Ontwikkeling van stamcel-afgeleide Antigeen-specifieke regulatoire T-cellen tegen auto-immuniteit

Het algemene doel van dit experiment is het ontwikkelen van een nieuwe methode voor het genereren van uit stamcellen afgeleide, met ontstoken gewrichten geassocieerde regulatoire T-cellen voor immunotherapie tegen auto-immuunartritis. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het vakgebied van auto-immuniteit over potentiële immunotherapeutica voor auto-immuunartritis. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de uit stamcellen afgeleide regulatoire T-cellen getypeerd zijn en van één enkel type.

Begin met het verdunnen van de betreffende feeder-cellen tot een minimale dichtheid van 1 × 10⁴ cellen per vierkante centimeter in OP9-medium, en zaai 1 × 10⁶ feeder-cellen per 10 centimeter schaal. Wanneer de cellen 80 tot 90% confluent worden, verwijder dan het medium uit de culturen en zaai 0,5 tot 1 × 10⁵ retroviraal getransduceerde induceerbare pluripotente stamcellen of IPSCs in OP9-medium in elke schaal. Vijf dagen later het medium aspireren en de cellen wassen met 10 ml PBS.

Detach daarna de cellen met vier milliliter Trypsine per schaal, bij 37 °C. Stop na 10 minuten de reacties met acht milliliter IPSC-medium en neem de cellen af voor centrifugatie. Resuspendeer het pellet in 10 milliliter vers IPSC-medium en zaai de cellen opnieuw uit op nieuwe schalen van 10 centimeter.

Laat de feeder-cellen 30 minuten in de celcultuurincubator hechten aan de plaat. Verzamel vervolgens de zwevende IPSC's en filter de getransduceerde cellen door een zeef van 70 micron om ze te tellen. Zaai vijf keer 10^5 IPSC's op een verse, 80 tot 90% confluente plaat met feeder-cellen in OP9-medium aangevuld met Murine-Flt3-Ligand en plaats de culturen terug in de incubator.

Was na drie dagen de schaal met het kweekmedium met behulp van een pipet van 10 milliliter. Voeg vervolgens vijf milliliter vers OP9-medium toe aan de schaal en was eventuele semi-adherente IPSCs voorzichtig weg door voorzichtig maar krachtig te pipetteren, zonder de laag feeder-cellen te verstoren. Herhaal het wassen met 10 milliliter PBS om de laatste semi-adherente cellen te oogsten, waarbij de wasvloeistoffen van elke schaal in één conische buis per kweek worden verzameld.

Nadat de cellen zijn gecentrifugeerd, worden de pellets geresuspendeerd in 10 milliliters OP9-medium aangevuld met Murine-Flt3-Ligand en IL-7 en worden de cellen door een 70 micron zeef gefilterd. Zaai één IPSC-cultuur per putje in een six-well kweekplaat die 80 tot 90% confluente feeder-cellmonolagen bevat en plaats de co-culturen terug in de incubator. Vervang elke twee dagen de helft van het medium door vers OP9-medium aangevuld met Murine-Flt3-Ligand en IL-7, en zaai de differentiërende IPSCs elke vier tot zes dagen opnieuw uit op nieuwe platen met een verse laag feeder-cellen indien nodig.

Begin met het losmaken van de betreffende celculturen met Trypsin en resuspendeer elk celtype in 10 milliliters vers medium. Plaats elke celcultuur in een nieuwe schaal van 10 centimeter en laat de feeder-cellen hechten in de celkweekincubator. Verzamel na 30 minuten de zwevende IPSCs en filter de culturen door individuele celzeven van 70 micron om celaggregaten te verwijderen voor het tellen.

Resuspende elke cultuur in koude PBS tot een concentratie van 1,5 × 10⁷ cellen per milliliter en filter indien nodig opnieuw. Plaats vervolgens vrouwelijke C57BL/6-muizen van vier tot zes weken oud één voor één in een fixatieapparaat voor kleine dieren en breng via adoptieve transfer 200 µL van één type cel per muis in de staartvene van elk dier over. Gebruik een digitale schuifmaat om de zwelling van beide knieën te meten om de nulmeting vast te stellen.

Inject 10 dagen na de celoverdracht 100 µg gemethyleerde BSA, geëmulgeerd in compleet adjuvans van Freund, met een spuit van één milliliter in de basis van de staart van elk experimenteel dier. Induceer 17 dagen na de celoverdracht artritis door middel van een intra-articulaire injectie van 20 µg gemethyleerde BSA in 10 µL PBS in het linkerkniegewricht, en 20 µg gemethyleerde BSA en 100 µg volledig ovalbumine in 10 µL PBS in het rechterkniegewricht van elk geanestheseerd dier na adoptieve overdracht. Meet zeven dagen na het induceren van de artritis de knieën opnieuw om de procentuele toename van de kniediameter te berekenen en excideer de patellae chirurgisch.

Fixeer de gewrichten in formaline. Na decalcificatie in EDTA worden de knieën in paraffine ingebed en worden coupes van vier micron gemaakt voor histochemische kleuring en analyse. Op dag 28 brengen de antigeenspecifieke T-regulatoire cellen substantiële niveaus van CD3 en antigeenspecifieke T-celreceptoren tot expressie.

De meeste van deze cellen brengen ook CD25, CD127 en CTLA-4 tot expressie, welke doorgaans in verhoogde mate tot expressie komen in natuurlijk voorkomende T-regulerende cellen. Inderdaad blijft FoxP3 aanwezig in uit iPSC afgeleide T-regulerende cellen, zelfs na langdurige in vitro stimulatie met het Notch-ligand, zoals aangetoond via intracellulaire kleuring. Daarnaast produceren deze antigeenspecifieke iPSC T-regulerende cellen suppressieve cytokinen wanneer ze in vitro worden gestimuleerd met antigeen-gepulste miltcellen, wat wijst op een potentieel suppressief fenotype van deze cellen.

FoxP3-positieve cellen worden waargenomen in OVA-behandelde knieën, terwijl geen FoxP3-positieve cellen zichtbaar zijn in knieën die iPSCs hebben ontvangen die getransduceerd zijn met de controlevector. Bovendien worden er veel meer CD4-positieve, FoxP3-positieve, TCR3 Beta 5-positieve cellen gevisualiseerd in de knieën van muizen die iPSCs ontvingen getransduceerd met de TCR-FoxP3-vector dan met de FoxP3-vector alleen, wat suggereert dat antigeenspecifieke iPSC-Treg-cellen migreren naar de door het antigeen geïnduceerde artritisknie na hun adoptieve transfer in recipientdieren. De adoptieve transfer van iPSC-afgeleide cellen leidt ook tot een aanzienlijke afname van de inflammatoire kniezwelling wanneer OVA aanwezig is, maar heeft geen effect op knieën waarin gecontroleerde gemethyleerde BSA is geïnjecteerd.

De positieve effecten van de vermindering van de zwelling worden verder bevestigd door Micro-CT-beeldvorming met hoge resolutie van het verminderde botverlies dat werd waargenomen in knieën behandeld met celtransfer in vergelijking met controledieren die alleen MBSA kregen geïnjecteerd. Zodra men hiervoor is opgeleid, kan deze uitgebreide procedure in zes weken worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd. Bij het toepassen van deze techniek is het belangrijk om te onthouden de geïnduceerde differentiatie van de TCR-FoxP3 antigeen-getransduceerde IPSCs te stimuleren.

Na deze procedure kunnen ook verschillende verbindingen van suppressieve cytokinen worden overwogen om aanvullende vragen te beantwoorden over de overleving en kwaliteit van de antigeenspecifieke iPSC-Tregcellen. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van celtherapie om de rol van antigeenspecifieke regulatoire T-cellen bij auto-immuunziekten te onderzoeken. Vergeet niet dat het werken met directe auto-antilichaam-vectoren uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van een procedure, zoals het werken in een basisvoorziening van niveau twee.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.