Screening op hormonale activiteit in water met behulp van de handel verkrijgbare In Vitro Transactivering Bioassays

Het algemene doel van deze gestandaardiseerde procedure is om watermonsters te screenen op endocriene actieve chemicaliën, met behulp van commercieel verkrijgbare, receptor-gebaseerde celassays. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van waterkwaliteitsbewaking te beantwoorden, zoals: zijn endocriene actieve chemicaliën daadwerkelijk aanwezig in het monster? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een groep endocriene actieve verbindingen veel sneller kan analyseren dan de huidige chemische methoden.

Deze techniek kan helpen bij het diagnosticeren van waterkwaliteitsproblemen die voortvloeien uit de aanwezigheid van endocriene verstoringen. Deze methode biedt inzicht in verontreinigingen in water, maar kan ook worden toegepast op andere omgevingsmatrices, zoals sediment en weefsels. Over het algemeen kunnen individuen die nieuw zijn in deze techniek worstelen, omdat het hoge precisie vereist bij het gebruik van pipetteringstechnieken.

Om met deze procedure te beginnen, bereid het watermonster voor in stockoplossingen van assay-specifiek medium en referentiechemisch product, zoals beschreven in het tekstprotocol. Bewaar het assay-specifiek medium bij vier graden Celsius voor langdurige opslag. Voeg vervolgens 15 microliters van de juiste referentiechemische stock toe aan 285 microliters assaymedium in een steriele buis.

Meng het monster door op en neer te pipetteren. Voeg vervolgens 200 microliters 5%DMSO in assaymedium toe aan acht extra buizen. Breng een aliquot van 100 microliter van buis één over naar buis twee, om een drievoudige verdunningsreeks te beginnen.

Meng het verdunde monster in buis twee grondig met een pipette. Breng vervolgens een 100-microliter aliquot van buis twee over naar buis drie. Herhaal dit proces voor elke buis.

Bereid vervolgens een oplosmiddelcontrolemonster voor door 10 microliters DMSO te mengen in 190 microliters assaymedium. Verzamel en label vervolgens vier nieuwe buizen. Voeg 95 microliters assaymedium toe aan de eerste buis.

Voeg vervolgens vijf microliters waterextract toe en meng grondig. Voeg 50 microliters 5%DMSO in assaymedium toe aan de andere drie buizen. Voer vervolgens een tweevoudige verdunning uit door 50 microliters oplossing over te brengen van de ene buis naar de andere.

Begin met een fles ER of GR-delingsgeremde cellen uit de cryogeen vriezer te halen. Ontdooi de cellen snel door de fles gedurende twee minuten in een 37 graden Celsius waterbad te plaatsen, met zachte agitering. Ontsmet vervolgens de fles met 70% Ethanol.

Plaats het in een biologische veiligheidskast van klasse twee. Open de fles met behulp van aseptische technieken en breng de cellen over in 10 milliliter assaymedium. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 200 keer g.

Wanneer de centrifugatie voltooid is, gebruik een steriele glazen pipette om het supernatant te aspireren. Breng vervolgens de celpellet opnieuw in suspensie in zes milliliter assaymedium. Meng vijf microliters celsuspensie met vijf microliters vitale kleurvloeistofoplossing.

Voeg vervolgens een aliquot toe aan een tellingskamer. Tel het aantal levende cellen met behulp van een lichtmicroscoop of geautomatiseerde celteller. Schat vervolgens de dichtheid van de levende cellen in de celsuspensie.

Verdun indien nodig, om een ​​uiteindelijke dichtheid van 550.000 levende cellen per milliliter assaymedium te verkrijgen. Begin met het maken van een platenindeling die een negenpunts assayspecifieke calibratiecurve, QA/QC-monsters en meerdere verdunningen voor elk waterextract omvat. Voeg 90 microliters assaymedium toe aan de replicaatcelvrije controleputjes.

Giet de celsuspensie in een steriele pipetteerreserve. Voeg vervolgens met behulp van een multikanaals pipette 90 microliters celsuspensie toe aan de andere putjes. Voeg 10 microliters van de verdunde monsters toe aan de juiste putjes.

Dek de plaat af met een deksel. Plaats vervolgens de plaat in een 5% C02-incubator bij 37 graden Celsius gedurende 16 uur. Laat de plaat na incubatie acclimatiseren naar kamertemperatuur.

De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in afwezigheid van direct licht. Bereid een zes x laadoplossing volgens de instructies van de fabrikant. Voeg vervolgens 20 microliters van de laadoplossing toe aan elk putje.

Voeg 10 microliters celviabiliteitsreagens toe aan elk putje om de cytotoxiciteit van het verdunde waterextract te evalueren. Sluit de plaat af met aluminium kleeffolie. Incubeer vervolgens de plaat in het donker bij kamertemperatuur gedurende twee uur.

Nadat de incubatie voltooid is, voegt u de plaat toe aan de microplaatlezer met bodemleespositie. Meet de fluorescentie en analyseer de gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze studie werden vier 24-uurs samengestelde monsters van behandeld gemeentelijk afvalwater, zes monstermonsters van oppervlaktewater uit zoetwatersystemen in Zuid-Californië en een veldleegmonster bestaande uit ultrapuur water geanalyseerd.

ER-activiteit werd gedetecteerd in zeven van de 10 representatieve watermonsters, terwijl GR-activiteit in vier werd gedetecteerd. De QA/QC-prestatierichtlijnen voor de oestrogeenreceptor en glucocorticoïde receptorassays zijn hier te zien. De studieresultaten voor cytotoxiciteit en monsterprecisie vielen ruim binnen de acceptatiecriteria, waardoor de watermonstermetingen werden gevalideerd.

De hoogste bioassay-equivalente concentraties werden gevonden in de secundaire effluenten, terwijl de GR-activiteit van het tertiaire effluent werd gevonden onder de bio assay-detectielimiet. Evenzo vertoonden de meeste oppervlaktewatermonsters geen GR-activiteit boven de detectielimiet en hadden veel lagere niveaus van ER-activiteit dan de secundaire effluenten. De meerderheid van de afvalwaterbehandelingsinstallatie-effluentmonsters vertoonde een dosisrespons boven de detectielimiet voor zowel ER- als GR-bioassays.

De representatieve resultaten voor de gemiddelde blauw/groen fluorescentieverhouding van deze monsters, uitgezet tegen de relatieve verrijkingsfactor, zijn hier te zien. Deze techniek kan in 24 uur worden uitgevoerd, mits correct uit