Ontwikkeling van stamcel-afgeleide Antigeen-specifieke regulatoire T-cellen tegen auto-immuniteit

Het algemene doel van dit experiment is om een nieuwe methode te ontwikkelen voor het genereren van stamcel-afgeleide ontstoken gewricht-geassocieerde regulatorische T-cellen voor immunotherapie tegen auto-immuun artritis. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een sleutelvraag in het veld van auto-immuniteit over mogelijke immunotherapie voor auto-immuun artritis. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de stamcel-afgeleide regulatorische T-cellen nieuw zijn en van een enkele type.

Begin met het verdunnen van de feedercellen van belang tot een minimale dichtheid van een maal 10 tot de vierde cellen per vierkante centimeter in OP9 medium, en plateer een maal 10 tot de zesde feedercellen per 10 centimeter schaal. Wanneer de cellen 80 tot 90% confluënt zijn, verwijder het medium uit de culturen en zaai 0,5 tot een maal 10 tot de vijfde, retroviraal getransduceerde inducibele pluripotente stamcellen of IPSC's in OP9 medium in elke schaal. Vijf dagen later, zuig het medium af en was de cellen met 10 milliliter PBS.

Detach vervolgens de cellen met vier milliliter Trypsine per schaal, bij 37 graden Celsius. Na 10 minuten, stop de reacties met acht milliliter IPSC medium en centrifugeer de cellen. Resuspendeer de pellet in 10 milliliter vers IPSC medium en plateer de cellen op nieuwe 10 centimeter schalen.

Laat de feedercellen 30 minuten aan de plaat hechten in de celcultuur incubator. Verzamel vervolgens de zwevende IPSC's en filter de getransduceerde cellen door een 70 micron zeef voor het tellen. Zaai vijf maal 10 tot de vijfde IPSC's op een frisse 80 tot 90% confluënte plaat feedercellen in OP9 medium gesupplementeerd met Murine-Flt3-Ligand en plaats de culturen terug in de incubator.

Na drie dagen, gebruik een 10 milliliter pipet om de schaal met het cultuurmedium te wassen. Voeg vervolgens vijf milliliter vers OP9 medium toe aan de schaal en was voorzichtig en krachtig de semi-aangehechte IPSC's weg met voorzichtig, krachtig pipetten dat de feeder cell layer niet verstoort. Herhaal de was met 10 milliliter PBS om de laatste van de semi-aangehechte cellen te verzamelen, en trek de was uit elke schaal in één conische buis per cultuur.

Na het centrifugeren van de cellen, resuspendeer de pellets in 10 milliliter OP9 medium gesupplementeerd met Murine-Flt3-Ligand en IL-7 en filter de cellen door een 70 micron zeef. Zaai één IPSC cultuur per put in een zes-put cultuurplaat bevattende 80 tot 90% confluënte feeder cell monolagen en plaats de co-culturen terug in de incubator. Elke twee dagen, vervang de helft van het medium met vers OP9 medium gesupplementeerd met Murine-Flt3-Ligand en IL-7, en elke vier tot zes dagen, zaai de differentiërende IPSC's opnieuw op nieuwe platen met een verse laag feedercellen indien nodig.

Begin met het detacheren van de celculturen van belang met Trypsine en resuspendeer elk celtype in 10 milliliter vers medium. Plateer elke celcultuur in een nieuwe 10 centimeter schaal en laat de feedercellen aan de plaat hechten in de celcultuur incubator. Na 30 minuten, verzamel de zwevende IPSC's en passeer de culturen door individuele 70 micron celzeefjes om de celclusters voor het tellen te verwijderen.

Resuspendeer elke cultuur bij een concentratie van 1,5 maal 10 tot de zevende cellen per milliliter in koud PBS, en filter opnieuw indien nodig. Plaats vervolgens vier tot zes weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen één voor één in een kleine dierenpricker en adoptief breng 200 microliters van één type cel per muis over in de staartvene van elk dier. Gebruik een meetklok om de zwelling van beide knieën te meten om de basismeting vast te stellen.

10 dagen na de celoverdracht, gebruik een ene milliliter spuit om de muizen te injecteren met 100 microgram gemethyleerde BSA geëmulsioneerd in volledige Freund's adjuvant aan de basis van de staart van elk experimenteel dier. 17 dagen na de celoverdracht, induceer artritis door intra-articulaire injectie van 20 microgram gemethyleerde BSA in 10 microliters PBS in de linkerknie en 20 microgram gemethyleerde BSA en 100 microgram hele Ovalbumine in 10 microliters PBS in de rechter knie van elk anesthetiseerd adoptief overgebracht dier. Zeven dagen na het induceren van de artritis, meet opnieuw de knieën voor berekening van het percentage toename in de kniediameter, en verwijder chirurgisch de knieschijven.

Fixeer de gewrichten in formaline. Na decalcificatie in EDTA, bedden de knieën in paraffine en verkrijg vier micron secties voor histochemische kleuring en analyse. Op dag 28, tonen de antigeenspecifieke T regulatorische cellen substantiële niveaus van CD3 en antigeenspecifieke T cel receptoren.

De meeste van deze cellen tonen ook CD25, CD127, en CTLA-4, die allemaal typisch op verhoogde niveaus worden tot uitdrukking gebracht in natuurlijk voorkomende T regulatorische cellen. Inderdaad, FoxP3 blijft in IPSC-afgeleide T regulatorische cellen bestaan, zelfs na lange termijn in vitro stimulatie met de Notch ligand, zoals gedetecteerd door intracellulaire kleuring. Bovendien, produceren deze antigeenspecifieke IPSC T regulatorische cellen onderdrukkende cytokinen wanneer gestimuleerd met antigeen gepulseerde splenocyten in vitro, wat wijst op een potentieel onderdrukkend fenotype voor deze cellen.

FoxP3 positieve cellen worden waargenomen in OVA behandelde knieën met geen FoxP3 positieve cellen aanwezig in knieën die controle vector getransduceerde IPSC's ontvangen. Verder, veel meer CD4 positieve, FoxP3 positieve, TCR3 Beta 5 positieve cellen worden gevisualiseerd in de knieën van muizen die IPSC's ontvangen die getransduceerd zijn met de TCR-FoxP3 vector, dan met de FoxP3 vector alleen, wat suggereert dat antigeenspecifieke IPSC-Treg cellen naar de antigeen-geïnduceerde artritis knie migreren na hun adoptieve overdracht in ontvangende dieren. IPSC-afgeleide cel adoptieve overdracht heeft ook een substantiële afname van de inflammatoire knie zwelling wanneer OVA aanwezig is, maar heeft geen effect op controle gemethyleerde BSA geïnjecteerde knieën.

De positieve effecten van de zwellingsreductie worden verder bevestigd door hoo