer de culturen bij 37 °C. Neem vervolgens voorzichtig de plaat uit de incubator en aspireer, zonder de cellen te laten loslaten, het dissociatiemiddel en voeg 1 milliliter menselijk PSC-medium toe.

Dissocieer de loszittende cellen door het medium voorzichtig over het platoppervlak te spoelen, waarbij schuimvorming wordt voorkomen. Verzamel de cellen als een enkelvoudige cel-suspensie in een schone en steriele buis van 15 of 50 milliliter. Gebruik vervolgens 1 milliliter hESC-medium om de cellen te wassen en verzamel deze in dezelfde buis.

Neem een aliquot van 50 µL van de cel निलन voor het tellen en centrifugeer de resterende cellen bij 300 ×g bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Tel de cellen met een celenteller terwijl de suspensie wordt gecentrifugeerd. Verwijder het supernatant en gebruik PBS op kamertemperatuur om de celconcentratie voorzichtig te resuspenderen tot 10⁶ cellen per milliliter.

Breng vervolgens per experimentele conditie twee milliliter over naar schone steriele 15 milliliter buizen en herhaal de centrifugatie. Terwijl de monsters centrifugeren, bereidt u plasmidmengsels in drie schone 1,5 milliliter buizen met donor-flippase moleculaire ratio's van 0:1, 2:1 en 2:0, gebruikmakend van 2,5 microgram flippase-plasmid. Om door te gaan met de nucleofectie, haalt u de iDR4-plaat en de 1,5 milliliter buis met plaatmedium uit de incubator.

Pipette het PBS voorzichtig uit de buisjes, één voor één, zonder het pellet te verstoren, waarbij zoveel mogelijk van de buffer wordt verwijderd. Gebruik 100 microliters transfectieoplossing om het pellet door voorzichtig pipetteren opnieuw te suspenderen. Breng vervolgens de celsuspensie over naar de 1,5 milliliter buis met de plasmidmengsels en meng voorzichtig.

Breng het mengsel van cel-DNA over naar de transfectiecuvet, waarbij u erop let dat er geen luchtbellen ontstaan. Plaats de cuvet in het nucleofector-apparaat en voer programma A13 uit voor cellen die op feederlagen zijn gekweekt, of F16 voor feeder-vrije transfectie. Verwijder de cuvet en gebruik de wegwerppipetten uit de kit om voorzichtig, maar snel en in één beweging 0,5 milliliters platingmedium aan de cuvet toe te voegen.

Herstel vervolgens het volume op dezelfde manier en breng dit druppelgewijs over naar de 12-wells plaat die de iDR4 en het platingmedium bevat. Plaats de kweekschaal op een plank in de incubator en beweeg deze langzaam heen en weer en van links naar rechts om de celsuspensie gelijkmatig te verdelen. Incubeer de schaal gedurende 24 uur voordat het medium wordt vervangen.

Begin twee tot drie dagen na transfectie met de selectie. Zuig het medium af, was de cellen met 1 milliliter PBS en voeg vervolgens menselijk ESC-medium toe met 100 nanogram per milliliter puromycine. Observeer de celgroei en verhoog de puromycineconcentratie dienovereenkomstig tot een maximum van 250 nanogram per milliliter, waarbij de puromycineselectie zeven dagen wordt voortgezet.

Na drie tot vier dagen puromycineselectie wordt de selectie gestart met 0,5 micromolaire fialuride of FIAU. Verschiet het medium dagelijks en handhaaf FIAU gedurende maximaal zeven opeenvolgende dagen. Na voltooiing van de selectie, rond dag 14 tot 15, zullen resistente RMCE-koloniën aanwezig zijn die de nieuwe RMCE-lijn vormen.

Splits de cellen in een ratio van 1:2 volgens standaardprocedures. Wanneer de wells van Key 1 klaar zijn om gesplitst te worden, dissocieer dan de well voor karakterisering tot een single cell-suspensie zoals eerder in de video beschreven en verzamel de cellen in een 15 milliliter buis. Centrifugeer de cellen bij 300 ×g bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.

Gebruik vervolgens één milliliter PBS om de cellen te resuspenderen en verdeel het monster in tweeën. Het ene deel wordt gefilterd met een celzeef om flowcytometrie uit te voeren en het andere deel wordt gebruikt voor DNA-analyse volgens het tekstprotocol. Na transfectie met flippase recombinase en de tdT RMCE donor, vormden de hPSCs kleine groepjes cellen die gelijkmatig over de iDR4 MEF-laag waren verdeeld en constitutief GFP en transient tdT tot expressie brachten.

Positieve selectie met puromycine bevordert de insertie van de RMCE-donor, waarna negatieve selectie met FIAU uitsluitend selecteert op FRT-gemedieerde recombinatiegebeurtenissen zonder TK. Rond dag zes na transfectie kunnen kleine clusters van RMCE GFP-negatieve, tdT-positieve cellen worden geïdentificeerd. Zoals hier aangetoond, zijn GFP-negatieve, tdT-positieve RMCE-kolonies alleen aanwezig wanneer zowel de RMCE-donor als flippase worden gebruikt, terwijl RMCE niet plaatsvindt in afwezigheid van flippase. Flowcytometrische karakterisering van de nieuw gegenereerde RMCE-lijnen — de puromycine- en FIAU-resistente RMCE-kolonies, gecombineerd in een niet-klonale celpopulatie — bevestigt dat 100% van de cellen het RMCE GFP-negatieve, tdT-positieve fenotype vertoont.

Wanneer RMCE-donoren zonder recorderactiviteit in hPSC worden gebruikt, zijn 100% van de cellen GFP-negatief. De hier getoonde PCR-karakterisering van de niet-klonale RMCE-lijn demonstreert de volledige cassette-uitwisseling en dat het gebruikte selectieprogramma lijnen genereert die vrij zijn van willekeurige integratie, zowel van de RMCE-donor als van de flippase-expressievector. Samenvattend vereenvoudigt deze RMCE-methode genbewerking in hPSC's voor een gedefinieerde locus aanzienlijk in vergelijking met gerichte nucleasen.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze binnen 15 dagen worden voltooid. Daarom is RMCE een zeer snel instrument voor genbewerking dat vergelijkende studies in een isogene setting mogelijk maakt. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om transfectie-efficiënties van meer dan 30% te hebben en de juiste selectieagent voor core storage uit te voeren.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u RMCE uitvoert in de AAVS1-locus van menselijke PSC's en hoe u de recombinante lijn kunt karakteriseren.