Het bestuderen van de Protein Quality Control System van
2 december 2016
De sociale amoeben Dictyostelium discoideum is onlangs vastgesteld als een systeem om eiwitmisvouwen en proteostase te bestuderen. Hier beschrijven we een nieuwe op beeldvorming gebaseerde methodologie om temperatuur-geïnduceerde eiwitaggregatie en de cellulaire stressrespons in D. discoideum te bestuderen.
Het algemene doel van deze beeldvormingstechniek is om door hittestress geïnduceerde cellulaire verstoringen in Dictyostelium discoideum-cellen te observeren. Deze methode kan helpen bij het begrijpen van de mechanismen van de hittestressrespons en eiwitkwaliteitscontrole in de amebe Dictyostelium discoideum. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de nauwkeurige en precieze controle van de temperatuur die wordt toegepast tijdens de beeldvorming van de cellen.
Om de procedure te starten, bereidt u de Dictyostelium-cellen voor zoals gedetailleerd in het tekstprotocol. Splits de cellen de dag vóór de beeldvorming in medium met lage fluorescentie tot 10 000 cellen per milliliter. Oogst vóór de beeldvorming de cellen uit de kweekplaat in LFM en breng vervolgens een adequaat aantal cellen over naar glazen bodemschalen.
Laat de cellen 20 minuten bezinken en vervang vervolgens voorzichtig het gebruikte medium door vers medium om niet-bezonken cellen te verwijderen. Maak beelden van de cellen onder niet-gestresste omstandigheden bij 23 °C en leg minimaal zes gezichtsvelden vast. Neem Z-stacks van maximaal 7 µm op in stappen van 1 tot 0,25 µm om het volledige volume van de cel vast te leggen.
Neem vervolgens een referentiebeeld in brightfield om het totale aantal cellen te bepalen. Stel daarna de temperatuur van de koelkamer in op 30 °C. Zodra het temperatuurdisplay de gewenste waarde heeft bereikt, dient u handmatig opnieuw scherp te stellen in het brightfield-kanaal.
Controleer alle vastgelegde FOV's voordat u met de time-lapse begint, en start vervolgens een time-lapse van vier uur hittestress met een tijdsinterval van vijf tot 10 minuten tussen de tijdspunten. Controleer of de focus correct is tijdens de acquisitie van de eerste twee tijdspunten. Nadat de hittestress is voltooid, verlaagt u de temperatuur terug naar 23 °C.
Wacht tot het temperatuurdisplay is aangepast en stel handmatig opnieuw scherp. Neem vervolgens time-lapse-films op tijdens de herstelfase gedurende acht tot 10 uur met tijdsintervallen van 10 tot 20 minuten. Controleer of de scherpstelling correct is tijdens de acquisitie van het eerste tijdstip.
Begin met het openen van het beeldbewerkingsprogramma dat is uitgerust met de Cell Counter-plugin. Laad de bright-field beeldstack door op Bestand en vervolgens op Openen te klikken. Open daarna de Cell Counter-plugin en laad de beeldstack door op Initialiseren te klikken.
Kies het type tellers door op het juiste vakje te klikken. Tel daarna het totale aantal cellen en sla de markeringen op door op Save Markers te klikken. Zodra de markeringen zijn opgeslagen, laadt u de maximale projectie van de fluorescentie-image hyperstack.
Open de Cell Counter-plugin en laad de markers door op Load Markers te klikken. Kies vervolgens het markertype voor cytosolische foci en tel de cellen. De bestaande markers kunnen als leidraad dienen voor de positie van individuele cellen.
Berekent het aantal tellingen per plakje door op Resultaten te klikken en sla de tellingen vervolgens elders op voor verdere berekeningen. In deze studie werd de distributie van GFP-gelabeld polyglutamine-proteïne Q103 in Dictyostelium-cellen waargenomen. Onder normale groeicondities is Q103-GFP diffuus verdeeld in het cytoplasma.
Tijdens hittestress coalesceert de Q103-GFP-marker tot punctate structuren. Na het wegnemen van de stress en groei onder normale groeiomstandigheden lossen deze structuren op. De herverdeling van Q103-GFP en de vorming van door hittestress geïnduceerde cytosolische foci worden gekwantificeerd met behulp van beeldanalyse.
De representatieve resultaten van de hittestressrespons zijn hier te zien. Het aantal cellen met cytosolische Q103-GFP-foci neemt toe bij aanhoudende hittestress. Tijdens hittestress raakt het systeem voor eiwitkwaliteitscontrole overbelast, waardoor aggregatiegevoelige eiwitten niet in een oplosbare toestand kunnen worden gehouden.
Na hittestress neemt het aantal cellen met cytosolische foci af, wat suggereert dat de geaggregeerde eiwitten oplossen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u hittestress-geïnduceerde verstoringen in de amoebe Dictyostelium discoideum kunt monitoren. Tijdens het beeldvormen is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de focus correct is ingesteld, indien uw microscoop niet over een hardwarematige autofocus beschikt.
De temperatuurregeling die in dit protocol wordt getoond, kan ook buiten het gebied van de hittestressrespons worden gebruikt. Beeldvorming onder normale groeicondities met behulp van temperatuurregeling kan fototoxische effecten aanzienlijk verminderen.
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe beeldgevingsmethodologie om temperatuur-geïnduceerde eiwitaggregatie en cellulaire stressrespons in de sociale amoebe Dictyostelium discoideum te onderzoeken. De techniek maakt een nauwkeurige temperatuurregeling mogelijk, waardoor onderzoekers de effecten van hittestress op de kwaliteitscontrole van eiwitten kunnen observeren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
- Proteïneaggregatie
Achtergrond
- Dictyostelium discoideum dient als modelorganisme voor het bestuderen van cellulaire reacties op stress.
- Inzicht in eiwitmisfolding is cruciaal voor het begrijpen van diverse ziekten.
- Hittestress kan leiden tot eiwitaggregatie, wat de cellulaire functie beïnvloedt.
- Beeldvormingstechnieken zijn essentieel voor de real-time observatie van cellulaire processen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode om door hittestress geïnduceerde cellulaire perturbaties te observeren.
- Het verhelderen van de mechanismen van de hittestressrespons in D. discoideum.
- Het beoordelen van de effectiviteit van eiwitkwaliteitscontrole onder stresscondities.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van Dictyostelium-cellen in medium met lage fluorescentie.
- Beeldbestemming bij gecontroleerde temperaturen (23°C en 30°C).
- Time-lapse imaging om cellulaire responsen over meerdere uren te monitoren.
- Beeldanalyse om proteïneaggregatie en herstel te kwantificeren.
Belangrijkste resultaten
- Het Q103-GFP-eiwit vertoonde een diffuse distributie onder normale omstandigheden.
- Tijdens hittestress vormde Q103-GFP punctate structuren, wat duidt op aggregatie.
- Na de stress nam het aantal cellen met aggregaten af, wat wijst op herstel.
- De methode demonstreerde succesvol de dynamiek van eiwitaggregatie en -dissolutie.
Conclusies
- De beeldvormingstechniek biedt inzichten in cellulaire stressresponsen.
- Temperatuurbeheersing is cruciaal voor een nauwkeurige observatie van proteïnedynamiek.
- Deze methodologie kan worden toegepast op andere gebieden van cellulair stressonderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Temperatuurgecontroleerde live-cell imaging in Dictyostelium discoideum maakt een nauwkeurige analyse mogelijk van mechanismen voor kwaliteitscontrole van eiwitten onder stress, wat vroegtijdige validatie van targets voor eiwitaggregatiepaden ondersteunt. Deze benadering vergroot de voorspellende betrouwbaarheid in mechanistische studies die relevant zijn voor neurodegeneratie en proteostase. Het vermogen van deze methode om fototoxiciteit te verminderen en dynamische eiwitaggregatie te kwantificeren, biedt bruikbare inzichten voor portfolio-triage binnen de discovery biology.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe observatie mogelijk van de dynamiek van eiwitaggregatie in een levend, stress-responsief model.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door cellulaire responsen op hitte-geïnduceerde proteotoxische stress te kwantificeren.
- Faciliteert functionele validatie van targets voor eiwitkwaliteitscontrole die relevant zijn voor aggregatieziekten.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt een gevalideerd beeldvormingsprotocol voor het kwantificeren van eiwitaggregatie- en oplossingsgebeurtenissen.
- Vermindert fototoxiciteit, waardoor hogere beeldintensiteiten mogelijk zijn voor eiwitten met een lage expressie.
- Ondersteunt reproduceerbare, kwantitatieve resultaten die geschikt zijn voor downstream screening-workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Komt overeen met ziekterelevante mechanismen van eiwitmisvouwing en aggregatie.
- Maakt continuïteit mogelijk van mechanistische studies in de ontdekkingsfase tot de ontwikkeling van preklinische modellen.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor de verdere ontwikkeling van therapeutica die gericht zijn op aggregatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit beeldvormingsprotocol is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege mechanistische studies tot preklinische validatie van doelen voor eiwitaggregatie.
- Discovery Biology: Kwantificeert door hittestress geïnduceerde eiwitaggregatie, wat inzicht geeft in proteostase-paden.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve aggregatiemetrieken voor de ontwikkeling van assays.
- Analytics: Biedt tellingen van aggregatiegebeurtenissen en hersteldynamiek op celniveau.
- Translationeel onderzoek: Modelleert ziekterelevante stressreacties voor de afstemming van biomarkers.
- Enterprise Reuse: Biedt een gestandaardiseerd, aanpasbaar protocol voor diverse kwaliteitscontrolestudies van eiwitten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van targets voor eiwitaggregatiepaden.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door gestandaardiseerde beeldvorming en analyse.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door het leveren van kwantitatieve, mechanistische gegevens over proteostase.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van programma's die gericht zijn op aggregatie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in live cell imaging en kwantitatieve beeldanalyse.
- Vereist temperatuurgecontroleerde microscopie en compatibele analysesoftware.
- Maakt standaardisatie tussen teams noodzakelijk voor beeldparameters en datainterpretatie.
- Aanpasbaar aan andere aggregatiegevoelige eiwitmodellen door optimalisatie van het protocol.
- Hoge celmotiliteit en gevoeligheid voor fototoxiciteit vereisen een zorgvuldig experimenteel ontwerp.
