Name: Ontwikkeling van stamcel-afgeleide Antigeen-specifieke regulatoire T-cellen tegen auto-immuniteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Leer een methode om antigen-specifieke regulatoire T-cellen te genereren uit iPSCs voor immunotherapie tegen auto-immuun artritis. Deze techniek levert uniforme, functionele cellen voor doelgerichte behandeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd gefinancierd, voor een deel, in het kader van subsidies van de National Institutes of Health (R01AI121180, R21AI109239 en K18CA151798), de American Diabetes Association (1-16-IBS-281), en de Pennsylvania Department of Health (Tobacco Settlement Funds) aan JS

<ol><li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+concepts+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolving concepts of rheumatoid arthritis.</a> Nature. 423, 356-361 (2003).</li>
<li>Ferraro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interindividual+variation+in+human+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interindividual variation in human T regulatory cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E1111-E1120 (2014).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-expanded+antigen-specific+regulatory+T+cells+suppress+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes.</a> J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).</li>
<li>van Herwijnen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+that+recognize+a+ubiquitous+stress-inducible+self-antigen+are+long-lived+suppressors+of+autoimmune+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells that recognize a ubiquitous stress-inducible self-antigen are long-lived suppressors of autoimmune arthritis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 14134-14139 (2012).</li>
<li>Wright, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+therapy+with+redirected+primary+regulatory+T+cells+results+in+antigen-specific+suppression+of+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Adoptive therapy with redirected primary regulatory T cells results in antigen-specific suppression of arthritis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19078-19083 (2009).</li>
<li>Schmitt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+and+establishment+of+T+cell+competence+from+embryonic+stem+cells+differentiated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro.</a> Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).</li>
<li>La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T-cell+development+from+human+cord+blood+hematopoietic+stem+cells+by+Delta-like+1+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro.</a> Blood. 105, 1431-1439 (2005).</li>
<li>Lei, F., Haque, R., Weiler, L., Vrana, K. E., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lineage+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">T lineage differentiation from induced pluripotent stem cells.</a> Cell Immunol. 260, 1-5 (2009).</li>
<li>Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+towards+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes.</a> J Vis Exp. , e3986(2012).</li>
<li>Lei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+programming+of+tumor+antigen-specific+T+lymphocytes+from+pluripotent+stem+cells+to+promote+cancer+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance.</a> Cancer Res. 71, 4742-4747 (2011).</li>
<li>Haque, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+of+regulatory+T+cells+from+pluripotent+stem+cells+and+prevention+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity.</a> J Immunol. 189, 1228-1236 (2012).</li>
<li>Chi, V., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry%3A+paraffin+sections+using+the+Vectastain+ABC+kit+from+vector+labs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Lu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+all-trans+retinoic+acid+in+stabilizing+human+natural+regulatory+T+cells+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E3432-E3440 (2014).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-9-CD44+interaction+enhances+stability+and+function+of+adaptive+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Galectin-9-CD44 interaction enhances stability and function of adaptive regulatory T cells.</a> Immunity. 41, 270-282 (2014).</li>
<li>Di Stasi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+apoptosis+as+a+safety+switch+for+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.</a> N Engl J Med. 365, 1673-1683 (2011).</li>
<li>Ramos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+caspase+9+suicide+gene+to+improve+the+safety+of+mesenchymal+stromal+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An inducible caspase 9 suicide gene to improve the safety of mesenchymal stromal cell therapies.</a> Stem Cells. 28, 1107-1115 (2010).</li>
<li>Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3+and+Bcl-xL+cooperatively+promote+regulatory+T+cell+persistence+and+prevention+of+arthritis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development.</a> Arthritis Res Ther. 12, R66(2010).</li>
<li>van Loenen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+T+cell+receptor+dimers+harbor+potentially+harmful+neoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).</li>
<li>Kim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antigen-specific+human+regulatory+T+cells%3A+immunosuppression+of+FVIII-specific+T-+and+B-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses.</a> Blood. 125, 1107-1115 (2015).</li>
<li>Himburg, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotrophin+regulates+the+expansion+and+regeneration+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.</a> Nat Med. 16, 475-482 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit protocol, een cruciale stap is in vitro differentiatie van TCR / Foxp3-gen getransduceerd iPSCs. In vitro Notch signalering induceert ontwikkeling is in de T-cellijn. Om iPSCs differentiëren in CD4 + Foxp3 + Tregs, gebruikten we de OP9-DL1 / DL4 / IA B-cellen, die zeer express MHC II (IA b) moleculen. De meeste iPSCs differentiëren in CD4 + cellen. Na de oppervlak TCR-expressie vele gedifferentieerde pre-T-cellen verliezen het vermogen om te...

Auto-immuun artritis is een systemische ziekte die wordt gekenmerkt door hyperplasie van synoviaal weefsel en progressieve vernietiging van gewrichtskraakbeen, bot en ligamenten1. De defecte generatie of functie van Tregs bij auto-immuun artritis draagt bij aan chronische ontsteking en weefselschade, omdat Tregs een cruciale rol spelen bij het voorkomen van de ontwikkeling van auto-reactieve immuuncellen.
Manipulatie van Tregs is een ideale strategie voor de ontwikkeling van therapieën om ontsteking op een Ag-afhankelijke manier te onderdrukken. Voor Treg-gebaseerde immunotherapie is de specificiteit van de overgedragen Tregs belangrijk voor de behandeling van lopende auto-immuniteit2. Om de onderdrukkende activiteit te vertonen, moeten Tregs migreren en worden vastgehouden in het getroffen gebied, wat kan worden gericht door de specificiteit van de TCR voor het Ag op die locatie3. Hoewel polyklonale Tregs een kleine populatie kunnen bevatten met deze Ag-specificiteit vanuit hun TCRs, zijn de aantallen van deze Ag-specifieke Tregs meestal laag. Bijgevolg vereisen cel-gebaseerde therapieën die polyklonale Tregs tegen auto-immuunstoornissen gebruiken adoptieve overdrachten van een groot aantal Tregs4,5. Omdat pluripotente stamcellen (PSCs) de mogelijkheid hebben zich tot elk type cel te ontwikkelen, kunnen Ag-specifieke PSC-Tregs goede kandidaten zijn voor Treg-gebaseerde immunotherapie. Eerdere studies hebben de succesvolle ontwikkeling van PSC-afgeleide T-cellen, inclusief Tregs, aangetoond6-8.
Hier beschrijven we een protocol om Ag-specifieke iPSC-Tregs te ontwikkelen. We beschrijven verder een cel-gebaseerde therapie van auto-immuun artritis in een muismodel met behulp van dergelijke Tregs. Deze methode is gebaseerd op het genetisch modificeren van muis-iPSCs met Ag-specifieke TCRs en het transcriptiefactor FoxP3. De gemanipuleerde iPSCs differentiëren vervolgens tot Ag-specifieke Tregs op de OP9-stromacellen die Notch-liganden DL1, DL4 en MHC-II (I-Ab) moleculen tot expressie brengen in aanwezigheid van cytokines mFlt3L en mIL-7. Deze Ag-specifieke iPSC-Tregs kunnen onderdrukkende cytokinen produceren, zoals TGF-β en IL-10, wanneer gestimuleerd met het Ag, en adoptieve overdracht van dergelijke Tregs heeft de mogelijkheid om de ontwikkeling van AIA in een muismodel te onderdrukken. Het beschreven protocol kan worden gebruikt om stamcel-afgeleide Ag-specifieke Tregs te ontwikkelen voor potentiële therapeutische interventies.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6j muizen</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>B6.129S7 Rag1tm1Mom/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2216</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 (2C11) antilichaam</td><td>BD Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD28 (37.51) antilichaam</td><td>BD Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4 (GK1.5) antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>100417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8 (53&ndash;6.7) antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD25 (3C7) antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>101912</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCR-&beta; (H57597) antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>109220</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IL10</td><td>Biolegend</td><td>505010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TGF&beta;</td><td>Biolegend</td><td>141402</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Genejammer</td><td>Integrated science</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysis buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Let op: Allergeen, kankerverwekkend, giftig</td></tr><tr><td>Permeabilisatie buffer</td><td>Biolegend</td><td>421002</td><td></td></tr><tr><td>mBSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Ova albumine</td><td>Avantor</td><td>0440-01</td><td></td></tr><tr><td>CFA</td><td>Difco</td><td>2017014</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner begrenzer</td><td>Braintree scientific</td><td>RTV 150-STD</td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van stamcel-afgeleide antigeen-specifieke regulatoire t-cellen tegen auto-immuniteit

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Auto-immuunziekten worden veroorzaakt door het verlies van immunologische zelftolerantie. Regulatoire T-cellen (Tregs) zijn belangrijke mediatoren van immunologische zelf-tolerantie. Tregs voor ongeveer 5-10% van de volwassen CD4 + T-cel subpopulaties in muis en mens, met ongeveer 1-2% van de Tregs circuleren in het perifere bloed. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) kunnen worden gedifferentieerd in functionele Tregs, die een potentieel om te worden gebruikt voor celtherapie van auto-immuunziekten. Hier presenteren we een methode voor antigeen (Ag) -specifieke Tregs van iPSCs (dwz iPSC-Tregs) ontwikkelen. De werkwijze is gebaseerd op het opnemen van de transcriptiefactor Foxp3 en een Ag-specifieke T-celreceptor (TCR) in iPSCs en vervolgens differentiëren naar OP9 stromale cellen die Notch liganden delta-achtige (DL) en 1 DL4. Naar aanleiding van in vitro differentiatie, de iPSC-Tregs uiten CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3 en Ag-specifieke TCR en zijn in staat om te reageren op Ag stimulatie.Deze werkwijze is met succes toegepast op cellen gebaseerde behandeling van autoimmune artritis in een muizenmodel. Adoptieve overdracht van deze Ag-specifieke iPSC-Tregs in Ag-geïnduceerde artritis (AIA) dragende muizen heeft het vermogen om gewrichtsontsteking te verminderen en zwelling en botverlies voorkomen.

Zoals hier getoond, op dag 28, Ag-specifieke Tregs zakelijk weergegeven CD3 en Ag-specifieke TCR, twee T-cel markers. De CD3 + TCRVβ5 + populatie CD4 tot expressie. De meeste van de CD3 + CD4 + TCRVβ5 + cellen ook tot expressie CD25, CD127, en CTLA-4, die typisch bij verhoogde hoeveelheden worden uitgedrukt in natuurlijk voorkomende T regs (nTregs) en T-cellen die ectopisch Foxp3. Foxp3 expressie in iPSC-afgeleide cellen b...

We presenteren hier een methode om functionele antigeen (Ag)-specifieke regulatoire T-cellen (Tregs) te ontwikkelen uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) voor immunotherapie van auto-immuun artritis in een muismodel.

Ontwikkeling van stamcel-afgeleide Antigeen-specifieke regulatoire T-cellen tegen auto-immuniteit

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Het algemene doel van dit experiment is het ontwikkelen van een nieuwe methode voor het genereren van uit stamcellen afgeleide, met ontstoken gewrichten geassocieerde regulatoire T-cellen voor immunotherapie tegen auto-immuunartritis. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het vakgebied van auto-immuniteit over potentiële immunotherapeutica voor auto-immuunartritis. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de uit stamcellen afgeleide regulatoire T-cellen getypeerd zijn en van één enkel type.Begin met het verdunnen van de betreffende feeder-cellen tot een minimale dichtheid van 1 × 10⁴ cellen per vierkante centimeter in OP9-medium, en zaai 1 × 10⁶ feeder-cellen per 10 centimeter schaal. Wanneer de cellen 80 tot 90% confluent worden, verwijder dan het medium uit de culturen en zaai 0,5 tot 1 × 10⁵ retroviraal getransduceerde induceerbare pluripotente stamcellen of IPSCs in OP9-medium in elke schaal. Vijf dagen later het medium aspireren en de cellen wassen met 10 ml PBS.Detach daarna de cellen met vier milliliter Trypsine per schaal, bij 37 °C. Stop na 10 minuten de reacties met acht milliliter IPSC-medium en neem de cellen af voor centrifugatie. Resuspendeer het pellet in 10 milliliter vers IPSC-medium en zaai de cellen opnieuw uit op nieuwe schalen van 10 centimeter.Laat de feeder-cellen 30 minuten in de celcultuurincubator hechten aan de plaat. Verzamel vervolgens de zwevende IPSC's en filter de getransduceerde cellen door een zeef van 70 micron om ze te tellen. Zaai vijf keer 10^5 IPSC's op een verse, 80 tot 90% confluente plaat met feeder-cellen in OP9-medium aangevuld met Murine-Flt3-Ligand en plaats de culturen terug in de incubator.Was na drie dagen de schaal met het kweekmedium met behulp van een pipet van 10 milliliter. Voeg vervolgens vijf milliliter vers OP9-medium toe aan de schaal en was eventuele semi-adherente IPSCs voorzichtig weg door voorzichtig maar krachtig te pipetteren, zonder de laag feeder-cellen te verstoren. Herhaal het wassen met 10 milliliter PBS om de laatste semi-adherente cellen te oogsten, waarbij de wasvloeistoffen van elke schaal in één conische buis per kweek worden verzameld.Nadat de cellen zijn gecentrifugeerd, worden de pellets geresuspendeerd in 10 milliliters OP9-medium aangevuld met Murine-Flt3-Ligand en IL-7 en worden de cellen door een 70 micron zeef gefilterd. Zaai één IPSC-cultuur per putje in een six-well kweekplaat die 80 tot 90% confluente feeder-cellmonolagen bevat en plaats de co-culturen terug in de incubator. Vervang elke twee dagen de helft van het medium door vers OP9-medium aangevuld met Murine-Flt3-Ligand en IL-7, en zaai de differentiërende IPSCs elke vier tot zes dagen opnieuw uit op nieuwe platen met een verse laag feeder-cellen indien nodig.Begin met het losmaken van de betreffende celculturen met Trypsin en resuspendeer elk celtype in 10 milliliters vers medium. Plaats elke celcultuur in een nieuwe schaal van 10 centimeter en laat de feeder-cellen hechten in de celkweekincubator. Verzamel na 30 minuten de zwevende IPSCs en filter de culturen door individuele celzeven van 70 micron om celaggregaten te verwijderen voor het tellen.Resuspende elke cultuur in koude PBS tot een concentratie van 1,5 × 10⁷ cellen per milliliter en filter indien nodig opnieuw. Plaats vervolgens vrouwelijke C57BL/6-muizen van vier tot zes weken oud één voor één in een fixatieapparaat voor kleine dieren en breng via adoptieve transfer 200 µL van één type cel per muis in de staartvene van elk dier over. Gebruik een digitale schuifmaat om de zwelling van beide knieën te meten om de nulmeting vast te stellen.Inject 10 dagen na de celoverdracht 100 µg gemethyleerde BSA, geëmulgeerd in compleet adjuvans van Freund, met een spuit van één milliliter in de basis van de staart van elk experimenteel dier. Induceer 17 dagen na de celoverdracht artritis door middel van een intra-articulaire injectie van 20 µg gemethyleerde BSA in 10 µL PBS in het linkerkniegewricht, en 20 µg gemethyleerde BSA en 100 µg volledig ovalbumine in 10 µL PBS in het rechterkniegewricht van elk geanestheseerd dier na adoptieve overdracht. Meet zeven dagen na het induceren van de artritis de knieën opnieuw om de procentuele toename van de kniediameter te berekenen en excideer de patellae chirurgisch.Fixeer de gewrichten in formaline. Na decalcificatie in EDTA worden de knieën in paraffine ingebed en worden coupes van vier micron gemaakt voor histochemische kleuring en analyse. Op dag 28 brengen de antigeenspecifieke T-regulatoire cellen substantiële niveaus van CD3 en antigeenspecifieke T-celreceptoren tot expressie.De meeste van deze cellen brengen ook CD25, CD127 en CTLA-4 tot expressie, welke doorgaans in verhoogde mate tot expressie komen in natuurlijk voorkomende T-regulerende cellen. Inderdaad blijft FoxP3 aanwezig in uit iPSC afgeleide T-regulerende cellen, zelfs na langdurige in vitro stimulatie met het Notch-ligand, zoals aangetoond via intracellulaire kleuring. Daarnaast produceren deze antigeenspecifieke iPSC T-regulerende cellen suppressieve cytokinen wanneer ze in vitro worden gestimuleerd met antigeen-gepulste miltcellen, wat wijst op een potentieel suppressief fenotype van deze cellen.FoxP3-positieve cellen worden waargenomen in OVA-behandelde knieën, terwijl geen FoxP3-positieve cellen zichtbaar zijn in knieën die iPSCs hebben ontvangen die getransduceerd zijn met de controlevector. Bovendien worden er veel meer CD4-positieve, FoxP3-positieve, TCR3 Beta 5-positieve cellen gevisualiseerd in de knieën van muizen die iPSCs ontvingen getransduceerd met de TCR-FoxP3-vector dan met de FoxP3-vector alleen, wat suggereert dat antigeenspecifieke iPSC-Treg-cellen migreren naar de door het antigeen geïnduceerde artritisknie na hun adoptieve transfer in recipientdieren. De adoptieve transfer van iPSC-afgeleide cellen leidt ook tot een aanzienlijke afname van de inflammatoire kniezwelling wanneer OVA aanwezig is, maar heeft geen effect op knieën waarin gecontroleerde gemethyleerde BSA is geïnjecteerd.De positieve effecten van de vermindering van de zwelling worden verder bevestigd door Micro-CT-beeldvorming met hoge resolutie van het verminderde botverlies dat werd waargenomen in knieën behandeld met celtransfer in vergelijking met controledieren die alleen MBSA kregen geïnjecteerd. Zodra men hiervoor is opgeleid, kan deze uitgebreide procedure in zes weken worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd. Bij het toepassen van deze techniek is het belangrijk om te onthouden de geïnduceerde differentiatie van de TCR-FoxP3 antigeen-getransduceerde IPSCs te stimuleren.Na deze procedure kunnen ook verschillende verbindingen van suppressieve cytokinen worden overwogen om aanvullende vragen te beantwoorden over de overleving en kwaliteit van de antigeenspecifieke iPSC-Tregcellen. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van celtherapie om de rol van antigeenspecifieke regulatoire T-cellen bij auto-immuunziekten te onderzoeken. Vergeet niet dat het werken met directe auto-antilichaam-vectoren uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van een procedure, zoals het werken in een basisvoorziening van niveau twee.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.

development-stem-cell-derived-antigen-specific-regulatory-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Regulatoire T-cellen: therapeutisch potentieel voor de behandeling van afstoting van transplantaten en type I diabetes

Wij beschrijven een werkwijze voor het regulerende, geheugen naïeve T-cellen van een menselijke bloed donoren. Gepolariseerde Tregs kan worden vergeleken met andere subgroepen in verschillende genetische en functionele toepassingen met genetische homogeniteit, zoals onderdrukking assay ook hier beschreven.

Genereren van Induced regulatoire T-cellen uit primaire menselijke naïef en geheugen T-cellen

Genereren van T-lymfocyten van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen geeft een alternatieve aanpak van het gebruik van embryonale stamcellen voor T-cel-gebaseerde immunotherapie. De werkwijze blijkt dat door een...

Geregisseerd Differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen naar T lymfocyten

This video showcases a cell-based therapy for autoimmune arthritis in mice. iPSC-derived T regulatory cells expressing ovalbumin-specific receptors are injected with methylated bovine serum albumin (mBSA) emulsified in an adjuvant. Murine antigen-presenting cells (APCs) process and present the mBSA to T cells, prompting T cell activation and migration to the knee joint's synovial membrane. Subsequent injections involve mBSA alone in the left knee and a combination of mBSA and ovalbumin in the...

A Cell-Based Therapy for Autoimmune Arthritis in a Murine Model

Adenovirale genoverdracht in naïeve CD4 T-cellen met transgene expressie van de Coxsackie adenovirus receptor kan de moleculaire analyse van regulatoire T...

Adenovirale transductie van Naïeve CD4 T-cellen aan Treg Differentiatie Studie

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het genereren van tumor antigeen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige Thymus emigants (iTE) door een driedimensionaal (3D) Thymus cultuur systeem. iET zijn een homogene deelverzameling van T-cellen die nauw verwant zijn aan naïeve T-cellen met de capaciteit voor proliferatie, Geheugenvorming en tumor onderdrukking.

Een driedimensionaal Thymic cultuur systeem voor het genereren van Murine geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige tumor antigen-specifieke Thymic emigranten

Dit artikel beschrijft een protocol voor het genereren van antigeen-specifieke CD8 T-cellen, en de uitbreiding ervan in vitro, met als doel het opleveren van een hoog aantal functionele T-cellen voor gebruik in vitro en in vivo.

Zeer efficiënte generatie van antigeen-specifieke cytotoxische T-cellen voor de functionele test in een auto-immune diabetes model

Dit artikel beschrijft een methode voor het genereren van functionele tumor antigen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide CD8αβ+ enkele positieve T-cellen met behulp van OP9/dll1-co-cultuur systeem.

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

Hier is een protocol voor de effectieve onderdrukking van replicatie van het hepatitis B-virus (HBV) in muizen door gebruik te maken van de adoptieve celoverdracht (ACT) van stamcel afkomstige virale antigeen (AG)-specifieke T-lymfocyten. Deze procedure kan worden aangepast voor mogelijke op ACT gebaseerde immunotherapie van HBV-infectie.

Stamcel afkomstige virale AG-specifieke T-lymfocyten onderdrukken HBV-replicatie bij muizen

Dit protocol biedt een gestroomlijnde workflow voor het genereren en testen van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen (CAR Tregs).

Generatie van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen

Leer een methode om antigen-specifieke regulatoire T-cellen te genereren uit iPSCs voor immunotherapie tegen auto-immuun artritis. Deze techniek levert uniforme, functionele cellen voor doelgerichte behandeling.

Ontwikkeling van stamcel-afgeleide Antigeen-specifieke regulatoire T-cellen tegen auto-immuniteit

Meer video's verkennen