Het bestuderen van de Protein Quality Control System van D. discoideum Met behulp van Temperatuur gecontroleerde live cell imaging
2 december 2016
De sociale amoeben Dictyostelium discoideum is onlangs vastgesteld als een systeem om eiwitmisvouwen en proteostase te bestuderen. Hier beschrijven we een nieuwe op beeldvorming gebaseerde methodologie om temperatuur-geïnduceerde eiwitaggregatie en de cellulaire stressrespons in D. discoideum te bestuderen.
Het algemene doel van deze beeldvormingstechniek is om door hittestress geïnduceerde cellulaire verstoringen in Dictyostelium discoideum-cellen te observeren. Deze methode kan helpen om de mechanismen van de hittestressrespons en eiwitkwaliteitscontrole in de amoebe Dictyostelium discoideum te begrijpen. Het grote voordeel van deze techniek is de strakke en nauwkeurige controle van de temperatuur die op de cellen wordt toegepast tijdens de beeldvorming.
Om de procedure te beginnen, bereid Dictyostelium-cellen voor zoals beschreven in het tekstprotocol. De dag voor de beeldvorming, verdeel de cellen in een laagfluorescentiemedium tot 10.000 cellen per milliliter. Voor de beeldvorming, verzamel de cellen van de weefselplaat in LFM en breng vervolgens een voldoende aantal cellen over naar glazen schoteltjes met een glazen bodem.
Laat de cellen 20 minuten bezinken en vervang vervolgens voorzichtig het gebruikte medium door vers medium om niet-bezonken cellen te verwijderen. Beeld cellen onder niet-gestresste omstandigheden af bij 23 graden Celsius, verzamel minimaal zes gezichtsvelden. Verzamel Z-stacks van maximaal zeven micrometer in stappen van één tot 0,25 micrometer om het hele volume van de cel vast te leggen.
Verzamel vervolgens een referentie lichtveldafbeelding om het totale aantal cellen te beoordelen. Pas vervolgens de temperatuur van de koelkamer aan tot 30 graden Celsius. Nadat de temperatuurweergave de gewenste waarde heeft bereikt, stel de focus handmatig in op het lichtveldkanaal.
Controleer alle opgenomen FOV's voordat u begint met de time-lapse, start vervolgens een time-lapse voor vier uur hittestress met een tijdsinterval van vijf tot 10 minuten tussen de tijdstippen. Controleer of de focus correct is tijdens de opname van de eerste twee tijdstippen. Nadat de hittestress voltooid is, zet de temperatuur terug naar 23 graden Celsius.
Wacht tot de temperatuurweergave zich aanpast en stel vervolgens handmatig de focus in. Neem vervolgens time-lapse films op tijdens de herstelfase gedurende acht tot 10 uur met tijdsintervallen van 10 tot 20 minuten. Controleer of de focus correct is tijdens de opname van het eerste tijdstip.
Begin met het openen van het beeldverwerkingspakket dat is uitgerust met de Cell Counter-plug-in. Laad de lichtveldbeeldstapel door op Bestand te klikken en vervolgens Openen. Open vervolgens de Cell Counter-plug-in, laad de beeldstapel door op Initialiseren te klikken.
Kies het type tellers door op het juiste vakje te klikken. Tel vervolgens het totaal aantal cellen, sla de markers op door op Markers opslaan te klikken. Zodra de markers zijn opgeslagen, laadt u de maximale projectie van de fluorescentiebeeldhyperstapel.
Open de Cell Counter-plug-in en laad de markers door op Markers laden te klikken. Kies vervolgens het markertype voor cytosolische foci en tel de cellen. De bestaande markers kunnen als richtlijn worden gebruikt voor de positie van individuele cellen.
Haal het aantal tellingen per plak op door op Resultaten te klikken en sla de tellingen elders op voor verdere berekeningen. In deze studie werd de verdeling van GFP-gelabeld polyglutamine-eiwit Q103 waargenomen in Dictyostelium-cellen. Onder normale groeiomstandigheden is Q103-GFP diffuus verdeeld in het cytoplasma.
Tijdens hittestress coalisceert de Q103-GFP-marker tot gepuncteerde structuren. Bij stressverlichting en groei onder normale groeiomstandigheden, lossen deze structuren op. De herverdeling van Q103-GFP en vorming van door hittestress geïnduceerde cytosolische foci wordt gekwantificeerd met behulp van beeldanalyse.
De representatieve resultaten van de hittestressrespons zijn hier te zien. Het aantal cellen met cytosolische Q103-GFP-foci neemt toe met voortdurende hittestress. Tijdens hittestress is het eiwitkwaliteitscontrolesysteem overweldigd, waardoor aggregatiegevoelige eiwitten niet in een oplosbare toestand kunnen worden gehandhaafd.
Na hittestress neemt het aantal cellen met cytosolische foci af, wat suggereert dat de geaggregeerde eiwitten oplossen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u hittestress-geïnduceerde verstoringen in de amoebe Dictyostelium discoideum kunt monitoren. Tijdens de beeldvorming is het belangrijk om te onthouden om ervoor te zorgen dat de focus correct is ingesteld, als uw microscoop geen hardware autofocus heeft.
De temperatuurregeling die in dit protocol wordt getoond, kan worden gebruikt buiten het gebied van hittestressrespons. Beeldvorming onder normale groeiomstandigheden met behulp van temperatuurregeling kan fototoxische effecten aanzienlijk verminderen.
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe beeldvormingsmethodologie om temperatuurinduceerde eiwitaggregatie en cellulaire stressresponsen in de sociale amoebe Dictyostelium discoideum te onderzoeken. De techniek maakt nauwkeurige temperatuurregeling mogelijk, waardoor onderzoekers de effecten van hittestress op eiwitkwaliteitscontrole kunnen observeren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Neurowetenschappen
- Eiwitaggregatie
Achtergrond
- Dictyostelium discoideum dient als modelorganisme voor het bestuderen van cellulaire reacties op stress.
- Het begrijpen van eiwitmisvouwing is cruciaal voor inzichten in verschillende ziekten.
- Hittestress kan leiden tot eiwitaggregatie, wat de celfunctie beïnvloedt.
- Beeldvormingstechnieken zijn essentieel voor real-time observatie van cellulaire processen.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het observeren van door hittestress geïnduceerde cellulaire verstoringen.
- Om de mechanismen van hittestressrespons in D. discoideum te verduidelijken.
- Om de effectiviteit van eiwitkwaliteitscontrole onder stresscondities te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van Dictyostelium-cellen in laag fluorescentiemedium.
- Beeldvorming onder gecontroleerde temperaturen (23°C en 30°C).
- Time-lapse beeldvorming om cellulaire reacties over enkele uren te monitoren.
- Beeldanalyse om eiwitaggregatie en herstel te kwantificeren.
Belangrijkste resultaten
- Q103-GFP-eiwit vertoonde een diffuse verdeling onder normale omstandigheden.
- Tijdens hittestress vormde Q103-GFP puntvormige structuren die aggregatie aangeven.
- Na de stress nam het aantal cellen met aggregaten af, wat herstel suggereert.
- De methode toonde succesvol de dynamica van eiwitaggregatie en oplossing.
Conclusies
- De beeldvormingstechniek biedt inzichten in cellulaire stressresponsen.
- Temperatuurregeling is cruciaal voor nauwkeurige observatie van eiwitdynamica.
- Deze methodologie kan worden toegepast op andere gebieden van cellulaire stressonderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Temperature-controlled live cell imaging in Dictyostelium discoideum enables precise interrogation of protein quality control mechanisms under stress, supporting early-stage target validation for protein aggregation pathways. This approach enhances predictive confidence in mechanistic studies relevant to neurodegeneration and proteostasis. The method's ability to reduce phototoxicity and quantify dynamic protein aggregation provides actionable insights for portfolio triage in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of protein aggregation dynamics in a live, stress-responsive model.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cellular responses to heat-induced proteotoxic stress.
- Facilitates functional validation of protein quality control targets relevant to aggregation disorders.
Screening & Assay Development
- Provides a validated imaging protocol for quantifying protein aggregation and dissolution events.
- Reduces phototoxicity, allowing higher imaging intensities for low-expression proteins.
- Supports reproducible, quantitative readouts suitable for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms of protein misfolding and aggregation.
- Enables continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical model development.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for aggregation-targeted therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical validation of protein aggregation targets.
- Discovery Biology: Quantifies heat stress-induced protein aggregation, clarifying proteostasis pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative aggregation metrics for assay development.
- Analytics: Provides cell-level counts of aggregation events and recovery dynamics.
- Translational Research: Models disease-relevant stress responses for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable protocol for diverse protein quality control studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation for protein aggregation pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized imaging and analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing quantitative, mechanistic data on proteostasis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of aggregation-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging and quantitative image analysis.
- Demands temperature-controlled microscopy and compatible analytical software.
- Necessitates cross-team standardization for imaging parameters and data interpretation.
- Adaptable to other aggregation-prone protein models with protocol optimization.
- High cell motility and phototoxicity sensitivity require careful experimental design.
