Eenvoudige en efficiënte productie en zuivering van de Muis myeline oligodendrocyt-glycoproteïne voor experimentele auto-immune Encephalomyelitis Studies

Het algemene doel van dit protocol is om eiwit te genereren op basis van de extracellulaire domein van myeline-oligodendrocyten glycoproteïne of MOG, die kan worden gebruikt om experimentele auto-immuune encefalomyelitis of EAE te induceren. Dit protocol maakt het mogelijk voor elk lab om MOG-eiwit te maken om te gebruiken als een antigeen om EAE te induceren. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het niet afhankelijk is van gespecialiseerde apparatuur voor eiwitverwerking, maar dat u in plaats daarvan standaardapparatuur kunt gebruiken die in bijna elk immunologisch lab te vinden is.

Nou, dit protocol werd geoptimaliseerd voor MOG-tag-eiwit op basis van de muizenversie, het zou moeten werken voor andere MOG-eiwitexpressiesystemen die een hestate voor zuivering bevatten. Inoculeer vijf milliliter gesteriliseerde bouillon met de BL 21 MOG-tag glycerol stock en incubeer deze een nacht bij 37 graden Celsius en 200 RPM. Voeg 500 microliter van 100 milligram per milliliter ampicilline toe aan elk van de 500 milliliter kolven met 500 milliliter steriele LB. Breng een milliliter van de overnachtelijke cultuur over naar elk van de twee kolven met LB-bouillon.

Incubeer bij 37 graden Celsius en 200 RPM gedurende vijf uur of tot een optische dichtheid van 0,6. Zodra de gewenste celdichtheid is bereikt, voegt u 0,5 milliliter van één molaire IPTG toe aan elke kweekkolf. Incubeer de kolf, stel 37 graden Celsius en 200 RPM in gedurende vier uur en vervolgens bij kamertemperatuur en 75 RPM gedurende de nacht.

Verdeel de culturen gelijkmatig over 250 milliliter flessen die compatibel zijn met hogesnelheidscentrifugering en houd de flessen vanaf nu op ijs. Pellet de bacteriecellen bij 22.000 keer g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Resuspendeer en combineer alle bacteriële pellets in een totaal van 30 milliliter lysatebuffer.

Breng dit volume over naar een 50 milliliter buisje dat geschikt is voor hogesnelheidscentrifugering. Plaats deze buis in een waterbad van 30 graden Celsius gedurende 30 minuten. Gedurende de incubatietijd schudt u de buis twee keer om de cellen te resuspenderen.

Na de incubatie, transporteert u de buis op ijs en soniceert u de oplossing op 20 kilohertz en amplitude 70%pulsing aan voor drie seconden en uit voor drie seconden gedurende vijf pulsen, soniceert u de oplossing gedurende in totaal zes rondes van vijf pulsen, waarbij u de oplossing laat afkoelen op ijs tussen de rondes. Centrifugeer vervolgens de oplossing bij 24.000 keer g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius, resuspendeer vervolgens het pellet in 30 milliliter buffer A en incubeer de oplossing bij vier graden Celsius gedurende drie uur. Na incubatie, soniceert u de oplossing op ijs zoals eerder, voeg vervolgens 17,2 gram guanidine HCl toe aan de oplossing.

Incubeer de monster op ijs gedurende één uur om het MOG-tag-eiwit op te lossen. Om de nikkelhars op te laden en te gelijkmaken, wast u eerst de hars door 40 milliliter water toe te voegen aan elke buis met hars. Leg de buizen horizontaal op een rocker en laat ze gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius agiteren.

Eenmaal klaar, centrifugeer de buizen bij 4500 keer g gedurende acht minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg door te pipetteren om de pellet niet te verstoren. Voeg vervolgens 40 milliliter laadbuffer toe aan elke buis.

Breng de buizen over op een rocker en laat ze gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius agiteren voordat u ze opnieuw centrifugeert zoals eerder. Gooi het supernatant weg en voeg 40 milliliter buffer B toe aan de buizen. Breng de buizen over op een rocker en laat ze gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius agiteren voordat u de buizen met hars nogmaals centrifugeert.

Om het MOG-tag-eiwit te zuiveren, brengt u het gehele volume opgeloste eiwit over naar de eerste buis met nikkelhars. Na het mengen, plaatst u de buis horizontaal op een rocker bij vier graden Celsius gedurende één uur. Na het centrifugeren van de buis bij 4500 keer g gedurende acht minuten bij vier graden Celsius, brengt u dit supernatant over naar de tweede buis met nikkelhars en incubeert u zoals eerder.

Ondertussen resuspendeert u het nikkelhars in de eerste buis in 40 milliliter evolutiebuffer en plaatst u de buis horizontaal op een rocker bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten voordat u opnieuw centrifugeert. Breng het supernatant dat het allude MOG-tag-eiwit bevat over in een 250 milliliter fles met gelabeld gezuiverd MOG-getagd eiwit. Bewaar deze fles bij vier graden Celsius.

Bij elke elutiestap, poolt u het resulterende supernatant in deze fles. Voeg 40 milliliter stripbuffer toe aan het nikkel dat aanwezig is in de eerste buis en plaats de buis horizontaal op een rocker gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Centrifugeer de buis, gooi het supernatant weg en herlaad het nikkelhars zoals eerder.

Eenmaal klaar, gaat u verder met de tweede buis zoals eerder met de eerste buis is gedaan. Een totaal van vier rondes van absorptie van het opgeloste eiwit op het opgeladen nikkelhars en elutie zullen het grootste deel van het eiwit herstellen. Snijd ongeveer 30 centimeter slangenhuid dialyseslang af.

Bevestig een uiteinde met een vergrendelde hemostase door het uiteinde van de slangenhuid drie keer over te vouwen en het gevouwen uiteinde met de hemostase vast te klemmen. Vul de slangenhuid met verdund MOG-tag-eiwit. Verwijder vervolgens eventuele luchtbellen uit de slangenhuid door ze uit het open uiteinde te forceren.

Versluit tenslotte het andere uiteinde van de buis met een tweede vergrendelde hemostase. Vul vervolgens een grote emmer met een liter een x acetaatbuffer met vier molair guanidine. Plaats tot twee secties dialyseslang met MOG-tag-eiwit in de emmer.

Bevestig met tape de hemostase aan de zijkant van de emmer om ruimte te laten voor een magnetische roerstaaf om ongehinderd in de bodem te draaien. Plaats de emmer in een ruimte van vier graden Celsius op een magnet