Name: Eenvoudige en efficiënte productie en zuivering van de Muis myeline oligodendrocyt-glycoproteïne voor experimentele auto-immune Encephalomyelitis Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Leer een eenvoudige methode voor productie en zuivering van muis MOG-eiwit voor experimentele auto-immuun encefalomyelitis studies. Dit protocol gebruikt standaard laboratoriumapparatuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ is de ontvanger van de Waugh Family MS Society of Canada doctoraalstudentenprijs.

<ol><li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Baxter, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+application+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).</li>
<li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+%28MOG35-55%29+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Shetty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodominant+T-cell+epitopes+of+MOG+reside+in+its+transmembrane+and+cytoplasmic+domains+in+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Neuroimmunol+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE.</a> Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22(2014).</li>
<li>Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+recognition+of+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+autoantigen+depends+on+immunization+with+protein+rather+than+short+peptide%2C+while+B+cell+invasion+of+the+CNS+in+autoimmunity+does+not%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not.</a> J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).</li>
<li>Barun, B., Bar-Or, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+multiple+sclerosis+with+anti-CD20+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies.</a> Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).</li>
<li>Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+and+encephalitogenicity+of+recombinant+human+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein.</a> J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).</li>
<li>Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+and+human+myelin+oligodendrocyte+glycoproteins+induce+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+by+different+mechanisms+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice.</a> J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Restriction+Enzyme+Digests%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).</li>
<li>Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+additives+on+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effect of additives on protein aggregation.</a> Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).</li>
<li>Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+Infiltration+of+the+Spinal+Cord+by+Non-Classically+Activated+B+Cells+is+Associated+with+Chronic+Disease+Course+in+a+Spontaneous+B+Cell-Dependent+Model+of+CNS+Autoimmune+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease.</a> Front Immunol. 6, 470(2015).</li>
<li>LaVallie, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thioredoxin+gene+fusion+expression+system+that+circumvents+inclusion+body+formation+in+the+E.+coli+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.</a> Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).</li>
<li>Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+S.Tag+fusion+system+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The S.Tag fusion system for protein purification.</a> Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).</li>
<li>Amor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+epitopes+of+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+for+the+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+SJL+and+Biozzi+AB%2FH+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice.</a> J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).</li>
<li>Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+profiling+of+tobacco+etch+virus+protease+using+a+novel+fluorescence-assisted+whole-cell+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay.</a> PLoS ONE. 6 (1), e16136(2011).</li>
<li>Litzenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+producing+demyelinating+autoantibodies%3A+development+and+function+in+gene-targeted+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice.</a> J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).</li>
<li>Zhang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+purification+of+Escherichia+coli-expressed+human+thymosin-alpha1+using+affinity+chromatography+and+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography.</a> Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).</li>
<li>Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+protein+production+levels+in+Escherichia+coli+with+a+strong+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter.</a> FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).</li>
<li>Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29+T+cells+exacerbates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+induced+by+mouse%2C+but+not+rat%2C+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens.</a> J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).</li>
<li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+etch+virus+protease%3A+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).</li>
<li>Blommel, P. G., Fox, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+approach+to+improving+large-scale+production+of+tobacco+etch+virus+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease.</a> Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Hier hebben we een protocol beschreven voor de productie van MOG tag eiwit en hoe zuiver MOG 1-125 van de MOG tag eiwit te genereren. Dit protocol is gebaseerd op zowel standaard His-tag eiwitten zuiveringswerkwijzen, en een eerder beschreven protocol voor het genereren van een oudere MOG-eiwitten 15. Hoewel het hier niet wordt beschreven, het primaire gebruik van de MOG tag eiwit is om EAE te induceren door middel van immunisatie met eiwitantigeen. Een protocol bes...

MS is een menselijke ziekte gekenmerkt door chronische ontsteking en neurodegeneratie van het CZS die wordt gedacht te worden veroorzaakt door een auto-immuunreactie gericht myeline. Het verlies van myeline en axonen na verloop van tijd leiden tot een geleidelijke afname van de cognitieve en motorische functie 1. &quot;Experimentele auto-immune Encefalomyelitis&quot; is een overkoepelende term voor diermodellen van auto-immuunziekten gericht CNS myeline. Als menselijke MS, EAE wordt doorgaans gekenmerkt door infiltratie van immuuncellen van het centrale zenuwstelsel en in sommige gevallen, demyelinisatie 2. De mate waarin een bepaalde EAE model lijkt op menselijke MS mede afhankelijk van de soort of stam gebruikt en de complexiteit van het onderliggende anti-myeline auto-immuunreactie. Anti-myeline autoimmuniteit kan experimenteel worden geïnduceerd op verschillende manieren, maar de meest gebruikte methode tegenwoordig gebruikt om muizen te immuniseren met een korte peptide van aminozuren nabootsen van de immunodominante CD4 <sup&gt; + T cel epitoop van een myeline-eiwit. Dit is het minimum vereiste om een ​​pathogene respons te induceren. Misschien is de meest voorkomende van deze is een 21 aminozuur peptide afgeleid van myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG 35-55), die wordt gebruikt om EAE te induceren in C57BL / 6 muizen 3. Voor sommige experimentele doeleinden wenselijk of zelfs noodzakelijk om immuniseren met grotere eiwitantigenen en inderdaad zijn er verschillende voordelen aan deze via immunisatie met korte peptide. Ten eerste omdat MHC beperking korte peptiden gewoonlijk alleen effectief in een zeer beperkt aantal stammen, terwijl grotere eiwitantigenen die ofwel het gehele eiwit of een specifiek domein kan normaal worden voor de presentatie in verschillende soorten verwerkt meerdere inteelt muizenstammen of 4. Ten tweede, een groter eiwit antigeen kan induceren een meer complexe immuunrespons waarin meer soorten lymfocyten in antigenherkenning, plaats limiting antigeenherkenning aan CD4 + T-cellen. Bijvoorbeeld, B-cellen via hun B-cel receptor (BCR) communiceren rechtstreeks met geheel in plaats van verwerkte dierlijke eiwitten. Wij en anderen hebben aangetoond dat B-cellen geactiveerd door MOG 35-55 immunisatie niet herkent MOG eiwitten 5. Aangezien B-cellen werden onlangs aangetoond dat een pathogene rol spelen bij menselijke MS 6, EAE modellen die B-cellen bevatten bij auto pathologie steeds belangrijker. Ondanks de voordelen van grotere eiwitantigenen EAE te induceren, blijven er enkele commercieel beschikbare bronnen voor dergelijke eiwitten. Inderdaad, terwijl korte peptiden zoals MOG 35-55 snel en tegen relatief lage kosten kunnen worden gesynthetiseerd, de commerciële mogelijkheden MOG eiwitten zijn beperkt en de kosten aanzienlijk te schaffen. Toch zijn er een aantal expressievectoren beschikbaar voor onderzoeksgroepen om MOG extracellulair domein te genereren (MOG 1-125) zelf. however, alle expressiesystemen die we hebben geïdentificeerd in de literatuur zijn gebaseerd op oudere technologie die sindsdien zijn vervangen door efficiëntere expressiesystemen 7. Daarnaast bieden de meeste zijn gebaseerd op ratten of mensen MOG 8. Voor sommige onderzoeken van auto-immuniteit bij muizen, een antigeen op basis van de muis MOG autoantigeen voorkeur. Tenslotte alle MOG-gebaseerde eiwitten die we hebben geïdentificeerd, commerciële of als expressievectoren, zijn fusie-eiwitten die additionele aminozuren aan de MOG 1-125 base. Deze omvatten een tag voor zuivering en meestal andere sequenties ook, waarvan vele een functie we konden identificeren. Om deze beperkingen te pakken, genereerden wij een nieuwe fusie-eiwit op basis van de muis MOG extracellulaire domein gefuseerd aan een label met thioredoxine de bekende onoplosbaarheid van MOG eiwit 5 bestrijden. De tag sequentie bevat ook een 6xHis sequentie voor zuivering en een TEV protease kelAvage plaats dat zorgt voor de volledige verwijdering van tagsequenties, indien gewenst. Dit is de enige methode die we ons bewust van de zuivere MOG 1-125-eiwit te genereren. Om de productie van grote hoeveelheden eiwit te vergemakkelijken, de MOG 1-125 sequentie is codon-geoptimaliseerd voor bacteriële expressie en MOG tag fusie-eiwit werd in de pET-32 expressiesysteem ingebracht. Hier beschrijven we in detail het protocol te produceren en te zuiveren MOG tag eiwit en pure MOG 1-125, met behulp van niet-gespecialiseerde apparatuur beschikbaar voor de meeste immunologie laboratoria.

<table><tbody><tr><td>BL21 E. coli- pet32-MOGtag</td><td>Kerfoot lab</td><td></td><td>Deze bacteriën zijn nodig om het MOGtag-eiwit te maken. Glycerolvoorraden van deze bacteriën zijn op aanvraag beschikbaar.</td></tr><tr><td>LB bouillon miller</td><td>Bioshop</td><td>LBL407.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>bio basic</td><td>AB0028</td><td>Reconstitueer het poeder tot 50% ethanol/ 50% H2O bij 100 mg/ml. Bewaren bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bioshop</td><td>IPT002.5</td><td>Reconstitueer het poeder in H2O bij 1M en bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Kikker-ei lysozym</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.10</td><td>Reconstitueer in H2O bij 50 mg/ml en bewaar bij -80 &deg;C.</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>life technologies</td><td>20012-027</td><td>Commerciële fosfaat gebufferde zoutoplossing is niet vereist, elke standaard door het laboratorium gemaakte fosfaat gebufferde zoutoplossing is voldoende.</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Bioshop</td><td>SOD004.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Bioshop</td><td>TRS002.1</td><td></td></tr><tr><td>Imidazool</td><td>Bioshop</td><td>IMD508.100</td><td></td></tr><tr><td>Guanidine-HCl</td><td>Sigma</td><td>G3272</td><td>De kwaliteit moet groter zijn dan 98% zuiverheid.</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>Nikkel (II) sulfaat</td><td>Bioshop</td><td>NIC700.500</td><td></td></tr><tr><td>His bind resin</td><td>EMD Millipore</td><td>69670-3</td><td>Bewaar in 20% ethanol 80% H2O bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anhydrisch ethanol</td><td>Commercial Alcohols</td><td>P016EAAN</td><td>Verdun met water indien nodig.</td></tr><tr><td>Glacial azijnzuur</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetaat trihydraat</td><td>Bioshop</td><td>SAA305.500</td><td></td></tr><tr><td>runderserum albumine standaard</td><td>bio-rad</td><td>500-0206</td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad eiwit assay kleurstof reagent concentreer</td><td>bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Etheendiaminetetra-azijnzuur, dinatriumzout dihydraat</td><td>Fisher scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Bioshop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>7000 MW Snakeskin dialysebuis</td><td>Thermoscientific</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ml</td><td>Dit reagens mag niet buiten een afzuigingskast worden gehanteerd.</td></tr><tr><td>AcTEV protease</td><td>lifetechnologies</td><td>12575-015</td><td>Het produceren van uw eigen TEV protease kan worden gerealiseerd met (https://www.addgene.org/8827/) en gezuiverd zoals in referentie 17</td></tr><tr><td>Polyethyleenglycol 3350</td><td>Bioshop</td><td>PEG335.1</td><td></td></tr><tr><td>polyethyleenglycol 8000</td><td>Bioshop</td><td>PEG800.1</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp platte bodem 96 welplaat</td><td>ebioscience</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher scientific</td><td>FB-120-110</td><td></td></tr><tr><td>Eon microplate spectrometer</td><td>Biotek</td><td>11-120-611</td><td>Dit apparaat gebruikt de Gen5 dataanalysesoftware.</td></tr><tr><td>Gen5 dataanalysesoftware</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>natriumdodecylsulfaat</td><td>Bioshop</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>bromofenolblauw</td><td>Bioshop</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001</td><td></td></tr><tr><td>Eiwitdesalting kolommen</td><td>Thermoscientific</td><td>89849</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bioshop</td><td>GLN001</td><td></td></tr><tr><td>voorgevormde 12% polyacrylamide gel</td><td>bio-rad</td><td>456-1045</td><td></td></tr><tr><td>Snelle kleurstof reagent</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td></td></tr><tr><td>Gel dock EZ imager</td><td>bio-rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>White Light Sample Tray</td><td>bio-rad</td><td>1708272&nbsp;</td><td>Gebruikt samen met gel dock EZ imager voor coomassie blauwe vlekken</td></tr><tr><td>Eiwit ladder</td><td>bio-rad</td><td>1610375</td><td></td></tr></tbody></table>

eenvoudige en efficiënte productie en zuivering van de muis myeline oligodendrocyt-glycoproteïne voor experimentele auto-immune encephalomyelitis studies

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerose (MS) is een chronische inflammatoire ziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS), waarvan wordt aangenomen dat deze ontstaat als gevolg van auto-immuunreacties die zich richten op myeline. Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is het meest voorkomende diermodel van auto-immuunziekten van het CZS en wordt meestal geïnduceerd via immunisatie met korte peptiden die immuindominerende CD4+ T-cel-epitopen van myeline-eiwitten vertegenwoordigen. Echter, B-cellen herkennen onbewerkt eiwit direct, en immunisatie met korte peptiden activeert geen B-cellen die het native eiwit herkennen. Aangezien recente klinische onderzoeken naar B-cel-depleterende therapieën bij MS een rol hebben gesuggereerd voor B-cellen bij het aansturen van de ziekte bij mensen, is er een dringende behoefte aan diermodellen die B-cel-herkenning van auto-antigeen integreren. Daarom hebben we een nieuw fusie-eiwit gegenereerd dat de extracellulaire domein van de muisversie van myeline-oligodendroglie glycoproteïne (MOG) bevat, evenals N-terminale fusies van een His-tag voor zuiveringsdoeleinden en het thioredoxine-eiwit om de oplosbaarheid te verbeteren (MOGtag). Er werd een snedeplaats voor het tabaks ets virus (TEV) protease opgenomen om alle tag-sequenties te kunnen verwijderen, waardoor alleen de pure MOG1-125 extracellulaire domein overblijft. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol met alleen standaard laboratoriumapparatuur om grote hoeveelheden zuiver MOGtag of MOG1-125 te produceren. Dit protocol genereert consistent meer dan 200 mg van het MOGtag-eiwit. Immunisatie met zowel MOGtag als MOG1-125 genereert een auto-immuunrespons die pathogene B-cellen omvat die het native muis-MOG herkennen.

Zodra de zuivering is voltooid, afgenomen in stappen 1,4, 2,1, 3,4, en het eindproduct van stap 6.4 moeten worden uitgevoerd op een eiwitgel (Figuur 3A). MOG tag moet eerst verschijnen als een 31.86 kDa band in de T O / N monster, maar niet T 0, en moet de enige band in de finale pure product. Om te testen of de MOG tag eiwit correct heeft gevouwen, kan de MOG tag eiwit worden gebruikt om MOG-eiwit specifieke B-celle...

We beschrijven een eenvoudig protocol met behulp van alleen basislaboratoriumapparatuur om grote hoeveelheden van een fusie-eiwit te genereren en zuiveren dat muis Myeline Oligodendrocyt Glycoproteïne bevat. Dit eiwit kan worden gebruikt om experimentele auto-immuunencefalitis te induceren die wordt aangedreven door zowel T- als B-cellen.

Eenvoudige en efficiënte productie en zuivering van de Muis myeline oligodendrocyt-glycoproteïne voor experimentele auto-immune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Het algemene doel van dit protocol is het produceren van eiwit op basis van het extracellulaire domein van het myelino-oligodendrocyten-glycoproteïne of MOG, dat kan worden gebruikt om experimentele auto-immuun encefalomyelitis of EAE op te wekken. Dit protocol stelt elk laboratorium in staat om MOG-eiwit te maken om als antigeen te gebruiken voor het induceren van EAE. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het niet afhankelijk is van gespecialiseerde apparatuur voor eiwitverwerking, maar dat u in plaats daarvan standaardapparatuur kunt gebruiken die in vrijwel elk immunologielaboratorium aanwezig is.Dit protocol is geoptimaliseerd voor het MOG-tag-eiwit op basis van de muisversie, maar het zou ook moeten werken voor andere MOG-eiwit-expressiesystemen die een histidine-tag voor zuivering bevatten. Inoculeer vijf milliliter gesteriliseerd bouillon met de BL 21 MOG-tag glycerolstock en incubeer dit gedurende de nacht bij 37 °C en 200 RPM. Voeg 500 µL ampicilline van 100 mg/mL toe aan elk van de twee 500 milliliter kolven die 500 milliliter steriele LB bevatten. Draag één milliliter van de overnight-cultuur over naar elk van de twee kolven met LB-bouillon.Incubeer bij 37 °C en 200 RPM gedurende vijf uur of tot een optische dichtheid van 0,6 is bereikt. Zodra de gewenste celdichtheid is bereikt, voegt u 0,5 ml van één molair IPTG toe aan elke kweekfles. Incubeer de fles bij 37 °C en 200 RPM gedurende vier uur en vervolgens bij kamertemperatuur en 75 RPM gedurende de nacht.Verdeel de culturen gelijkmatig over 250 milliliter flessen die geschikt zijn voor hogesnelheidscentrifugatie en houd de flessen vanaf dit punt op ijs. Pelleteer de bacteriële cellen bij 22, 000 ×g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Resuspendeer en combineer alle bacteriële pellets in een totaal van 30 milliliters lysaatbuffer.Overbreng dit volume naar een ronde-bodem buis van 50 milliliter die geschikt is voor centrifugatie bij hoge snelheid. Plaats deze buis gedurende 30 minuten in een waterbad van 30 degree Celsius. Schud de buis tijdens de incubatietijd twee keer om de cellen opnieuw te suspenderen.Transporteer de buis na incubatie naar ijs en soniceer de oplossing bij 20 kilohertz en een amplitude van 70%, waarbij drie seconden wordt gepulseerd en drie seconden rust tussen elke puls, gedurende vijf pulsen; soniceer de oplossing in totaal zes rondes van vijf pulsen, waarbij de oplossing tussen de rondes door op ijs mag afkoelen. Centrifugeer de oplossing vervolgens bij 24,000 ×g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius, resuspendeer de pellet daarna in 30 milliliters buffer A en incubeer de oplossing drie uur bij vier graden Celsius. Soniceer de oplossing na incubatie opnieuw op ijs zoals voorheen en voeg vervolgens 17,2 gram guanidine HCl toe aan de oplossing.Incubeer het monster gedurende één uur op ijs om het MOG-tag eiwit te solubiliseren. Om de nikkelhars te laden en te equilibreren, wast u de hars eerst door 40 milliliters water toe te voegen aan elke buis met hars. Leg de buizen horizontaal op een rocker en laat ze vijf minuten agiteren bij vier graden Celsius.Centrifugeer de buisjes na voltooiing 8 minuten bij 4500 ×g bij 4 °C. Verwijder het supernatant met een pipet om te voorkomen dat de pellet wordt verstoord. Voeg vervolgens 40 ml laadbuffer toe aan elke buis.Plaats de buizen op een rocker en laat deze 15 minuten agiteren bij vier graden Celsius alvorens opnieuw te centrifugeren zoals voorheen. Verwijder het supernatant en voeg 40 milliliter buffer B toe aan de buizen. Plaats de buizen op een rocker en laat deze vijf minuten agiteren bij vier graden Celsius alvorens de buizen met hars nogmaals te centrifugeren.Om het MOG-tag-eiwit te zuiveren, brengt u het volledige volume van het gesolubiliseerde eiwit over naar de eerste buis met nikkelhars. Plaats de buis na het mengen horizontaal op een rocker bij vier graden Celsius gedurende één uur. Na het centrifugeren van de buis bij 4500 ×g gedurende acht minuten bij vier graden Celsius, brengt u dit supernatant over naar de tweede buis met nikkelhars en incubeert u deze zoals voorheen.Resuspendeer ondertussen de nikkelhars in de eerste buis in 40 milliliters evolutiebuffer en plaats de buis horizontaal op een rocker bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten voordat u opnieuw centrifugeert. Breng het supernatant dat het genoemde MOG-tageiwit bevat over in een fles van 250 milliliter met het label gezuiverd MOG-tageiwit. Bewaar deze fles bij vier graden Celsius.Verzamel bij elke elutiestap het resulterende supernatant in deze fles. Voeg 40 milliliters stripbuffer toe aan het nikkel in de eerste buis en plaats deze horizontaal op een rocker gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Centrifugeer de buis, gooi het supernatant weg en activeer het nikkelhars opnieuw zoals voorheen.Zodra dit is voltooid, gaat u verder met de tweede buis zoals bij de eerste buis is gedaan. In totaal zullen vier ronden van absorptie van het gesolubiliseerde eiwit op de geladen nikkelhars en elutie het grootste deel van het eiwit terugwinnen. Snijd ongeveer 30 centimeter slangenhuid-dialysebuis af.Bevestig één uiteinde met een vergrendelbare hemostat door het uiteinde van de slangenhuid drie keer om te vouwen en het gevouwen uiteinde met de hemostat vast te klemmen. Vul de slangenhuid met verdund MOG tag-proteïne. Verwijder vervolgens eventuele luchtbellen uit de slangenhuid door deze via het open uiteinde naar buiten te persen.Sluit tot slot het andere uiteinde van de buis af met een tweede vergrendelbare hemostaat. Vul vervolgens een grote emmer met één liter van een 1x acetaatbuffer met 4 M guanidine. Plaats maximaal twee secties dialysebuis die MOG-tag-eiwit bevatten in de emmer.Bevestig de hemostaten met tape aan de zijkant van het bakje, zodat er voldoende ruimte is voor een magnetische roerstaf om ongehinderd op de bodem te draaien. Plaats het bakje in een ruimte van 4 °C op een magnetische roerplaat en schakel deze in op een lage rotatiesnelheid. De dialyse duurt minimaal drie dagen om de hoeveelheid guanidine in de buffer geleidelijk te verminderen.Controleer regelmatig of de buis intact is en of de uiteinden stevig gesloten zijn. Voeg na vier tot vijf uur één liter van een 1x acetaatbuffer toe aan de dialysebak. Herhaal dit proces elke vier tot vijf uur in totaal drie keer, zodat er uiteindelijk vier liter in de bak zit.Gooi de helft van de buffer in de emmer weg, vul deze vervolgens aan met één liter 1x acetaatbuffer en plaats de slang en de roerstaaf. Vervang tenslotte het volledige volume van vier liter in de emmer door vier liter verse 1x acetaatbuffer en laat dit vier tot vijf uur roeren. Voor het beste resultaat dient deze stap op de dag van de eiwitconcentratie te worden uitgevoerd.Om het MOG-tag-eiwit te concentreren, bekleedt u een pen met aluminiumfolie en bedekt u de aluminiumfolie met PEG 3350 en PEG 1000 in een verhouding van één op één. PEG 3350 kan helpen eiwitaggregatie tijdens de concentratie te voorkomen en is een effectief cryoprotectivum. Plaats de slangenhuidbuis met het MOG-tag-eiwit bovenop de aluminiumfolie en bedek dit met PEG 8000.Laat dit bij kamertemperatuur staan en controleer regelmatig het volume totdat het volume gelijk is aan of lager is dan het geschatte eindvolume. Als de pen tijdens het concentratieproces oververzadigd raakt met water, bereid dan een nieuwe schaal voor met aluminiumfolie en PEG. Neem eiwitmonsters gedurende het gehele zuiveringsprotocol of voer een SDS-PAGE-gel uit om de zuiverheid te bevestigen.Er wordt een representatieve gel getoond waarop de hooggezuiverde MOG-tag bij 31,86 kilodalton zichtbaar is. Om te verifiëren of het MOG-tag-eiwit correct is gevouwen, werd de binding van het MOG-tag-eiwit aan CD19-positieve, CD4-negatieve B-cellen uit lymfeklieren van wild-type C57 black six-muizen of IgH MOG-muizen die een voor MOG-eiwit specifiek immunoglobulin zwaar-keten tot expressie brengen, beoordeeld middels flowcytometrie. Dit protocol vereist minimaal 10 dagen van begin tot eind.Gedurende de gehele isolatieprocedure is het belangrijk om het eiwit in de gaten te houden en te onthouden wat bewaard moet worden en wat weggegooid kan worden. Vergeet niet dat nikkelsulfaathexahydraat, dat wordt gebruikt voor het laden van de nikkelhars, extreem gevaarlijk is en dat voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om inademing of contact met de huid of ogen te voorkomen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u uw eigen MOG-tag-eiwit kunt produceren en zuiveren.Zodra het MOG-tag-eiwit is gezuiverd, kan het worden geëmulgeerd in compleet adjuvant van Freund en worden gebruikt voor immunisatie om EAE te induceren. EAE geïnduceerd door MOG-tag kan worden gebruikt om de betrokkenheid van meerdere celtypen, zoals CD4- of CDAT-cellen of B-cellen, bij auto-immuniteit van het centrale zenuwstelsel te bestuderen. In tegenstelling tot korte peptiden, die MHC-beperkt zijn, kan het eiwitantigeen in elke muizenstam worden gebruikt.

simple-efficient-production-purification-mouse-myelin-oligodendrocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates an efficient homogenization technique to generate an antigen-adjuvant emulsion to induce experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in a murine model. The emulsion contains an autoantigen — myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) — in the water phase, surrounded by a continuous oil phase comprising an inactivated pathogenic bacteria. The emulsion ensures a sustained release of antigens for a prolonged immune response.

Preparing an Antigen-Adjuvant Emulsion to Induce Autoimmune Encephalomyelitis

The video demonstrates the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in a mouse model by injecting a combination of myelin oligodendrocyte glycoproteins and inactivated Mycobacterium tuberculosis. The model enables researchers to study disease mechanisms and test therapeutic interventions.

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in a Mouse Model

This video demonstrates the method of inducing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) by injecting myelin-derived peptides with an adjuvant to activate autoreactive T cells, which migrate to the brain. Pertussis toxin is administered to increase blood-brain barrier permeability, allowing these T cells and other immune cells to enter the brain. These immune cells cause demyelination, leading to impaired nerve transmission and development of EAE.

Generation of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in a Mouse Model

In this video, a mouse model of multiple sclerosis is established using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The mouse is injected with an emulsion containing a neuronal peptide and an adjuvant, triggering an immune response that activates autoreactive T cells. This is followed by an injection of pertussis toxin (PTX) to increase blood-brain barrier permeability, allowing the autoreactive T-cells to infiltrate the brain. This infiltration initiates a signaling cascade that...

Source: Jain, R. W., et al. Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the isolation and purification of MOGtag, a recombinant Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG) used in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) studies. The protocol involves bacterial lysis, sonication, centrifugation, and nickel affinity chromatography to obtain...

Isolation and Purification of Recombinant Myelin Oligodendrocyte Glycoproteins

Experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) is een gevestigde diermodel voor multiple sclerose. C57BL / 6 muizen worden geïmmuniseerd met myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), wat resulteert in een oplopende zwakke verlamming veroorzaakt door autoreactieve immuuncellen in het centrale zenuwstelsel. Protocollen voor de ziekte van inductie en toezicht zal worden besproken.

Myeline Oligodendrocyte glycoproteïne (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Geïnduceerde experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) in C57BL / 6 muizen

We beschrijven de immunomagnetic isolatie van primaire muisknop oligodendrocyten, waarmee het snelle en specifieke isolement van de cellen voor in vitro cultuur.

Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

Het huidige protocol beschrijft de inductie van experimentele auto-immune encefalomyelitis in een muismodel met behulp van myeline oligodendrocytenglycoproteïne en het monitoren van het ziekteproces met behulp van een klinisch scoresysteem. Experimentele auto-immuun encefalomyelitis-gerelateerde symptomen worden geanalyseerd met behulp van muis femur micro-computertomografie analyse en open veld test om het ziekteproces uitgebreid te beoordelen.

Inductie- en diverse beoordelingsindicatoren van experimentele auto-immuun encefalomyelitis

Om experimentele auto-immune encefalomyelitis, een diermodel van multiple sclerose, te induceren, worden muizen geïmmuniseerd met een water-in-olie-emulsie die een autoantigeen bevat en het adjuvans van Freund compleet maakt. Hoewel er verschillende protocollen bestaan voor de bereiding van deze emulsies, wordt hier een snel, eenvoudig en gestandaardiseerd homogenisatieprotocol voor emulsievoorbereiding gepresenteerd.

Een snelle, eenvoudige en gestandaardiseerde homogenisatiemethode om antigeen / adjuvante emulsies voor te bereiden voor het induceren van experimentele auto-immune encefalomyelitis

Tot op heden zijn protocollen voor de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke celtypen van het centrale zenuwstelsel uit dezelfde muis een onvervulde vraag. Het protocol toont een procedure die toepasbaar is bij naïeve en experimentele auto-immuun encefalomyelitis-muizen om complexe cellulaire netwerken tijdens neuro-inflammatie te onderzoeken en tegelijkertijd het vereiste aantal muizen te verminderen.

Gelijktijdige isolatie van de belangrijkste celtypen van het centrale zenuwstelsel van volwassen auto-immuun encefalomyelitis-muizen

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is een diermodel van multiple sclerose (MS), dat met de menselijke ziekte een robuuste humorale auto-immuunrespons deelt. Hier rapporteren we een eenvoudig en flexibel ELISA-protocol om auto-antilichamen in het serum van EAE-geïmmuniseerde muizen te kwantificeren.

Kwantificering van autoreactieve antilichamen bij muizen bij experimentele auto-immuunencefalomyelitis

Leer een eenvoudige methode voor productie en zuivering van muis MOG-eiwit voor experimentele auto-immuun encefalomyelitis studies. Dit protocol gebruikt standaard laboratoriumapparatuur.

Eenvoudige en efficiënte productie en zuivering van de Muis myeline oligodendrocyt-glycoproteïne voor experimentele auto-immune Encephalomyelitis Studies (Video) | JoVE Journal

Eenvoudige en efficiënte productie en zuivering van de Muis myeline oligodendrocyt-glycoproteïne voor experimentele auto-immune Encephalomyelitis Studies

Meer video's verkennen