Name: Screening op hormonale activiteit in water met behulp van de handel verkrijgbare In Vitro Transactivering Bioassays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Leer een gestandaardiseerde methode voor het screenen van watermonsters op endocrien actieve chemicaliën met behulp van receptor-gebaseerde celassays. Deze techniek biedt snellere analyse dan traditionele methoden en verbetert de monitoring van waterkwaliteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De financiering werd verzorgd door de State Water Resources Control Board (Overeenkomsten Nr. 10-096-250 en 14-090-270). We danken S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi en J. Printen. De auteurs verklaren geen belangenconflict te hebben, en verwijzing naar handelsnamen impliceert geen goedkeuring.

1. verzamelen en verwerken Water Sample (Gewijzigd van Escher et al. 9) <ol><li> Vul een schone 1 L amberkleurige glazen flacon met 1 g natriumazide en 50 mg ascorbinezuur naar de top met watermonster van belang. Store monster bij 4 ° C en het proces binnen 72 uur. OPMERKING: Natriumazide is zeer giftig en moeten met de nodige voorzichtigheid worden behandeld. Gebruik beschermende kleding (oog- / gezichtsbescherming, handschoenen, kleding) en wegen in een goed functionerende rook-hood. Gebruik geen metalen spatel voor het wegen. </li><li> Passeert het monster door een 1,6 uM glasvezelfilter en vervolgens door een vooraf geconditioneerde vastefase-extractie (SPE) cartridge met een stroomsnelheid van 5-10 ml / min. Stel de druk van de vacuümpomp om de stroom te regelen. </li><li> Vacuüm drogen de patroon 15 min. </li><li> Elueer de cartridge 10 ml methanol, gevolgd door 10 ml aceton: hexaan (1: 1, v / v). </li><li> Concentreer eluaat ~ 1 ml onder een zachte stroom van zeer zuivere stikstof. solventuitwisseling door toevoeging van 500 pl dimethylsulfoxide (DMSO) en verdampen van het extract tot 500 pl. </li><li> Breng het extract om een ​​amberkleurige glazen autosampler flesje. Bewaar bij -20 ° C. </li></ol> 2. Bereid verdunningen van de Assay specifieke verwijzing Chemie en Water Extract <ol><li> Bereid 9 verdunningen voor de kalibratie curve. <ol><li> Voeg een voorraadoplossing van de assay specifieke referentiestof in 100% DMSO. De eindconcentratie moet 2 uM 17β-oestradiol voor de test ER en 100 pM dexamethason voor het GR assay. Bewaar de voorraad oplossingen bij -20 ° C. </li><li> Voeg 15 ul van de passende verwijzing chemische voorraad tot 285 pl assay medium in een steriele buis (buis # 1). Meng het monster door en neer te pipetteren. </li><li> Voeg 200 ul van een oplossing van 5% DMSO in testmedium in 8 extra buizen (buizen # 2-9). </li><li> Transfer 100 pi monster van de buis # 1 aan de buis # 2 tot en met bade # 9 een 3-voudige verdunningsreeks voeren. Elk verdund monster moet grondig gemengd worden met een pipet voor het nemen van een monster en toe te voegen aan de volgende buis. </li></ol></li><li> Bereid een oplosmiddel controlemonster door 10 gl DMSO in 190 pl assay-medium. </li><li> Bereid vier verdunningen voor elk water extract. <ol><li> In de eerste buis, voeg 5 ul van water extract in 95 ul assay medium en meng. Voeg 50 ul van 5% DMSO in testmedium in drie andere buizen. </li><li> Voer een 2-voudige verdunning van overdracht 50 pi oplossing van de ene buis naar de volgende. </li></ol></li></ol> 3. Bereid de Cell Suspension om de FRET Bioassay gedragscode <ol><li> Bereid de assay specifiek medium volgens de instructies van de fabrikant. Testmedium moet worden bewaard bij 4 ° C en opgewarmd tot 37 ° C in een waterbad vóór gebruik. </li><li> Neem een ​​flesje van ER of GR-divisie gearresteerd cellen uit de cryogene gratiszer en ontdooien van de cellen snel door het plaatsen van de flacon in een 37 ° C waterbad gedurende 2 minuten onder zacht schudden. Ontsmet de flacon met 70% ethanol en plaats deze in een Klasse II biologische veiligheidskabinet. </li><li> Open de flacon met behulp van aseptische technieken en breng de cellen in 10 ml testmedium. </li><li> Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min. </li><li> Zuig het supernatant met een steriele glazen pipet en resuspendeer de celpellet in 6 ml testmedium. </li><li> Meng 5 ul van celsuspensie met 5 ul van een vitale oplossing vlek en voeg een monster in een telkamer. </li><li> Tel het aantal levende cellen met behulp van een lichtmicroscoop of geautomatiseerde celgetalmeter en schat de dichtheid van levende cellen in de celsuspensie. Verdun zonodig tot een uiteindelijke dichtheid van 550.000 levende cellen per ml testmedium verkrijgen. </li></ol> 4. Plaat cellen in een 96-well Black Wall Clear-bodemplaat en toe Verwaterd Water Extract <ol><li> Maak een bordlay-out die een 9-punts assay specifieke kalibratie-curve, QA / QC monsters en meerdere verdunningen voor elk water extract bevat. Een voorbeeld van een 96-putjesplaat lay-out getoond in Figuur 1. </li><li> Voeg 90 ul testmedium het repliceren celvrije controleputjes. </li><li> Giet de celsuspensie in een steriel reservoir pipetteren en voeg 90 ul celsuspensie tot overige putjes met een multichannel pipet. </li><li> Voeg 10 ul van de verdunde monsters bereid in stap 2 de geschikte putjes. De eindconcentratie van DMSO per putje 0,5% mag maximum. </li><li> Bedek de plaat met een deksel en plaats deze in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 16 uur. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54725/54725fig1.jpg" /> Figuur 1:. Voorbeeld van een 96-well plaat Layout De multi-well plaat is ontworpen om een specifieke assay ijklijn 3 typen zijnQA / QC controles (media alleen, cellen in schone medium en cellen in DMSO spiked gemiddeld) en 4 verdunningen per water extract. Elke controle en verdunning van water extract wordt geanalyseerd in drievoud putten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54725/54725fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 5. Bereid de laden Solution en toevoegen aan elk putje <ol><li> Na incubatie kan de plaat equilibreren tot kamertemperatuur. Hiervoor FRET bioassay stap 5,2 tot 5,6 moet bij afwezigheid van direct licht worden uitgevoerd. </li><li> Bereid een 6x loading oplossing volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Voeg 20 ul van de 6x beladingsoplossing aan elk putje. </li><li> Voeg 10 ul van cellevensvatbaarheid reagens aan elk putje om de cytotoxiciteit van het verdunde extract water evalueren. </li><li> Seal de plaat met aluminium zelfklevende folie. </li><li> Incubeer de plaat in het donker bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. </li></ol> 6. Meet cytotoxiciteit en Endocriene Activity Response <ol><li> Stel de microplaat lezer bottom-leesmogelijkheid de instructies van de fabrikant. </li><li> Voor de FRET transactivatie bioassay, meten fluorescentie in de blauwe (409/460 nm, excitatie (Ex) / emissie (Em) golflengte) en groen (409 Ex / 530 Em nm) kanalen. </li><li> Voor de cytotoxiciteit assay, meten fluorescentie bij 560 Ex / 590 Em nm. </li></ol> 7. Beoordelen van QA / QC Controles aan de kwaliteit van de gegevens bepalen <ol><li> Vergelijk de gemiddelde fluorescentie van de ruwe celvrije (media) en cellen alleen (cellen in schone testmedium) controles. De media-enige achtergrondfluorescentie ten minste 25% lager dan de respons van de cellen alleen controle. </li><li> Verwerk de ruwe data FRET. Zowel &#39;blue&#39; en groene datasets, trek de gemiddelde fluorescentie van de celvrije controleputjes van alle GSM putje met. Bereken deblauw / groen-verhouding voor elke experimentele ook. </li><li> Vergelijk blauw / groen-verhouding van cellen-only en cellen met DMSO controles. Fluorescentie waarden van deze controles moeten binnen de 15% relatieve standaardafwijking (RSD). </li><li> Plot de test specifieke kalibratiekromme blauw / groen-verhouding tegen het monster concentratie uitgedrukt als een log molecuulmassa (log M). Bereken de helling, R2 en log EC 50 (50% Effect Concentration). Kalibratieparameters dient binnen het verwachte bereik in Tabel 1 vermeld. </li><li> Bereken de RSD voor drievoudige putjes. De variabiliteit onder replicaatbepalingen minder dan 20% bedragen. </li><li> Voor de cytotoxiciteit data (Ex 560/590 nm Em), trek de celvrije control gemiddelde (dwz media achtergrond) Uit celbevattende putjes. </li><li> Bereken de gemiddelde achtergrond fluorescentie afgetrokken voor elk monster. Zet de resulterende fluorescentie data als percentage van de DMSO-controle. Monster verdunningen mag nietvertonen meer dan 20% celsterfte in vergelijking met de cellen alleen DMSO en controles. </li></ol> 8. Analyses van gegevens <ol><li> Bereken de test limiet van de Opsporing (LOD) als het minimum kalibratierespons plus twee standaarddeviaties van het gemiddelde van die reactie. </li><li> Voor monsters met een dosisrespons, leiden de EC 50 &#160; van het water extract over de helling van een lineaire regressie van de kalibratiecurve tussen 10 en 50% effect concentraties van de referentiestof. </li><li> Bereken de Bioanalytical equivalenten (BEQ) volgens de formule: BEQ = EC 50 referentiekader chemische / EG 50 van watermonster. </li></ol>

<ol><li>Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ToxCast+program+for+prioritizing+toxicity+testing+of+environmental+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals.</a> Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).</li>
<li>Reif, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+profiling+and+prioritization+of+environmental+chemicals+using+ToxCast+data%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Endocrine profiling and prioritization of environmental chemicals using ToxCast data.</a> Environ. Health Perspect. 118 (12), 1714-1720 (2010).</li>
<li>Maruya, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tiered%2C+integrated+biological+and+chemical+monitoring+framework+for+contaminants+of+emerging+concern+%28CECs%29+in+aquatic+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Environ.+Assess.+Manag%22%5BJournal%5D)">A tiered, integrated biological and chemical monitoring framework for contaminants of emerging concern (CECs) in aquatic ecosystems.</a> Integr. Environ. Assess. Manag. , (2015).</li>
<li>Van der Linden, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+multiple+hormonal+activities+in+wastewater+effluents%2C+surface+water%2C+using+a+panel+of+steroid+receptor+CALUX+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents, surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays.</a> Environ. Sci. Technol. 42 (15), 5814-5820 (2008).</li>
<li>Leusch, F. D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+in+vitro+bioassays+to+measure+estrogenic+activity+in+environmental+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters.</a> Environ. Sci. Technol. 44 (10), 3853-3860 (2010).</li>
<li>Jarosova, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Europe-wide+survey+of+estrogenicity+in+wastewater+treatment+plant+effluents%3A+the+need+for+effect-based+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Pollut.+Res%22%5BJournal%5D)">Europe-wide survey of estrogenicity in wastewater treatment plant effluents: the need for effect-based monitoring.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (18), 10970-10982 (2014).</li>
<li>Sonneveld, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+in+vitro+and+in+vivo+screening+models+for+androgenic+and+estrogenic+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities.</a> Toxicol. Sci. 89 (1), 173-187 (2006).</li>
<li>Piersma, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+alternative+in+vitro+test+battery+for+detecting+reproductive+toxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants.</a> Reprod. Toxicol. 38, 53-64 (2013).</li>
<li>Escher, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+organic+micropollutants+in+wastewater%2C+recycled+water+and+drinking+water+with+in+vitro+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Benchmarking organic micropollutants in wastewater, recycled water and drinking water with in vitro bioassays.</a> Environ. Sci. Technol. 48 (3), 1940-1956 (2014).</li>
<li>U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) Endocrine Disruptor Screening Program. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Prioritization+of+the+endocrine+disruptor+screening+program+universe+of+chemicals+for+an+estrogen+receptor+adverse+outcome+pathway+using+computational+toxicology+tools%22">Prioritization of the endocrine disruptor screening program universe of chemicals for an estrogen receptor adverse outcome pathway using computational toxicology tools</a>. , OCSPP/OW/ORD/NCCT. (2012).</li>
<li>Leusch, F. D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+wastewater+and+recycled+water+quality%3A+a+comparison+of+lines+of+evidence+from+in+vitro%2C+in+vivo+and+chemical+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Assessment of wastewater and recycled water quality: a comparison of lines of evidence from in vitro, in vivo and chemical analyses.</a> Water Res. 50, 420-431 (2014).</li>
<li>Jia, A., Wu, S., Daniels, K. D., Snyder, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+budget%3A+accounting+for+glucocorticoid+bioactivity+and+fate+during+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Balancing the budget: accounting for glucocorticoid bioactivity and fate during water treatment.</a> Environ. Sci. Technol. 50 (6), 2870-2880 (2016).</li>
<li>Huang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genomics+profiling+of+environmental+chemical+modulation+of+human+nuclear+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Chemical genomics profiling of environmental chemical modulation of human nuclear receptors.</a> Environ. Health Perspect. 119 (8), 1142-1148 (2011).</li>
<li>Mehinto, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlaboratory+comparison+of+in+vitro+bioassays+for+screening+of+endocrine+active+chemicals+in+recycled+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Interlaboratory comparison of in vitro bioassays for screening of endocrine active chemicals in recycled water.</a> Water Res. 83, 303-309 (2015).</li>
<li>Ternes, T. A., Joss, A., Siegrist, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrutinizing+pharmaceuticals+and+personal+care+products+in+wastewater+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment.</a> Environ. Sci. Technol. 38 (20), 392A-399A (2004).</li>
<li>Tang, J. Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+characterization+of+urban+stormwater+with+bioanalytical+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Toxicity characterization of urban stormwater with bioanalytical tools.</a> Water Res. 47, 5594-5606 (2013).</li>
<li>Scott, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+endocrine+activity+in+Australian+rivers+using+chemical+and+in+vitro+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Pollut.+Res%22%5BJournal%5D)">An assessment of endocrine activity in Australian rivers using chemical and in vitro analyses.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (22), 12951-12967 (2014).</li>
<li>Vidal-Dorsch, D. E., Bay, S. M., Maruya, K., Snyder, S. A., Trenholm, R. A., Vanderford, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contaminants+of+emerging+concern+in+municipal+wastewater+effluents+and+marine+receiving+water%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Contaminants of emerging concern in municipal wastewater effluents and marine receiving water.</a> Environ. Toxicol. Chem. 31 (12), 2674-2682 (2012).</li>
<li>WateReuse Research Foundation (WRRF). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Direct+potable+reuse%3A+a+path+forward%22">Direct potable reuse: a path forward</a>. , WRRF. Alexandria, VA. (2011).</li>
<li>Leusch, F. D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+application+of+bioanalytical+tools+as+surrogate+measure+of+chemical+contaminants+in+recycled+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water.</a> Water Res. 49, 300-315 (2014).</li>
<li>Schriks, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+glucocorticoid+activity+in+various+surface+waters+in+the+Netherlands%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Occurrence of glucocorticoid activity in various surface waters in the Netherlands.</a> Chemosphere. 93 (2), 450-454 (2013).</li>
<li>Suzuki, G., Sato, K., Isobe, T., Takigami, H., Brouwer, A., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+glucocorticoid+receptor+agonist+in+effluents+from+sewage+treatment+plants+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Tot.+Environ%22%5BJournal%5D)">Detection of glucocorticoid receptor agonist in effluents from sewage treatment plants in Japan.</a> Sci. Tot. Environ. 527-528, 328-334 (2015).</li>
<li>Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Byea, V. V. J., Enoa, N. C., Tyler, C. R., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+effects+of+effluents+from+sewage+treatment+works%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works.</a> Chemistry and Ecology. 8 (4), 275-285 (1994).</li>
<li>Kidd, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapse+of+a+fish+population+after+exposure+to+a+synthetic+estrogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (21), 8897-8901 (2007).</li>
<li>Kojima, H., Katsura, E., Takeuchi, S., Niiyama, K., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+estrogen+and+androgen+receptor+activities+in+200+pesticides+by+in+vitro+reporter+gene+assays+using+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Screening of estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells.</a> Environ. Health Perspect. 112 (5), 524-531 (2004).</li>
<li>Kugathas, S., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+glucocorticoids+in+the+environment%3A+First+results+on+their+potential+impacts+on+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Synthetic glucocorticoids in the environment: First results on their potential impacts on fish.</a> Environ. Sci. Technol. 45, 2377-2383 (2011).</li>
<li>Van der Linden, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+panel+of+high-throughput+reporter-gene+assays+to+detect+genotoxicity+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.+Genet.+Toxicol.+Environ.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Development of a panel of high-throughput reporter-gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress.</a> Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 760, 23-32 (2014).</li>
<li>Cwiertny, D. M., Snyder, S. A., Schlenk, D., Kolodziej, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+designer+drugs%3A+when+transformation+may+not+eliminate+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Environmental designer drugs: when transformation may not eliminate risk.</a> Environ. Sci. Technol. 48, 11737-11745 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De goed gedocumenteerde potentie van oestrogenen uit de omgeving, zoals de 17β-estradiol (E2), warrants screening voor deze chemicaliën in ng / l concentraties 23,24. In deze studie, de ER respons voor afvalwater afvalwater (BEQ range: 2,3-17 ng E2 / L) was iets hoger dan gerapporteerd voor secundair afvalwater van Australische RWZI&#39;s 20, terwijl de BEQ voor oppervlaktewater (&lt;0,5 tot 4 ng E2 / L ) waren binnen de gerapporteerde voor oppervlakte- en regenwater elders (&lt;1 tot 11 ng E2 / L)...

De huidige monitoring van de waterkwaliteit is gebaseerd op het vermogen om nauwkeurig en precies meten van de aanwezigheid van chemische contaminanten als een proxy voor de blootstelling aan wilde dieren en de mens. Dit kan echter chemisch-by-chemische monitoring en evaluatie paradigma geen gelijke tred met de steeds veranderende chemische universum dat we onder ogen zien. Als we meer over het lot en de gevolgen van synthetische en natuurlijke chemicaliën te leren, blijven we zoeken naar meetinstrumenten die pakken verwachte biologische effecten, en dat op hetzelfde moment immuun zijn voor veranderingen in de chemische productie, het gebruik en omgevingsfactoren ingang. Dergelijke hulpmiddelen zijn vooral van belang voor het begrijpen of onbekende of nieuwe chemische stoffen en omzettingsproducten, verdienen onze aandacht. Bovendien zijn complexe mengsels van chemicaliën aanwezig in het water slecht aangepakt door individuele chemische monitoring. Zo staan ​​we voor de uitdaging van de modernisering van de bestaande controle toolbox om beter aan te pakken deze problemen in het oppervlaktewater that ontvangen lozing van gezuiverd afvalwater effluent en stedelijke / regenwaterreproductie. In de afgelopen jaren zijn bio-analytische technieken aangetoond belofte als screening instrumenten voor de beoordeling van de waterkwaliteit. In het bijzonder, in&#39;vitro bioassays die reageren op chemische stoffen die werken via bekende, specifieke werkingsmechanismen 1,2 zijn van groot belang voor het toezicht op het milieu gemeenschap 3. Talloze onderzoeken hebben gebruikt in vitro bioassays om de hormonale activiteit van het drinken, oppervlakte- en afvalwater 4 -6 kwantificeren. Bovendien is een aantal bioassays doelmolecuulgewicht initiërende gebeurtenissen (bijvoorbeeld receptor activering) die mogelijk kunnen dienen schadelijke effecten via negatieve uitkomst pad analyses 7,8. De evolutie van bioscreening voor de beoordeling van de waterkwaliteit is relatief snel geweest, met honderden verschillende in vitro bioassay eindpunten zijn geëvalueerd op hunhulpprogramma 9,10. Op dit moment zijn er slechts een handvol van de bioassays is aangetoond dat ze goede meetnauwkeurigheid (binnen laboratoria) te bereiken, terwijl het aantonen van de mogelijkheid om onderscheid te maken tussen water kwaliteiten 5,6. Voor gezuiverd afvalwater effluent in het bijzonder, heeft het optreden van oestrogenen en glucocorticoïden steroïden met succes verantwoord op basis van in-vitro-transactivatie assays 11,12. De meeste studies tot op heden toegepaste bioassays waarvan cellijnen proprietary (en dus niet overal beschikbaar), vereisen voortdurende zorg en manipulatie, of beide. Als gevolg daarvan, de mogelijkheid om protocollen te standaardiseren, het uitvoeren van inter-laboratorium kalibratie oefeningen, en uiteindelijk tot deze screening technologie over te dragen aan de waterreserves gemeenschap blijft gehinderd. Ten minste één leverancier van biologische in vitro testen doorgelicht door het Amerikaanse ToxCast programma is in de handel verkrijgbaar 13 in gemakkelijk te bevriezen en ontdooien gebruiken &quot;4; formats. Deze cel-deling gearresteerd &quot;kits&quot; bleken robuust meten van de activiteit van chemische stoffen onttrokken water die verschillende niveaus van de behandeling 14 te zijn. Hoewel verkoper protocollen zijn beschikbaar om de bioactiviteit van afzonderlijke chemische stoffen of mengsels screenen, sommige moeten worden gewijzigd alvorens ze kunnen worden toegepast watermonsters. Gezuiverd afvalwater effluent 15, regenwaterreproductie 16, de ontvangende wateren 17,18 en meer recentelijk gerecycleerd water 19,20 zijn goede voorbeelden van waterige media, die van belang zijn voor de kwaliteit van het water gemeenschap. Deze studie geeft een enkele, gestandaardiseerd protocol om de hormonale activiteit in watermonsters te meten met behulp van in de handel verkrijgbare,-divisie gearresteerd in vitro transactivatie bioassays. We hebben aangetoond robuustheid van het protocol door middel van een uitgebreide beoordeling van de achtergrond, de dosis responsiviteit en herhaalbaarheid van respons voor two eindpunten van bijzonder belang Estrogen and Glucocorticoid Receptor transactivatie (ER en GR, respectievelijk). Het protocol werd toegepast op het scherm monsters van gezuiverd afvalwater afvalwater en oppervlaktewater van zoetwatersystemen in Californië.

<table><tbody><tr><td>GeneBLAzer ER alpha DA assay kit</td><td>ThermoFisher</td><td>K1393</td><td>Kit bevat ER division arrested (DA) cellen en LiveBLAzer FRET loading kit.</td></tr><tr><td>GeneBLAzer GR DA assay kit</td><td>ThermoFisher</td><td>K1391</td><td>Kit bevat GR division arrested (DA) cellen en LiveBLAzer FRET loading kit.</td></tr><tr><td>PrestoBlue cell viability reagent&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0,4% in PBS</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T8154</td><td>Ook verkrijgbaar bij ThermoFisher</td></tr><tr><td>Corning 96-well zwarte wand, helder bodemplaat</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Afzonderlijk verpakt, steriele met deksel</td></tr><tr><td>Whatman glasvezelfilters, GF/A, 1,6 &micro;M</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>WHA1820025</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium verzegelingsfolie voor microplaat</td><td>E&amp;K Scientific</td><td>T592100</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent</td><td>Waters</td><td>WAT106202</td><td></td></tr><tr><td>17&beta; Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>E2758</td><td>CAS #50-28-2</td></tr><tr><td>Ascorbinezuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>A61-100</td><td>Ook verkrijgbaar bij Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Dexamethason&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D4902</td><td>CAS #50-02-2</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D8418</td><td>Moleculaire graad</td></tr><tr><td>Oplosmiddelen (aceton, hexaan, methanol)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>HPLC-kwaliteit</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S2002</td><td>Chemisch is zeer giftig en moet met zorg worden gehanteerd. Gebruik beschermende kleding en weeg onder een afzuigkap. Ook verkrijgbaar bij EMD Millipore.</td></tr><tr><td>Automatische celteller of hemocytometer</td><td>Verschillende*</td><td></td><td>Leveranciers omvatten Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich en ThermoFisher.</td></tr><tr><td>Biologische veiligheidskast klasse II</td><td>Verschillende*</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Verschillende*</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryogene vriezer&nbsp;</td><td>Verschillende*</td><td></td><td>Vloeibare stikstofopslag is aanbevolen.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluorescentie microplaatlezer</td><td>Verschillende*</td><td></td><td>&nbsp;De lezer moet de mogelijkheid hebben om vanaf de bodem te lezen.</td></tr><tr><td>* Geen aanbevolen bron, de keuze van deze apparatuur hangt af van budget, gebruiksfrequentie en laboratoriumruimte.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

screening op hormonale activiteit in water met behulp van de handel verkrijgbare<em&gt; in vitro</em&gt; transactivering bioassays

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

In vitro transactivatie bioassays hebben aangetoond belofte als de waterkwaliteit controle-instrumenten, maar hun goedkeuring en de wijdverbreide toepassing is gedeeltelijk gehinderd door een gebrek aan gestandaardiseerde methoden en de beschikbaarheid van robuuste, gebruiksvriendelijke technologie. In deze studie werden commercieel beschikbare-divisie gearresteerd cellijnen toegepast om kwantitatief screenen op hormonale activiteit van chemicaliën aanwezig in watermonsters interesse milieukwaliteit professionals. Een enkele, gestandaardiseerd protocol dat uitgebreide kwaliteitsborging / kwaliteitscontrole inbegrepen (QA / QC) controles is ontwikkeld voor Oestrogeen en glucocorticoïde receptor-activiteit (ER en GR, respectievelijk) met behulp van een cel-gebaseerde Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) assay. Monsters van de behandelde afvalwater effluent en oppervlaktewater van zoetwatersystemen in Californië (USA), werden geëxtraheerd met behulp van vaste fase extractie en geanalyseerd op hormonale activiteit met de gestandaardiseerde protocol. Achtergrond en de dosis-respons voor endpoint-specifieke verwijzing chemicaliën voldaan QA / QC-richtlijnen voor een betrouwbare meting noodzakelijk wordt geacht. De biologische screening respons voor oppervlaktewater monsters was grotendeels niet aantoonbaar. In tegenstelling effluent monsters van secundaire zuiveringsinstallaties had de hoogste meetbare activiteit, met een geschatte bioassay equivalente concentraties (BEQ) tot 392 ng dexamethason / l voor GR en 17 ng 17β-estradiol / L ER. De biologische respons voor een tertiaire effluent steekproef was lager dan die gemeten voor het secundair afvalwater, wat wijst op een lagere residu van endocriene actieve stoffen na geavanceerde behandeling. Dit protocol is gebleken dat in vitro bioassays transactivatie die commercieel verkrijgbaar benutten-divisie gearresteerd cell &quot;kits&quot;, kan worden aangepast om te screenen op endocriene werking in water.

In de huidige studie werden 4x 24 uur samengestelde monsters van gezuiverd huishoudelijk afvalwater effluent, 6 pak monsters van oppervlaktewater uit zoetwatersystemen in het zuiden van Californië en een veld leeg, bestaande uit ultrapuur water geselecteerd om dit protocol te illustreren. 3 van de 4 effluent monsters waren afkomstig van conventionele actief slib afvalwaterzuiveringsinstallaties ( &quot;secundaire effluent&quot;), en de vierde uit een geavanceerde waterzuiveringsinstallat...

Een protocol om te screenen op endocriene activiteit in organische extracten van watermonsters, inclusief behandelde afvalwaterafvoer en oppervlakte (ontvangende) water, werd aangepast met behulp van commercieel verkrijgbare divisie-geremde ("freeze and thaw") in vitro transactivatie bioassays.

Screening op hormonale activiteit in water met behulp van de handel verkrijgbare<em&gt; In Vitro</em&gt; Transactivering Bioassays

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

Het algemene doel van deze gestandaardiseerde procedure is om watermonsters te screenen op endocrien actieve chemicaliën, met behulp van commercieel beschikbare, receptorgebaseerde celassays. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van waterkwaliteitsmonitoring, zoals: zijn er daadwerkelijk endocrien actieve chemicaliën aanwezig in het monster? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er veel sneller dan met de huidige chemische methoden kan worden geanalyseerd op een groep endocrien actieve verbindingen.Deze techniek kan helpen bij het diagnosticeren van problemen met de waterkwaliteit die voortvloeien uit de aanwezigheid van hormoonverstorende chemicaliën. Deze methode biedt inzicht in verontreinigingen in water, maar kan ook worden toegepast op andere milieumatrices, zoals sediment en weefsels. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze techniek moeite hebben, omdat er een hoge precisie vereist is bij het gebruik van pipettechnieken.Om deze procedure te starten, bereidt u het watermonster voor in voorraadoplossingen van het assay-specifieke medium en de referentiechemicaliën, zoals gedetailleerd in het tekstprotocol. Bewa

screening-for-endocrine-activity-water-using-commercially-available

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

In dit artikel worden zebravisembryo's gebruikt voor het screenen van chemische toxiciteit. Chemische toxiciteit is gecorreleerd met fenotype-uitlezingen. Het monsterprotocol toont een methodologische benadering van het uitvoeren van de chemische toxiciteitsscreening.

Embryo-gebaseerd chemisch toxiciteitsscherm: effecten op de ontwikkeling van zebravisembryo's beoordelen

This video describes a cell-based reporter assay to determine the estrogenic activity of plant-derived compounds. A compound with estrogen-like activity mimics its binding to estrogen receptors and drives downstream reporter enzyme gene transcription. The reporter enzyme generates bioluminescence in a reaction, indicating the estrogenic activity of the compound.

Estrogen Receptor-Reporter Activity Assay to Screen Phytoestrogen Estrogenic Activity

Een protocol voor de extractie en pre-concentratie van oestradiol uit watermonsters door gebruik te maken van een geautomatiseerd en geminiaturiseerd systeem wordt gepresenteerd.

Een eenvoudige methode voor Automated Solid Phase Extraction van watermonsters voor immunologische Analyse van Kleine verontreinigende stoffen

Dit manuscript beschrijft hoe je vloeistofbionchips bereidt met epitheelcellen van de kieuwen van regenbooforen voor gebruik in een draagbare elektrische cel-substraat impedantiesensor in het veld. Het protocol voor het uitvoeren van een snelle drinkwatertoxiciteitstest met de sensor wordt ook beschreven.

Opstellen en testen van impedantie-gebaseerde Fluidic biochips met RTgill-W1 Cellen voor snelle evaluatie van Drinkwater Monsters voor de toxiciteit

Hormoonverstorende stoffen (EDC) vormen een aanzienlijk risico voor het aquatisch milieu. Gemeentelijke afvalwaterzuiveringsinstallaties zijn belangrijke bijdragen aan de oestrogene potentie van oppervlaktewater. De methodologie in dit document maakt een evaluatie van de doeltreffendheid en de geschiktheid van afvalwaterzuiveringsprocessen opzichte van EDC verwijderd.

Gebruik van een batterij van chemische en ecotoxicologische methoden voor de beoordeling van de werkzaamheid van Afvalwaterbehandeling processen te verwijderen Estrogenic Potentie

Dit artikel presenteert een geoptimaliseerde gist oestrogeen scherm voor het kwantificeren van liganden in producten voor persoonlijke verzorging (PCP) die oestrogeen receptoren alpha (ERα) en/of bèta (ERβ binden). De methode omvat twee opties van de colorimetrische substraat, een zes-daagse gekoelde incubatie voor gebruik in undergraduate cursussen, en statistische hulpmiddelen voor gegevensanalyse.

Opsporen van oestrogene liganden in verzorgingsproducten met behulp van een gist oestrogeen scherm geoptimaliseerd voor het Undergraduate Onderwijs laboratorium

Zebravis embryo's worden gebruikt voor het evalueren van de toxiciteit van chemische verbindingen. Ze ontwikkelen zich extern en zijn gevoelig voor chemicaliën, waardoor subtiele fenotypische veranderingen kunnen worden opgespoord. Het experiment vereist slechts een kleine hoeveelheid stof, die direct wordt toegevoegd aan de plaat die embryo's bevat, waardoor het testsysteem efficiënt en kosteneffectief is.

Snelle evaluatie van de toxiciteit van chemische verbindingen met behulp van zebravis embryo's

De kwantitatieve structuur-Activiteitsrelatie (QSAR) modellering is een representatieve bioinformatica-geassisteerde methode in de toxicologische screening. Dit protocol laat zien hoe de Risico's van hormoonontregelende stoffen (EDs) in aquatische omgevingen op een computationeel wijze kunnen worden beoordeeld. Door gebruik te maken van de OESO QSAR toolbox implementeert het protocol een in silico-test voor het analyseren van de toxiciteit van hormoonontregelende stoffen in vissen.

In silico Modeling method voor computationele aquatische toxicologie van hormoonontregelende stoffen: een op software gebaseerde aanpak met QSAR toolbox

Aanwezig is een gedetailleerd protocol voor het gebruik van zebravis embryo's Tg (vtg1: mCherry) voor de detectie van oestrogene effecten. Het protocol heeft betrekking op de voortplanting van de vis en de behandeling van embryo's, en benadrukt de detectie, documentatie en de evaluatie van fluorescerende signalen veroorzaakt door hormoonontregelende verbindingen (EDC).

Met behulp van Tg (Vtg1:mcherry) Zebrafish Embryo's om de oestrogene effecten van endocriene verstorende verbindingen te testen

We hebben geoptimaliseerd een commercieel beschikbare oestrogeen receptor β reporter test voor het screenen van menselijk en niet-menselijk primaat voedsel voor oestrogene activiteit. We valideerden deze test door aan te tonen dat de bekende oestrogene soja voor menselijke voeding hoog registreert, terwijl andere voedingsmiddelen geen activiteit vertonen.

Screening op fyto-oestrogenen met behulp van een celgebaseerde oestrogeenreceptor β Reporter Assay

Het muismodel Thyroid Hormone Action Indicator is ontwikkeld om weefselspecifieke kwantificering van de lokale werking van schildklierhormoon mogelijk te maken met behulp van de endogene regulerende machinerie. Onlangs is aangetoond dat het model geschikt is voor het karakteriseren van hormoonverstorende chemicaliën die interageren met de schildklierhormooneconomie, zowel door ex vivo als in vivo methodologieën.

In vivo karakterisering van hormoonverstorende chemische effecten via schildklierhormoon actie-indicator muis

Leer een gestandaardiseerde methode voor het screenen van watermonsters op endocrien actieve chemicaliën met behulp van receptor-gebaseerde celassays. Deze techniek biedt snellere analyse dan traditionele methoden en verbetert de monitoring van waterkwaliteit.

Screening op hormonale activiteit in water met behulp van de handel verkrijgbare

Meer video's verkennen