Een Facile en efficiënte aanpak voor de productie van omkeerbare Disulfide Cross-linked micellen

Het algemene doel van deze procedure is om een eenvoudig en effectief protocol te bieden voor het synthetiseren van medicijn-geladen disulfide gekruiste micellen voor gerichte geneesmiddelafgifte. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van nano-geneeskunde. Bijvoorbeeld hoe effectief stabiele nanoformuleringen kunnen worden geproduceerd.

Het grootste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om gemakkelijk disulfide gekruiste micellen op grote schaal te synthetiseren, wat uiterst wenselijk is voor klinische studies bij patiënten. Om met deze procedure te beginnen, voegt u twee gram monomethyl-termineerde polyethyleenglycol-monoamine toe aan een ronde bodemkolf. Voeg tien milliliter anhydrous DMF toe om het op te lossen.

Koel op ijs. Voeg drie equivalenten hydroxybenzotriazool, drie equivalenten DIC en drie equivalenten di-eth-moc beschermde lysine toe aan een ronde bodemkolf. Voeg vervolgens tien milliliter anhydrous DMF toe.

Roer het mengsel gedurende 20 minuten op een magnetische roerplaat. Voeg vervolgens het mengsel toe aan de ronde bodemkolf met monomethyl-termineerde polyethyleenglycol. Verwijder de ronde bodemkolf uit het ijsbad en roer vervolgens een nacht bij kamertemperatuur.

Zodra het roeren is voltooid, bevestigt u de voltooiing van de reactie zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg 200 milliliter ijskoude ether toe aan de reactiekolf. Centrifugeer gedurende zes minuten bij 6.000 x g en vier graden Celsius om het geprecipiteerde polymeer te scheiden.

Herhaal het precipitatie- en centrifugatieproces twee keer en lost het product elke keer opnieuw op in 10 milliliter DMF voordat het wordt geprecipiteerd. Was vervolgens het polymeer drie keer met ijskoude ether. Sluit de buis aan op een hoge vacuümbron om de resterende ether te verwijderen.

Voeg hierna 20 milliliter van 20% 4-methylpiperidine in DMF toe aan het polymeer. Roer totdat het oplossen compleet is. Laat de reactie drie uur doorlopen.

Nadat u de voltooiing van de reactie hebt bevestigd, droogt u het polymere product. Droog nu polymeerintermediair nummer twee onder vacuüm en voer vervolgens aanvullende polymere synthese stappen uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Zodra polymeerintermediair nummer 10 is geproduceerd, brengt u het over naar een reactiekolf.

Voeg 30 milliliter anhydrous DMF toe. Los in een nieuwe kolf 24 equivalenten geactiveerd cholic acid op in 20 milliliter DMF. Voeg vervolgens 48 equivalenten N, N-Diisopropylethylamine toe.

Roer gedurende 10 minuten. Na het roeren, brengt u het mengsel over naar de reactiekolf met polymeerintermediair nummer 10. Laat de reactie een nacht doorlopen.

Bevestig de volgende dag de voltooiing van de reactie en geprecipiteerd polymeerintermediair nummer 11, zoals beschreven in het tekstprotocol. Dialyseer vervolgens het polymeerintermediair in gedeïoniseerd water. Lyophiliseer het monster om een wit poeder te verkrijgen.

Na het bereiden van de micel, lost u 20 milligram telodendrimeer en vijf milligram PTX op in één milliliter chloroform. Verwijder het oplosmiddel met behulp van een roterende verdamper om een homogene droge polymeerfilm te verkrijgen. Reconstitueer de film met één milliliter PBS door te vortexen.

Soniceer vervolgens gedurende 30 minuten bij 40 kilohertz. Voeg 3% waterstofperoxide toe om de thiolgroepen op het telodendrimeer te oxideren. Voer aanvullende voorbereidings- en verificatie stappen uit zoals beschreven in het tekstprotocol.

Nadat de micelbereiding voltooid is, meet u de grootte en grootteverdeling van de micellen met behulp van een dynamisch lichtverstrooiingsinstrument. Voer de metingen uit bij kamertemperatuur en houd de micelconcentratie op één milligram per milliliter. Bereid vervolgens een 7,5 milligram per milliliter stockoplossing van natriumdodecylsulfaat in PBS voor.

Bereid vervolgens een 1,5 milligram per milliliter stockoplossing van disulfide gekruiste micellen in PBS voor. Gebruik deze stockoplossingen om een mengsel te creëren waarbij de uiteindelijke SDS-concentratie 2,5 milligram per milliliter is en de micelconcentratie 1,0 milligram per milliliter is.

Laad het monster en meet de grootte en grootteverdeling van de miceloplossing met tussenpozen van twee minuten. Na het verzamelen van vers geciteerd bloed van naakte muizen, centrifugeert u een monstersteekproef van één milliliter bij 1.000 x g gedurende 10 minuten om rode bloedcellen te verzamelen. Was ze drie keer met PBS en suspendeer vervolgens het celpellet met PBS tot een uiteindelijke concentratie van 2%. Meng 200 microliters erytrocytensuspensie met een oplossing van 1,0 milligram per milliliter PTX NCM's.

Meng vervolgens 200 microliters erytrocytensuspensie met een oplossing van 1,0 milligram per milliliter PTX DCM's. Incubeer deze mengsels gedurende vier uur in een incubator shaker bij 37 graden Celsius. Na incubatie centrifugeert u de mengsels gedurende vijf minuten bij 3.000 x g.

Breng 100 microliter van het supernatant van elk monster over naar een 96-wells plaat. Gebruik vervolgens een microplaatlezer om de absorptie van vrij hemoglobine bij 540 nanometer te meten. Zoals gemeten door de Test van Ellman, bereikte de conversiesnelheid van vrije thiolgroepen naar disulfidebindingen 85% na 48 uur van door zuurstof gemedieerde oxidatie.

Hier wordt een door waterstofperoxide gemedieerde oxidatiemethode gebruikt als alternatieve methode. De conversiesnelheid bereikt 88% in 30 minuten. Dat is 96 keer sneller dan de door zuurstof gemedieerde benadering.

Met behulp van deze efficiëntere aanpak zijn meer dan 50 gram nanodeeltjes geproduceerd met een gemeten deeltjesgrootte van 27 nanometer met een smalle grootteverdeling. De stabiliteit van PTX-geladen disulfide gekruiste micellen is ook onder ernstige micelstorende omstandigheden onderzocht. De deeltjesgrootte van de micellen bleef stabiel over de tijd, wat aangeeft dat ze intact bleven.