A Simple Fluorescence Assay voor het kwantificeren van Canine neutrofielen extracellulaire inklembeveiliging

Het algemene doel van dit experiment is om rustende neutrofielen te isoleren en hun DNA-vrijgave te meten als reactie op agonisten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de immunologie en veterinaire geneeskunde, zoals: wat is de respons van neutrofielen op verschillende agonisten van de inductie van neutrofiele extracellulaire trappen of celdood? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de snelle screening van diverse agonisten en inhibitoren van de vorming van neutrofiele extracellulaire trappen mogelijk maakt.

Begin met het inbrengen van een 21-gauge vlindernaald in de vena cephalica van een gezonde hondengedoneerde, bevestig vervolgens een spuit van 3 mL en neem drie bloedmonsters van 3 mL, waarbij de monsters onmiddellijk worden overgebracht naar open bloedbuisjes die EDTA bevatten.

Breng het bloed samen in een conische buis van 50 milliliter. Meng de monsters met een gelijk volume steriel 3% Dextran 500 op kamertemperatuur door voorzichtig te keren en laat de buis 18 tot 20 minuten rechtop staan bij kamertemperatuur. Draag vervolgens de strogele bovenlaag over naar een nieuwe buis totdat deze niet langer kan worden verzameld zonder contaminatie door de onderste rode laag.

Centrifugeer de bovenste laag. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet handmatig in 10 milliliters steriele PBS op kamertemperatuur. Voeg vervolgens 10 milliliters van een celseparatie-oplossing van polysucrose in natriumdiatrizoaat op kamertemperatuur toe aan een conische buis van 50 milliliters.

Laag de cellen voorzichtig op de scheidingsoplossing. Scheid de cellen door middel van centrifugatie. Verwijder de bovenste drie lagen bestaande uit plasma, mononucleaire cellen van bloedplaatjes en de dichtheidsgradiënt.

Lyseer eventuele resterende erytrocyten met 10 milliliters water op kamertemperatuur. Voeg na 30 seconden 10 milliliters steriel 1,8% natriumchloride op kamertemperatuur toe om de toniciteit te herstellen. Meng de cellen door voorzichtig om te keren.

Verzamel nu de cellen door middel van centrifugatie. Resuspendeer het witte pellet voorzichtig in 10 milliliters steriele PBS. Centrifugeer de cellen na het tellen opnieuw en resuspendeer het pellet tot een concentratie van vijf keer 10 tot de zesde cellen per milliliter in steriele PBS op kamertemperatuur.

Indien van toepassing, laat een klein volume cellen aan de lucht drogen op een glazen objectglas, gevolgd door kleuring met een kit voor snelle fixatie en kleuring volgens de instructies van de fabrikant. Indien de isolatie van neutrofielen succesvol is verlopen, moet ten minste 95% van de gekernde cellen granulocyten zijn met minimale besmetting door erytrocyten, zoals waargenomen onder een lichtmicroscoop. Passeer direct na de isolatie van neutrofielen de celсусpensie door een steriel 70-micron steriel filter en voeg 5 × 10⁴ cellen toe aan de testputjes van een 96-wells plaat met cultuurmedium voor een incubatie van 30 minuten bij 39 °C en 4% CO2.

Wanneer de cellen zijn gehecht, voegt u tot een eindvolume van 100-200 microliters van de gewenste agonist in RPMI zonder fenolrood en aangevuld met hitte-inactiverd FCS toe aan de testputjes, evenals aan twee blanco putjes die alleen PBS bevatten. Voeg vervolgens een geschikte celondoordringbare nucleïnezuurkleurstof toe aan de cellen en plaats de plaat terug in de incubator. Meet na de juiste incubatieperiode de fluorescentie met een microplate-reader.

Een stimulatie van één uur van canine neutrofielen met plaatjesactiverend factor resulteert in een gemiddelde verviervoudiging van de fluorescentie vergeleken met niet-gestimuleerde controlecellen. PMA is echter een langzamere agonist die geen toename in neutrofielenfluorescentie vertoont vóór twee uur activatie, maar die uiteindelijk over tijd een soortgelijke toename produceert. Fluorescentie van nucleïnezuurkleurstof is niet specifiek voor de vorming van neutrofiele extracellulaire traps, aangezien deze ook optreedt bij celdood door andere mechanismen of wanneer de reagentia besmet zijn met DNA.

In dit representatieve experiment produceerde bijvoorbeeld een commerciële LPS-preparaat een zeer hoge fluorescentie in de afwezigheid van neutrofielen, vermoedelijk als gevolg van contaminatie met bacterieel DNA. Zodra men de methode beheerst, kan deze techniek in ongeveer zes uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de neutrofielen voorzichtig behandeld moeten worden.

Vortex de cellen niet en pipetteer de supernatanten af in plaats van deze af te gieten. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals immunofluorescentiemicroscopie, worden uitgevoerd om te bevestigen dat het vrijgekomen DNA correleert met NETosis. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de hematologie om de interactie van vrijgekomen DNA met coagulatie en het effect van nieuwe NET-agonisten, waaronder patiëntenplasma, te onderzoeken.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u canine neutrofielen kunt isoleren en hun respons op agonisten kunt meten.