Name: Eenvoudige en efficiënte productie en zuivering van de Muis myeline oligodendrocyt-glycoproteïne voor experimentele auto-immune Encephalomyelitis Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Leer een eenvoudige methode voor productie en zuivering van muis MOG-eiwit voor experimentele auto-immuun encefalomyelitis studies. Dit protocol gebruikt standaard laboratoriumapparatuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ is de ontvanger van de Waugh Family MS Society of Canada doctoraalstudentenprijs.

<ol><li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Baxter, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+application+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).</li>
<li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+%28MOG35-55%29+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Shetty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodominant+T-cell+epitopes+of+MOG+reside+in+its+transmembrane+and+cytoplasmic+domains+in+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Neuroimmunol+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE.</a> Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22(2014).</li>
<li>Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+recognition+of+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+autoantigen+depends+on+immunization+with+protein+rather+than+short+peptide%2C+while+B+cell+invasion+of+the+CNS+in+autoimmunity+does+not%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not.</a> J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).</li>
<li>Barun, B., Bar-Or, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+multiple+sclerosis+with+anti-CD20+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies.</a> Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).</li>
<li>Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+and+encephalitogenicity+of+recombinant+human+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein.</a> J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).</li>
<li>Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+and+human+myelin+oligodendrocyte+glycoproteins+induce+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+by+different+mechanisms+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice.</a> J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Restriction+Enzyme+Digests%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).</li>
<li>Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+additives+on+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effect of additives on protein aggregation.</a> Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).</li>
<li>Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+Infiltration+of+the+Spinal+Cord+by+Non-Classically+Activated+B+Cells+is+Associated+with+Chronic+Disease+Course+in+a+Spontaneous+B+Cell-Dependent+Model+of+CNS+Autoimmune+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease.</a> Front Immunol. 6, 470(2015).</li>
<li>LaVallie, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thioredoxin+gene+fusion+expression+system+that+circumvents+inclusion+body+formation+in+the+E.+coli+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.</a> Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).</li>
<li>Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+S.Tag+fusion+system+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The S.Tag fusion system for protein purification.</a> Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).</li>
<li>Amor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+epitopes+of+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+for+the+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+SJL+and+Biozzi+AB%2FH+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice.</a> J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).</li>
<li>Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+profiling+of+tobacco+etch+virus+protease+using+a+novel+fluorescence-assisted+whole-cell+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay.</a> PLoS ONE. 6 (1), e16136(2011).</li>
<li>Litzenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+producing+demyelinating+autoantibodies%3A+development+and+function+in+gene-targeted+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice.</a> J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).</li>
<li>Zhang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+purification+of+Escherichia+coli-expressed+human+thymosin-alpha1+using+affinity+chromatography+and+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography.</a> Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).</li>
<li>Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+protein+production+levels+in+Escherichia+coli+with+a+strong+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter.</a> FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).</li>
<li>Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29+T+cells+exacerbates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+induced+by+mouse%2C+but+not+rat%2C+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens.</a> J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).</li>
<li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+etch+virus+protease%3A+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).</li>
<li>Blommel, P. G., Fox, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+approach+to+improving+large-scale+production+of+tobacco+etch+virus+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease.</a> Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Hier hebben we een protocol beschreven voor de productie van MOG tag eiwit en hoe zuiver MOG 1-125 van de MOG tag eiwit te genereren. Dit protocol is gebaseerd op zowel standaard His-tag eiwitten zuiveringswerkwijzen, en een eerder beschreven protocol voor het genereren van een oudere MOG-eiwitten 15. Hoewel het hier niet wordt beschreven, het primaire gebruik van de MOG tag eiwit is om EAE te induceren door middel van immunisatie met eiwitantigeen. Een protocol bes...

MS is een menselijke ziekte gekenmerkt door chronische ontsteking en neurodegeneratie van het CZS die wordt gedacht te worden veroorzaakt door een auto-immuunreactie gericht myeline. Het verlies van myeline en axonen na verloop van tijd leiden tot een geleidelijke afname van de cognitieve en motorische functie 1. &quot;Experimentele auto-immune Encefalomyelitis&quot; is een overkoepelende term voor diermodellen van auto-immuunziekten gericht CNS myeline. Als menselijke MS, EAE wordt doorgaans gekenmerkt door infiltratie van immuuncellen van het centrale zenuwstelsel en in sommige gevallen, demyelinisatie 2. De mate waarin een bepaalde EAE model lijkt op menselijke MS mede afhankelijk van de soort of stam gebruikt en de complexiteit van het onderliggende anti-myeline auto-immuunreactie. Anti-myeline autoimmuniteit kan experimenteel worden geïnduceerd op verschillende manieren, maar de meest gebruikte methode tegenwoordig gebruikt om muizen te immuniseren met een korte peptide van aminozuren nabootsen van de immunodominante CD4 <sup&gt; + T cel epitoop van een myeline-eiwit. Dit is het minimum vereiste om een ​​pathogene respons te induceren. Misschien is de meest voorkomende van deze is een 21 aminozuur peptide afgeleid van myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG 35-55), die wordt gebruikt om EAE te induceren in C57BL / 6 muizen 3. Voor sommige experimentele doeleinden wenselijk of zelfs noodzakelijk om immuniseren met grotere eiwitantigenen en inderdaad zijn er verschillende voordelen aan deze via immunisatie met korte peptide. Ten eerste omdat MHC beperking korte peptiden gewoonlijk alleen effectief in een zeer beperkt aantal stammen, terwijl grotere eiwitantigenen die ofwel het gehele eiwit of een specifiek domein kan normaal worden voor de presentatie in verschillende soorten verwerkt meerdere inteelt muizenstammen of 4. Ten tweede, een groter eiwit antigeen kan induceren een meer complexe immuunrespons waarin meer soorten lymfocyten in antigenherkenning, plaats limiting antigeenherkenning aan CD4 + T-cellen. Bijvoorbeeld, B-cellen via hun B-cel receptor (BCR) communiceren rechtstreeks met geheel in plaats van verwerkte dierlijke eiwitten. Wij en anderen hebben aangetoond dat B-cellen geactiveerd door MOG 35-55 immunisatie niet herkent MOG eiwitten 5. Aangezien B-cellen werden onlangs aangetoond dat een pathogene rol spelen bij menselijke MS 6, EAE modellen die B-cellen bevatten bij auto pathologie steeds belangrijker. Ondanks de voordelen van grotere eiwitantigenen EAE te induceren, blijven er enkele commercieel beschikbare bronnen voor dergelijke eiwitten. Inderdaad, terwijl korte peptiden zoals MOG 35-55 snel en tegen relatief lage kosten kunnen worden gesynthetiseerd, de commerciële mogelijkheden MOG eiwitten zijn beperkt en de kosten aanzienlijk te schaffen. Toch zijn er een aantal expressievectoren beschikbaar voor onderzoeksgroepen om MOG extracellulair domein te genereren (MOG 1-125) zelf. however, alle expressiesystemen die we hebben geïdentificeerd in de literatuur zijn gebaseerd op oudere technologie die sindsdien zijn vervangen door efficiëntere expressiesystemen 7. Daarnaast bieden de meeste zijn gebaseerd op ratten of mensen MOG 8. Voor sommige onderzoeken van auto-immuniteit bij muizen, een antigeen op basis van de muis MOG autoantigeen voorkeur. Tenslotte alle MOG-gebaseerde eiwitten die we hebben geïdentificeerd, commerciële of als expressievectoren, zijn fusie-eiwitten die additionele aminozuren aan de MOG 1-125 base. Deze omvatten een tag voor zuivering en meestal andere sequenties ook, waarvan vele een functie we konden identificeren. Om deze beperkingen te pakken, genereerden wij een nieuwe fusie-eiwit op basis van de muis MOG extracellulaire domein gefuseerd aan een label met thioredoxine de bekende onoplosbaarheid van MOG eiwit 5 bestrijden. De tag sequentie bevat ook een 6xHis sequentie voor zuivering en een TEV protease kelAvage plaats dat zorgt voor de volledige verwijdering van tagsequenties, indien gewenst. Dit is de enige methode die we ons bewust van de zuivere MOG 1-125-eiwit te genereren. Om de productie van grote hoeveelheden eiwit te vergemakkelijken, de MOG 1-125 sequentie is codon-geoptimaliseerd voor bacteriële expressie en MOG tag fusie-eiwit werd in de pET-32 expressiesysteem ingebracht. Hier beschrijven we in detail het protocol te produceren en te zuiveren MOG tag eiwit en pure MOG 1-125, met behulp van niet-gespecialiseerde apparatuur beschikbaar voor de meeste immunologie laboratoria.

<table><tbody><tr><td>BL21 E. coli- pet32-MOGtag</td><td>Kerfoot lab</td><td></td><td>Deze bacteriën zijn nodig om het MOGtag-eiwit te maken. Glycerolvoorraden van deze bacteriën zijn op aanvraag beschikbaar.</td></tr><tr><td>LB bouillon miller</td><td>Bioshop</td><td>LBL407.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>bio basic</td><td>AB0028</td><td>Reconstitueer het poeder tot 50% ethanol/ 50% H2O bij 100 mg/ml. Bewaren bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bioshop</td><td>IPT002.5</td><td>Reconstitueer het poeder in H2O bij 1M en bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Kikker-ei lysozym</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.10</td><td>Reconstitueer in H2O bij 50 mg/ml en bewaar bij -80 &deg;C.</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>life technologies</td><td>20012-027</td><td>Commerciële fosfaat gebufferde zoutoplossing is niet vereist, elke standaard door het laboratorium gemaakte fosfaat gebufferde zoutoplossing is voldoende.</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Bioshop</td><td>SOD004.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Bioshop</td><td>TRS002.1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazool</td><td>Bioshop</td><td>IMD508.100</td><td></td></tr><tr><td>Guanidine-HCl</td><td>Sigma</td><td>G3272</td><td>De kwaliteit moet groter zijn dan 98% zuiverheid.</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>Nikkel (II) sulfaat</td><td>Bioshop</td><td>NIC700.500</td><td></td></tr><tr><td>His bind resin</td><td>EMD Millipore</td><td>69670-3</td><td>Bewaar in 20% ethanol 80% H2O bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anhydrisch ethanol</td><td>Commercial Alcohols</td><td>P016EAAN</td><td>Verdun met water indien nodig.</td></tr><tr><td>Glacial azijnzuur</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetaat trihydraat</td><td>Bioshop</td><td>SAA305.500</td><td></td></tr><tr><td>runderserum albumine standaard</td><td>bio-rad</td><td>500-0206</td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad eiwit assay kleurstof reagent concentreer</td><td>bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Etheendiaminetetra-azijnzuur, dinatriumzout dihydraat</td><td>Fisher scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Bioshop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>7000 MW Snakeskin dialysebuis</td><td>Thermoscientific</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ml</td><td>Dit reagens mag niet buiten een afzuigingskast worden gehanteerd.</td></tr><tr><td>AcTEV protease</td><td>lifetechnologies</td><td>12575-015</td><td>Het produceren van uw eigen TEV protease kan worden gerealiseerd met (https://www.addgene.org/8827/) en gezuiverd zoals in referentie 17</td></tr><tr><td>Polyethyleenglycol 3350</td><td>Bioshop</td><td>PEG335.1</td><td></td></tr><tr><td>polyethyleenglycol 8000</td><td>Bioshop</td><td>PEG800.1</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp platte bodem 96 welplaat</td><td>ebioscience</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher scientific</td><td>FB-120-110</td><td></td></tr><tr><td>Eon microplate spectrometer</td><td>Biotek</td><td>11-120-611</td><td>Dit apparaat gebruikt de Gen5 dataanalysesoftware.</td></tr><tr><td>Gen5 dataanalysesoftware</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>natriumdodecylsulfaat</td><td>Bioshop</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>bromofenolblauw</td><td>Bioshop</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001</td><td></td></tr><tr><td>Eiwitdesalting kolommen</td><td>Thermoscientific</td><td>89849</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001</td><td></td></tr><tr><td>voorgevormde 12% polyacrylamide gel</td><td>bio-rad</td><td>456-1045</td><td></td></tr><tr><td>Snelle kleurstof reagent</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td></td></tr><tr><td>Gel dock EZ imager</td><td>bio-rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>White Light Sample Tray</td><td>bio-rad</td><td>1708272&nbsp;</td><td>Gebruikt samen met gel dock EZ imager voor coomassie blauwe vlekken</td></tr><tr><td>Eiwit ladder</td><td>bio-rad</td><td>1610375</td><td></td></tr></tbody></table>

eenvoudige en efficiënte productie en zuivering van de muis myeline oligodendrocyt-glycoproteïne voor experimentele auto-immune encephalomyelitis studies

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerose (MS) is een chronische inflammatoire ziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS), waarvan wordt aangenomen dat deze ontstaat als gevolg van auto-immuunreacties die zich richten op myeline. Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is het meest voorkomende diermodel van auto-immuunziekten van het CZS en wordt meestal geïnduceerd via immunisatie met korte peptiden die immuindominerende CD4+ T-cel-epitopen van myeline-eiwitten vertegenwoordigen. Echter, B-cellen herkennen onbewerkt eiwit direct, en immunisatie met korte peptiden activeert geen B-cellen die het native eiwit herkennen. Aangezien recente klinische onderzoeken naar B-cel-depleterende therapieën bij MS een rol hebben gesuggereerd voor B-cellen bij het aansturen van de ziekte bij mensen, is er een dringende behoefte aan diermodellen die B-cel-herkenning van auto-antigeen integreren. Daarom hebben we een nieuw fusie-eiwit gegenereerd dat de extracellulaire domein van de muisversie van myeline-oligodendroglie glycoproteïne (MOG) bevat, evenals N-terminale fusies van een His-tag voor zuiveringsdoeleinden en het thioredoxine-eiwit om de oplosbaarheid te verbeteren (MOGtag). Er werd een snedeplaats voor het tabaks ets virus (TEV) protease opgenomen om alle tag-sequenties te kunnen verwijderen, waardoor alleen de pure MOG1-125 extracellulaire domein overblijft. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol met alleen standaard laboratoriumapparatuur om grote hoeveelheden zuiver MOGtag of MOG1-125 te produceren. Dit protocol genereert consistent meer dan 200 mg van het MOGtag-eiwit. Immunisatie met zowel MOGtag als MOG1-125 genereert een auto-immuunrespons die pathogene B-cellen omvat die het native muis-MOG herkennen.

Zodra de zuivering is voltooid, afgenomen in stappen 1,4, 2,1, 3,4, en het eindproduct van stap 6.4 moeten worden uitgevoerd op een eiwitgel (Figuur 3A). MOG tag moet eerst verschijnen als een 31.86 kDa band in de T O / N monster, maar niet T 0, en moet de enige band in de finale pure product. Om te testen of de MOG tag eiwit correct heeft gevouwen, kan de MOG tag eiwit worden gebruikt om MOG-eiwit specifieke B-celle...

We beschrijven een eenvoudig protocol met behulp van alleen basislaboratoriumapparatuur om grote hoeveelheden van een fusie-eiwit te genereren en zuiveren dat muis Myeline Oligodendrocyt Glycoproteïne bevat. Dit eiwit kan worden gebruikt om experimentele auto-immuunencefalitis te induceren die wordt aangedreven door zowel T- als B-cellen.

Eenvoudige en efficiënte productie en zuivering van de Muis myeline oligodendrocyt-glycoproteïne voor experimentele auto-immune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Het algemene doel van dit protocol is het produceren van eiwit op basis van het extracellulaire domein van het myelino-oligodendrocyten-glycoproteïne of MOG, dat kan worden gebruikt om experimentele auto-immuun encefalomyelitis of EAE op te wekken. Dit protocol stelt elk laboratorium in staat om MOG-eiwit te maken om als antigeen te gebruiken voor het induceren van EAE. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het niet afhankelijk is van gespecialiseerde apparatuur voor eiwitverwerking, maar dat u in plaats daarvan standaardapparatuur kunt gebruiken die in vrijwel elk immunologielaboratorium aanwezig is.Dit protocol is geoptimaliseerd voor het MOG-tag-eiwit op basis van de muisversie, maar het zou ook moeten werken voor andere MOG-eiwit-expressiesystemen die een histidine-tag voor zuivering bevatten. Inoculeer vijf milliliter gesteriliseerd bouillon met de BL 21 MOG-tag glycerolstock en incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C en 200 RPM. Voeg 500 µL ampicilline van 100 mg/mL toe aan elk van de twee 500 milliliter kolven die 500 milliliter steriele LB bevatten. Draag één milliliter van de overnight-cultuur over naar elk van de twee kolven met LB-bouillon.Incubeer bij 37

simple-efficient-production-purification-mouse-myelin-oligodendrocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates an efficient homogenization technique to generate an antigen-adjuvant emulsion to induce experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in a murine model. The emulsion contains an autoantigen — myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) — in the water phase, surrounded by a continuous oil phase comprising an inactivated pathogenic bacteria. The emulsion ensures a sustained release of antigens for a prolonged immune response.

Preparing an Antigen-Adjuvant Emulsion to Induce Autoimmune Encephalomyelitis

The video demonstrates the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in a mouse model by injecting a combination of myelin oligodendrocyte glycoproteins and inactivated Mycobacterium tuberculosis. The model enables researchers to study disease mechanisms and test therapeutic interventions.

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in a Mouse Model

This video demonstrates the method of inducing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) by injecting myelin-derived peptides with an adjuvant to activate autoreactive T cells, which migrate to the brain. Pertussis toxin is administered to increase blood-brain barrier permeability, allowing these T cells and other immune cells to enter the brain. These immune cells cause demyelination, leading to impaired nerve transmission and development of EAE.

Generation of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in a Mouse Model

In this video, a mouse model of multiple sclerosis is established using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The mouse is injected with an emulsion containing a neuronal peptide and an adjuvant, triggering an immune response that activates autoreactive T cells. This is followed by an injection of pertussis toxin (PTX) to increase blood-brain barrier permeability, allowing the autoreactive T-cells to infiltrate the brain. This infiltration initiates a signaling cascade that...

Source: Jain, R. W., et al. Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the isolation and purification of MOGtag, a recombinant Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG) used in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) studies. The protocol involves bacterial lysis, sonication, centrifugation, and nickel affinity chromatography to obtain...

Isolation and Purification of Recombinant Myelin Oligodendrocyte Glycoproteins

De transplantatie van neurale stamcellen / progenitorcellen (NPC) houdt grote beloften in de regeneratieve neurologie. De systemische toediening van NPCs is in efficiënte, lage invasief en therapeutisch zeer effectief protocol om stamcellen te leveren in de hersenen en ruggenmerg van knaagdieren en niet-menselijke primaten die door experimentele chronische inflammatoire schade aan het centrale zenuwstelsel.

Systemische Injectie van neurale stamcellen / progenitorcellen in Muizen met chronische EAE

Experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) is een gevestigde diermodel voor multiple sclerose. C57BL / 6 muizen worden geïmmuniseerd met myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), wat resulteert in een oplopende zwakke verlamming veroorzaakt door autoreactieve immuuncellen in het centrale zenuwstelsel. Protocollen voor de ziekte van inductie en toezicht zal worden besproken.

Myeline Oligodendrocyte glycoproteïne (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Geïnduceerde experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) in C57BL / 6 muizen

We beschrijven de immunomagnetic isolatie van primaire muisknop oligodendrocyten, waarmee het snelle en specifieke isolement van de cellen voor in vitro cultuur.

Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

Om experimentele auto-immune encefalomyelitis, een diermodel van multiple sclerose, te induceren, worden muizen geïmmuniseerd met een water-in-olie-emulsie die een autoantigeen bevat en het adjuvans van Freund compleet maakt. Hoewel er verschillende protocollen bestaan voor de bereiding van deze emulsies, wordt hier een snel, eenvoudig en gestandaardiseerd homogenisatieprotocol voor emulsievoorbereiding gepresenteerd.

Een snelle, eenvoudige en gestandaardiseerde homogenisatiemethode om antigeen / adjuvante emulsies voor te bereiden voor het induceren van experimentele auto-immune encefalomyelitis

Tot op heden zijn protocollen voor de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke celtypen van het centrale zenuwstelsel uit dezelfde muis een onvervulde vraag. Het protocol toont een procedure die toepasbaar is bij naïeve en experimentele auto-immuun encefalomyelitis-muizen om complexe cellulaire netwerken tijdens neuro-inflammatie te onderzoeken en tegelijkertijd het vereiste aantal muizen te verminderen.

Gelijktijdige isolatie van de belangrijkste celtypen van het centrale zenuwstelsel van volwassen auto-immuun encefalomyelitis-muizen

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is een diermodel van multiple sclerose (MS), dat met de menselijke ziekte een robuuste humorale auto-immuunrespons deelt. Hier rapporteren we een eenvoudig en flexibel ELISA-protocol om auto-antilichamen in het serum van EAE-geïmmuniseerde muizen te kwantificeren.

Kwantificering van autoreactieve antilichamen bij muizen bij experimentele auto-immuunencefalomyelitis

Leer een eenvoudige methode voor productie en zuivering van muis MOG-eiwit voor experimentele auto-immuun encefalomyelitis studies. Dit protocol gebruikt standaard laboratoriumapparatuur.

Eenvoudige en efficiënte productie en zuivering van de Muis myeline oligodendrocyt-glycoproteïne voor experimentele auto-immune Encephalomyelitis Studies (Video) | JoVE Journal

Eenvoudige en efficiënte productie en zuivering van de Muis myeline oligodendrocyt-glycoproteïne voor experimentele auto-immune Encephalomyelitis Studies

Meer video's verkennen