Name: Het bestuderen van de Protein Quality Control System van D. discoideum Met behulp van Temperatuur gecontroleerde live cell imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Leer temperatuur-gecontroleerde live cell imaging voor eiwitkwaliteitscontrole in Dictyostelium discoideum. Deze methode maakt precieze observatie van warmtestress en eiwitaggregatie mogelijk voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs hebben geen Dankbetuigingen.

1. Celbereiding <ol><li> groeiende cellen <ol><li> Grow D. discoideum cellen in AX medium bij 23 ° C onder licht in weefselkweekplaten. Vermijd het houden van cellen bij hoge dichtheden boven 75% samenvloeiing. OPMERKING: Voor een optimale reactie hittestress, cellen moeten in de exponentiële groeifase en niet stationaire fase bereikt. </li><li> De dag voor beeldvorming, splitsen cellen in lage fluorescentie medium (LFM) tot 1 x 10 4 cellen / ml. OPMERKING: Deze stap is nodig om de achtergrond fluorescentie veroorzaakt door de AX medium te verminderen. De incubatietijd kan worden teruggebracht tot een minimum van 2 uur. Echter, blaasjes opgenomen in AX medium kan nog steeds het genereren van wat achtergrondinformatie signaal na 2 uur. </li></ol></li><li> De voorbereiding van cellen voor microscopie <ol><li> Voor de beeldvorming, oogst cellen uit het weefsel plaat LFM en breng een voldoende aantal cellen in glazen bodem gerechten. OPMERKING: Meestal1 x 10 5 cellen / ml voldoende; Indien de experimentele opstelling vereist lange imaging perioden (langer dan 8 uur), moet celaantallen zorgvuldig worden aangepast, zoals D. discoideum cellen zullen overgaan naar de ontwikkelingscyclus en begint te streamen en geaggregeerde als mobiele nummers zijn hoog, terwijl voedingsstoffen zijn laag. </li><li> Laat de cellen te regelen voor 20 min. Verwijder niet-afgewikkeld cellen door voorzichtig het gebruikte medium te vervangen door vers medium. </li></ol></li></ol> 2. Imaging OPMERKING: Het protocol kan worden gebruikt breedveldbeeld systemen en in confocale microscopie opstellingen. Het gebruik van een thermisch geïsoleerde incubatie box die de doelstellingen en de microscooptafel nuttig, maar niet essentieel voor de temperatuurregeling. De temperatuur van de incubatie box is ingesteld op de hoogste temperatuur gebruikt bij het experiment, bijvoorbeeld tot 40 ° C onder hittestress wordt uitgevoerd. Anders wordt de temperatuur ingesteld op 256; C. Temperatuurveranderingen moeten vooraf worden gemaakt om het systeem aan te passen, zoals temperatuurschommelingen tijdens beeldvorming de focus kan beïnvloeden. LET OP: Tijdens de beeldvorming, wordt de temperatuur geregeld met behulp van een koelkamer. De standaardtemperatuur voor het afbeelden van niet-zelfdragende cellen 23 ° C. Voor hittestress condities wordt de temperatuur dienovereenkomstig verhoogd tot het gewenste niveau. Het piëzo-element in de koelkamer kan zeer snel reageert op temperatuurverandering. Toch zal de focus van de afbeeldingen enigszins veranderen (kan afwijken naar maximaal 20 urn, afhankelijk van de temperatuur shift). Zo handmatige heroriëntatie nodig is binnen de eerste minuten van het beeld overname, tenzij de gebruikte microscoop is uitgerust met een hardware auto-focus. <ol><li> Afbeelding acquisitie onder niet-gestreste omstandigheden <ol><li> Afbeeldingscellen onder niet-gestreste omstandigheden bij 23 ° C verkrijgen minste 6 gezichtsveld (EPB). LET OP: Non-stress-aandoening kan worden visualized hetzij door het opnemen van een korte time-lapse (5-30 min) of verwerving van representatieve stills. Voor elke voorwaarde of cellijn verwerven van een minimum van 6 gezichtsveld (EPB). OPMERKING: Indien individuele cellen van belang, plaatst de respectievelijke cellen in het midden van het beeldveld en neem een 3 x 3 tile serie met de FOV met de cellen van belang in het midden D.. discoideum cellen zijn beweeglijk en kunnen migreren uit de FOV. Echter, de 3 x 3 tegels serie vergroot het potentieel onderzocht door de cel van belang en het blijft traceerbaar voor time-lapse periodes van ~ 6 uur. </li><li> Acquire z-stacks van maximaal 7 micrometer in 1-0,25 micrometer stappen om het gehele volume van de cel vast te leggen. </li><li> Acquire image een verwijzing veld helder tot het totale aantal cellen te bepalen. </li></ol></li><li> Afbeelding aanwinst voor hittestress <ol><li> Regel de temperatuur van de koelkamer tot 30 ° C volgens de instructies van de fabrikant. &lt;/ Li&gt; <li> Nadat de temperatuur scherm de gewenste waarde heeft bereikt, heroriënteren handmatig in het heldere gebied kanaal en laat alle geregistreerde EPB voor aanvang van de time-lapse. </li><li> Start een time-lapse gedurende 4 uur van hittestress met een tijdsinterval van 5-10 minuten tussen de tijdstippen. Controleer de juiste focus tijdens de overname van de eerste twee tijdstippen. </li></ol></li><li> Afbeelding overname tijdens het herstel <ol><li> Na hittestress, verlagen de temperatuur terug tot 23 ° C, wacht tot de temperatuur weergave aan te passen en met de hand te heroriënteren. </li><li> Record time-lapse filmpjes in de herstelfase voor 8-10 uur in 10-20 min tijdsintervallen. Controleer de juiste focus tijdens de overname van het eerste tijdstip. </li></ol></li></ol> 3. Beeldanalyse Opmerking: Om het aantal cellen die cytosolische foci kwantificeren, het totale aantal cellen en het aantal cellen met cytosolische foci telkens beoordelenframe. Vanwege de moeilijkheid segmenteren cellen van helderveld beelden, de kwantificering moet handmatig gebeuren. Hierna wordt beschreven gegevensanalyse een vrije beeldverwerking pakket ((http://fiji.sc/Fiji). Het vereist de plugin &quot;Cell Counter&quot; (http://fiji.sc/Cell_Counter). <ol><li> Het beoordelen van het totale aantal cellen <ol><li> Laad de heldere beeldveld stapel (XYT) door te klikken op &quot;File&quot; en &quot;Open&quot;. </li><li> Open de &quot;Cell Counter&quot; plugin ( &quot;Plugins&quot; - &quot;Cell Counter&quot;). Laad de afbeelding stapel door te klikken op &quot;initialiseren&quot;. </li><li> Kies de juiste aard van de tellers door het aanvinken van het betreffende vakje. LET OP: het type gebruik 1 als teller voor totale aantal cellen en type 2 als teller voor cellen met cytosolische brandpunten. Tel alle cellen. </li><li> Sla de markers door te klikken op &quot;Save Markers&quot;. </li></ol></li><li> Het beoordelen van het aantal cellen met cytosolische brandpunten <ol> &lt;li&gt; Laad de afbeelding fluorescentie HyperStack (XZYT) ( &quot;File&quot; - &quot;Open&quot;) en maak een maximale intensiteit projectie met behulp van de &quot;Z-Projector&quot; (Image / Stacks). </li><li> Open de &quot;Cell Counter&quot; plugin. Laad de resulterende beeld stapel (XYT) door te klikken op &quot;initialiseren&quot;. </li><li> Laad de markeringen door te klikken op &quot;Load Markers&quot;. LET OP: De bestandsnamen verwijzing imago en de fluorescentie stapel het van moeten identiek zijn. Indien nodig, een andere naam geven bijgevolg voor het initialiseren van het beeld stack. </li><li> Kies het juiste type markering (zie 3.1.3) en te tellen cellen met cytosolische brandpunten. De bestaande markers worden gebruikt als leidraad voor de positie van afzonderlijke cellen. </li><li> Ophalen van het aantal tellingen per slice door te klikken op &quot;resultaten&quot; en sla de graven elders voor verdere berekeningen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bonner, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+Formation+of+Cell+Aggregates+by+Chemotaxis+in+the+Development+of+the+Slime+Mold+Dictyostelium+Discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum.</a> Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).</li>
<li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Developmental Biology. 391 (1), 1-16 (2014).</li>
<li>Nichols, J. M. E., Veltman, D., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+a+model+organism%3A+progress+with+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of a model organism: progress with Dictyostelium.</a> Current Opinion in Cell Biology. 36, 7-12 (2015).</li>
<li>Williams, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictyostelium+finds+new+roles+to+model%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dictyostelium finds new roles to model.</a> Genetics. 185 (3), 717-726 (2010).</li>
<li>Müller-Taubenberger, A., Kortholt, A., Eichinger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+system+-+substantial+share%3A+The+use+of+Dictyostelium+in+cell+biology+and+molecular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Simple system - substantial share: The use of Dictyostelium in cell biology and molecular medicine.</a> European Journal of Cell Biology. 92 (2), 45-53 (2013).</li>
<li>Malinovska, L., Palm, S., Gibson, K., Verbavatz, J. M., Alberti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictyostelium+discoideum+has+a+highly+Q%2FN-rich+proteome+and+shows+an+unusual+resilience+to+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dictyostelium discoideum has a highly Q/N-rich proteome and shows an unusual resilience to protein aggregation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2620-E2629 (2015).</li>
<li>Malinovska, L., Alberti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding+in+Dictyostelium%3A+Using+a+freak+of+nature+to+gain+insight+into+a+universal+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding in Dictyostelium: Using a freak of nature to gain insight into a universal problem.</a> Prion. 9 (5), 339-346 (2015).</li>
<li>Schneider, K., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+protein+quality+control+catastrophes+-+from+cells+to+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Surviving protein quality control catastrophes - from cells to organisms.</a> Journal of Cell Science. 128 (21), 3861-3869 (2015).</li>
<li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+and+misfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein folding and misfolding.</a> Nature. 426 (6968), 884-890 (2003).</li>
<li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar-overlay+immunofluorescence%3A+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods in cell biology. 28, 347-356 (1987).</li>
<li>Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+spinning+disk+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Techniques%22%5BJournal%5D)">Live cell spinning disk microscopy.</a> Microscopy Techniques. 95, 57-75 (2005).</li>
<li>Samereier, M., Meyer, I., Koonce, M. P., Graef, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Cell-Imaging+Techniques+for+Analyses+of+Microtubules+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Live Cell-Imaging Techniques for Analyses of Microtubules in Dictyostelium.</a> Methods in cell biology. 97, 341-357 (2010).</li>
<li>Herman, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary+phase+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Stationary phase in yeast.</a> Current opinion in microbiology. 5 (6), 602-607 (2002).</li>
<li>Loomis, W. F., Wheeler, S., Wheeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+response+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Heat shock response of Dictyostelium.</a> Developmental Biology. 79 (2), 399-408 (1980).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven protocol kan worden gebruikt om het gedrag van een bepaalde proteïne van belang te bestuderen in reactie op door warmte opgewekte spanning. Temperatuurstijging tot 30 ° C gerapporteerd hittestress respons veroorzaken onder deze omstandigheden de levensvatbaarheid van D. discoideum wordt duidelijk verminderd. wijzigingen Het protocol kan worden aangepast aan het gedrag van verschillende eiwitten te vergelijken onder dezelfde stressomstandigheden. Hiervoor worden cellen die verschillende eiwitten met dezelfde fluorescerende tag overgebracht in meerdere putjes, zoals vier kamer schotels (sectie 1.3.1). Het protocol kan ook worden toegepast op cellen co-expressie eiwitten met verschillende merkers, zoals GFP of RFP. Dit kan bijvoorbeeld gebruikt om het gedrag van de verschillende componenten van het proteïne kwaliteitscontrole (PQC) wordt gecontroleerd. Cellen die GFP-gemerkte aggregatie marker en anders-RFP tag PCQ componenten kunnen worden waargenomen met behulp van multi-wellvoorgeschoteld voor beeldvorming. Dit zorgt voor dezelfde stress-condities (snelheid van de temperatuur verhogen / verlagen, de duur van de temperatuur stijging / daling) en zorgt voor een vergelijkende studies. Bovendien kan het protocol worden gebruikt om de invloed van de PQC systeem de hittestress respons studie. De activiteit van de componenten kan worden gemoduleerd door het veranderen van expressieniveaus met behulp van genetische hulpmiddelen zoals het uitschakelen of overexpressie of door toepassing van commercieel beschikbare specifieke inhibitoren 6. Het proteasoom kan worden geremd door toevoeging van MG132 (100 uM) of lactacystine (10 uM) aan het groeimedium. De chaperone Hsp90 kan worden geremd via geldanamycine (6 uM) of radicicol (10 uM). De chaperone Hsp70 kan worden geremd VER-155.088, maar konden niet de effectiviteit van de remming in experimentele instellingen dusver bevestigen. Remmers moet een dag voor beeldvorming worden toegevoegd en de cellen worden gedurende 14 uur. Criti<html> cal Stappen binnen het Protocol De kritische stap voor de beoordeling van warmte-geïnduceerde verstoring is de toestand van de cellen voorafgaand aan de beeldvorming experiment. Studies in gist bleek dat cellen verwerven resistentie tegen verschillende omgevingsstressen gedurende stationaire fase 13. We zagen ook een minimale respons op toegepast hittestress indien D. discoideum cellen had stationaire fase bereikt voorafgaand aan beeldvorming. Dus een constante celaantal &lt;5 x 10 5 cellen / ml is cruciaal. Bovendien kunnen hoge celaantallen overgang induceren van de vegetatieve cyclus van D. discoideum de ontwikkelingscyclus, waardoor triggering honger paden, wat kan leiden tot een andere reactie op stress te verwarmen. Indien hoge cel aantallen worden bereikt in de herstelfase na hittestress, streaming en aggregeren cellen kunnen interfereren met data-analyse als de cellen uit te gaan van de focus (zie figuur 4). content &quot;&gt; Beperking van de Techniek Het verlies van focus is de bottleneck van het protocol. Tijdens de temperatuur verandert, kan de focal plane drastisch te verschuiven, die handmatig heroriëntatie in een periode onmiddellijk na het wijzigen van de temperatuur vereist. De sprong in de focus kan soms te extreem worden overwonnen door software autofocus, vooral als de tijd tussen de tijdstippen hoog. Indien de gebruikte microscoop is uitgerust met een hardware autofocus, bottleneck kan worden omzeild. Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande methoden In vergelijking met bestaande instellingen zoals het gebruik van kamers met airconditioning, temperatuur-gecontroleerde incubatie dozen met betrekking tot de doelstellingen en de microscoop podium of temperatuurgestuurde podia en objectieve kragen, het gebruik van een koelkamer zorgt voor een meer nauwkeurige controle van de omgevingslucht temperatuur. Het Peltier-element in de koelkamer kan een constante en gelijkmatige tem handhavenperatuur gedurende de experimentele opstelling. In de klassieke opstellingen, kan de lokale temperatuur verschillen leiden tot verschillende uitkomsten observatie. Bovendien kan het snel en snel op geïnduceerde veranderingen in de temperatuur, wanneer klassieke opstellingen langzaam passen geïnduceerde temperatuurveranderingen, met name de temperatuur te verlagen. Het Peltier-element in de koelkamer kan ook betrekking hebben op een groter temperatuurbereik (15-40 ° C) dan klassieke opstellingen, waarmee bereikt temperaturen zoals 15 ° C of 40 ° C is erg moeilijk. Dictyostelium discoideum is bijzonder gevoelig voor foto-toxiciteit. Eerdere studies gebruikt ascorbaat als straatveger van de foto-toxiciteit te verminderen. Echter, lang imaging periodes vereisen extra suppletie. Bovendien is het gebruik van ascorbaat beperkt tot studies waarbij het mechanisme van belang niet wordt beïnvloed door de antioxidantsupplement. Wij stellen temperatuurgeregelde beeldvorming kan worden gebruikt als alternatief ca.oach foto-toxiciteit te minimaliseren en kan worden gecombineerd met toevoeging van ascorbaat toxiciteit verder afnemen. Fototoxische effecten kunnen worden geminimaliseerd door een constante en gelijkmatige temperatuur van 23 ° C met een koelkamer. Cellen afgebeeld met behulp temperatuurregeling vertonen minder tekenen van foto-toxiciteit, zoals celronding gedurende een langere tijdsperiode. Dit maakt het ook mogelijk beeldvorming met hogere intensiteiten, kleinere tijdsintervallen of meerdere gezichtsvelden (EPB). General Application Hittestress bij hogere temperaturen is aangetoond dat een andere warmte stressrespons 14 veroorzaken. Daarom verhogen van de temperatuur tot 34 ° C of 37 ° C kan een ander induceren. Naast de aangebrachte thermische belasting, kan de duur van een bepaalde stress-situatie worden aangepast aan de onmiddellijke respons of langdurige aanpassing aan hittestress bestuderen. In het algemeen kunnen de beschreven protocol wordenuitgebreid tot een brede reeks van toepassingen. Omdat de nauwkeurige temperatuurregeling reduceert fototoxische effecten, kan het protocol worden gebruikt in instellingen die een hoge belichtingstijden en / of hogere excitatie lichtintensiteit, bijvoorbeeld voor het visualiseren van eiwitten met een lage expressieniveau vereisen, of bij korte tijdsintervallen tussen imaging, bijvoorbeeld tijdens de time-lapse imaging. Het kan ook voordelig zijn voor het afbeelden van objecten verspreid over de gehele cel, bijvoorbeeld microtubules, omdat deze instellingen vereisen een hoog aantal optische z-profielen.

Dictyostelium discoideum zijn solitaire bodem levende amoeben die zich voeden met bacteriën en andere micro-organismen, die door fagocytose worden genomen. Het heeft een unieke en opmerkelijke life cycle dat een belangrijk gebied van onderzoek sinds zijn ontdekking 1 is geweest. De vroege belangstelling meercellige ontwikkeling 2 en de moleculaire basis van chemotaxis 3 werd snel aangevuld met studies gericht op celmotiliteit, celpolariteit, aangeboren immuniteit. Bovendien, D. discoideum werd geïntroduceerd als een modelsysteem voor biomedisch onderzoek 4,5. Onlangs hebben we vastgesteld D. discoideum als een nieuw systeem om de proteïne kwaliteitscontrole (PQC) systeem 6,7 bestuderen. Het proteoom is verrijkt in aggregatie-gevoelige prion-achtige eiwitten, die een uitdaging om proteïne kwaliteitscontrole 8 vormt. Om te onderzoeken of D. discoideum heeft speciale moleculaire mechanismen zijn sterk ag controle ontwikkeldCongregatie vatbaar proteoom, bestudeerden we het gedrag van de aggregatie-gevoelige marker eiwitten zowel in normale groeiomstandigheden en tijdens stress. Stresscondities, zoals hittestress, kan worden gebruikt om de snelheid van eiwit misfolding 9 verhogen. Daarom hebben we gezocht naar een systeem waarbij we temperatuurveranderingen konden veroorzaken en tegelijkertijd volgen het gedrag van de marker-eiwitten. Hiervoor combineerden we levende cellen beeldvorming met Peltier-verwarmings- behulp van een thermische trap inzetstuk (koelkamer). Deze methode verkregen we een constante en gelijkmatige temperatuur te handhaven en een snelle en toch nauwkeurige temperatuurverandering induceren. Levende cellen beeldvorming wordt gebruikt om een verscheidenheid van biologische processen in D. bestuderen discoideum. Deze benadering voor twee belangrijke beperkingen. Ten eerste, de cellen een grote beweeglijkheid te geven en de neiging te migreren van het gezichtsveld, dus het volgen van individuele cellen vereist vaak beeldvorming van een groot gebied. De cel mobiliteitverminderd met agar overlay 10, maar deze zijn niet geschikt voor langdurige beeldvorming door een daling in levensvatbaarheid. Ten tweede, D. discoideum cellen een bijzonder hoge gevoeligheid voor foto-toxiciteit, waardoor celronding en mitose 11. Vorige protocollen deze kwestie door de toevoeging van ascorbaat als een radicale scavenger en vermindering van de blootstelling tijden 12. De laatste kan kritisch zijn als het eiwit van interesse tot expressie wordt gebracht op lage niveaus en vertoont een zwak fluorescentiesignaal. De auteurs stellen ook voor om een constante temperatuur van 21 ° C te bieden, hetzij door beeldvorming in een kamer met airconditioning of met behulp van temperatuur-gecontroleerde incubatie dozen, die het doel en de microscoop podium 12 dekken. We beschrijven een werkwijze met een verbeterde temperatuurregeling door een koelkamer ingesteld op 23 ° C. Tijdens het afbeelden van onze set-up verhoogt aanzienlijk de weerstand van de foto-toxiciteit. Hetmaakt het gebruik van hogere blootstelling en hogere excitatie lichtintensiteiten. Dit is met name van belang tijdens de time-lapse imaging, zoals de tijdsintervallen moeten zorgvuldig afgewogen tegen het aantal posities in beeld gebracht en de belichtingstijd gebruikt te worden. De mogelijkheid om het aantal afgebeelde posities verhogen maakt ook de dekking van een groter beeldgebied en vergemakkelijkt het bijhouden van individuele cellen gedurende een langere periode.

<table><tbody><tr><td>AX Medium</td><td>ForMedium</td><td>AXM0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200617</td><td></td></tr><tr><td>Radicicol</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200620</td><td></td></tr><tr><td>MatTek disch 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>glasbodem beeldvormingsschaal</td></tr><tr><td>CellViell cell culture dish</td><td>Greiner</td><td>627870</td><td>4-vaks glasbodem beeldvormingsschaal</td></tr><tr><td>Thermal Stage Heater/Cooler Insert</td><td>Warner Istruments</td><td>TB-3/CCD</td><td></td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Istruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>Liquid cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td></td></tr></tbody></table>

het bestuderen van de protein quality control system van<em&gt; d. discoideum</em&gt; met behulp van temperatuur gecontroleerde live cell imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

De complexe levensstijl van de sociale amoeben Dictyostelium discoideum maakt het een waardevol model voor het bestuderen van verschillende biologische processen. Onlangs hebben we aangetoond dat D. discoideum opmerkelijk veerkrachtig is tegen eiwitaggregatie en kan worden gebruikt om inzichten te verkrijgen in het cellulaire eiwitkwaliteitscontrolesysteem. Echter, het gebruik van D. discoideum als modelsysteem levert verschillende uitdagingen op voor microscopie-gebaseerde experimentele benaderingen, zoals de hoge beweeglijkheid van de cellen en hun gevoeligheid voor fototoxiciteit. Dit laatste blijkt vooral uitdagend te zijn bij het bestuderen van eiwithomeostase, aangezien de fototoxische effecten een cellulaire stressrespons kunnen induceren en dus het gedrag van het eiwitkwaliteitscontrolesysteem kunnen veranderen. 
Temperatuurverhoging is een veelgebruikte manier om cellulaire stress te induceren. Hier beschrijven we een temperatuur-controleerbaar beeldvormingsprotocol, dat het mogelijk maakt om temperatuuromgevingen in D. discoideum te observeren. Bovendien kan dit beeldvormingsprotocol, wanneer toegepast bij normale groeitemperaturen, de fototoxiciteit merkbaar verminderen, waardoor beeldvorming met hogere intensiteiten mogelijk wordt. Dit kan bijzonder nuttig zijn bij het beeldvormen van eiwitten met zeer lage expressieniveaus. Bovendien vereist de hoge mobiliteit van de cellen vaak het verwerven van meerdere gezichtsvelden om individuele cellen te volgen, en het aantal velden moet worden afgewogen tegen het gewenste tijdsinterval en de belichtingstijd.

De beschreven imaging protocol kan worden gebruikt om het gedrag van aggregerende prion-achtige eiwitten analyseren amoeben D. discoideum tijdens hittestress. Figuur 1 toont de verdeling van GFP-gelabeld polyglutamine eiwit Q103 in cellen onder normale groeiomstandigheden (figuur 1A), na 2 uur hittestress bij 30 ° C (Figuur 1B) en na 6 uur stress herstel en groei bij normale groeiomstandigheden (figuur 1C). Bij temperatuurverhoging van 23 ° C tot 30 ° C, de Q103-GFP merker samensmelt een diffuse verdeling structuren punctata. Bij stress los te laten en de groei bij normale temperatuur, deze structuren te ontbinden. De herverdeling van Q103-GFP en broei stress geïnduceerde cytosolische foci kunnen worden gekwantificeerd met behulp van beeldanalyse. Figuur 2A toont de analyse van individuele EPB gebruik Fiji en de plugin &quot;Cell teller &quot;. Figuur 2B toont de kwantificering van de warmte stressrespons. Hieruit blijkt dat de cytosolische Q103-GFP foci toename van het aantal met aanhoudende hittestress. Tijdens hittestress, van de proteïne kwaliteitscontrole (PQC) systeem overweldigd, dus aggregation- gevoelig eiwitten zoals het prion-achtige eiwit Q103 kan in een oplosbare toestand gehouden en steeds aggregaat in cytosolische foci. de cellen een kenmerkende ronding tonen ook, zoals weergegeven in Figuur 1B. de vermindering van cytosolische foci na belasting verwijdering suggereert dat de geaggregeerde proteïnes opgelost. De beeldkwaliteit is gevoelig voor de initiële celdichtheid. Figuur 3 toont een voorbeeld van cellen na herstel spanning, vergelijkt passende initiële celdichtheid (figuur 3A) en hoge initiële celdichtheid (Figuur 3B). Als de eerste cel dichtheid te hoog was, cellen sterted te stromen te vormen zoals weergegeven in figuur 3b. Dit die moeilijkheden op de verdere kwantificering van de cellen legt zijn uit de focal plane verplaatst. De beschreven werkwijze kan worden gebruikt om de temperatuur veroorzaakte veranderingen volgen zoals hierboven beschreven. Het kan ook worden gebruikt voor foto-toxiciteit verminderen bij beeldvorming bij fysiologische groeitemperatuur. Figuur 4 vergelijkt cel afgebeeld bij 23 ° C in een koelkamer (Figuur 4A) en cellen afgebeeld zonder temperatuurregeling in een geklimatiseerde ruimte, stelt tot 25 ° C (figuur 4B). Bij constante blootstelling aan het excitatielicht, cellen ronde omhoog wanneer niet onder temperatuur-gecontroleerde omstandigheden afgebeeld. Deze verandering in cel vorm aangeeft stress. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> Figuur 1: <strong&gt; Aggregation-prone prion-achtige eiwitten veranderen hun cellulaire verdeling tijdens hittestress. GFP-tag polyglutamine-rijke huntingtine exon 1 (Q103) wordt constitutief tot expressie gebracht in AX2-214 D. discoideum cellen (GFP signaal, zoals weergegeven in omgekeerde grijsschaal opzoektabel). (A) Onder normale groeiomstandigheden bij 23 ° C, Q103-GFP is diffuus verdeeld in het cytoplasma. (B) Na 2 h hittestress bij 30 ° C, Q103-GFP samensmelt in cytosolische foci (rode pijlen). De cellen vertonen een karakteristieke vorm verandering en afronden. (C) Bij stressverlichting en groei bij 23 ° C, de cytosolische foci worden opgelost. Na 6 uur, geen cytosolische foci worden waargenomen. Schaal bar = 10 micrometer. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Figuur 2: Kwantificering van warmte-geïnduceerde cytosolische foci formatie (A) Analyse van cellen met behulp van de gratis image-processing pakket Fiji en de plugin &quot;Cell Counter&quot;.. De totale hoeveelheid cellen (type 1, blauw teller markeringen) wordt bepaald imago van de heldere veld in. De markers zijn geladen in de GFP-kanaal en het aantal cellen met cytosolische foci (type 2, rood tegen markers) bepaald. (B) Kwantificering van foci na 3 uur van hittestress bij 30 ° C en 3 uur van stress herstel bij 23 ° C (n = 4 gezichtsveld, error bar = SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html> g&gt; Figuur 3: Effect van de celdichtheid op lange termijn time-lapse imaging (A) Cellen afgebeeld bij de eerste celdichtheden &lt;10 5 cellen / ml.. Na 3 h hittestress bij 30 ° C en 6 uur stress terugwinning bij 23 ° C, cellen nog steeds in de vegetatieve cyclus en delen. Slechts enkele cellen verlaat de focal plane. (B) Cellen afgebeeld op initiële celdichtheden&gt; 10 6 cellen / ml. Na 9 uur van beeldvorming (instellingen als in A), hebben de cellen van de ontwikkelingscyclus ingevoerd en begon streaming en aggregeren. Cellen in de aggregaten kan niet duidelijk worden onderscheiden. Een groot deel van de cellen verlaat het brandvlak en kan niet worden geanalyseerd. Schaal bar = 10 micrometer. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <html> .jpg &quot;/&gt; Figuur 4:. Effect van temperatuur op fototoxische effecten (A) Cellen afgebeeld gedurende 10 min met temperatuurregeling bij 23 ° C: 6 gezichtsveld, z-stack (spacing 0,5 uM, monsterdikte 8 uM), time lapse (totaal 10 min, lapse 1 min), GFP-kanaal (0,07 msec belichtingstijd, 10% laser intensiteit), RFP kanaal (0,1 msec belichtingstijd, 10% laser intensiteit). Cellen vertonen geen tekenen van de kenmerkende morfologische veranderingen geassocieerd met fototoxisch stress. (B) Cellen afgebeeld gedurende 10 min zonder temperatuurregeling (dezelfde omstandigheden als in A). Cellen vertonen tekenen van fototoxische geïnduceerde afronding aangeeft stress. Schaal bar = 10 micrometer. De cellen werden afgebeeld op een systeem gebaseerd op een microscoop met een 100x / 1,4 numerieke apertuur (NA) doel. De beelden werden verzameld met een CCD-camera als 1024 x 1024 pixel-bestanden met behulp van 1 x 1 binning.4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

De sociale amoeben Dictyostelium discoideum is onlangs vastgesteld als een systeem om eiwitmisvouwen en proteostase te bestuderen. Hier beschrijven we een nieuwe op beeldvorming gebaseerde methodologie om temperatuur-geïnduceerde eiwitaggregatie en de cellulaire stressrespons in D. discoideum te bestuderen.

Het bestuderen van de Protein Quality Control System van<em&gt; D. discoideum</em&gt; Met behulp van Temperatuur gecontroleerde live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Het algemene doel van deze beeldvormingstechniek is om door hittestress geïnduceerde cellulaire verstoringen in Dictyostelium discoideum-cellen te observeren. Deze methode kan helpen bij het begrijpen van de mechanismen van de hittestressrespons en eiwitkwaliteitscontrole in de amebe Dictyostelium discoideum. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de nauwkeurige en precieze controle van de temperatuur die wordt toegepast tijdens de beeldvorming van de cellen.Om de procedure te starten, bereidt u de Dictyostelium-cellen voor zoals gedetailleerd in het tekstprotocol. Splits de cellen de dag vóór de beeldvorming in medium met lage fluorescentie tot 10 000 cellen per milliliter. Oogst vóór de beeldvorming de cellen uit de kweekplaat in LFM en breng vervolgens een adequaat aantal cellen over naar glazen bodemschalen.Laat de cellen 20 minuten bezinken en vervang vervolgens voorzichtig het gebruikte medium door vers medium om niet-bezonken cellen te verwijderen. Maak beelden van de cellen onder niet-gestresste omstandigheden bij 23 °C en leg minimaal zes gezichtsvelden vast. Neem Z-stacks van maximaal 7 µm op in stappen van 1 tot 0,25 µm om het volledige volume van de cel vast te leggen.Neem vervolgens een referentiebeeld in brightfield om het totale aantal cellen te bepalen. Stel daarna de temperatuur van de koelkamer in op 30 °C. Zodra het temperatuurdisplay de gewenste waarde heeft bereikt, dient u handmatig opnieuw scherp te stellen in het brightfield-kanaal.Controleer alle vastgelegde FOV's voordat u met de time-lapse begint, en start vervolgens een time-lapse van vier uur hittestress met een tijdsinterval van vijf tot 10 minuten tussen de tijdspunten. Controleer of de focus correct is tijdens de acquisitie van de eerste twee tijdspunten. Nadat de hittestress is voltooid, verlaagt u de temperatuur terug naar 23 °C.Wacht tot het temperatuurdisplay is aangepast en stel handmatig opnieuw scherp. Neem vervolgens time-lapse-films op tijdens de herstelfase gedurende acht tot 10 uur met tijdsintervallen van 10 tot 20 minuten. Controleer of de scherpstelling correct is tijdens de acquisitie van het eerste tijdstip.Begin met het openen van het beeldbewerkingsprogramma dat is uitgerust met de Cell Counter-plugin. Laad de bright-field beeldstack door op Bestand en vervolgens op Openen te klikken. Open daarna de Cell Counter-plugin en laad de beeldstack door op Initialiseren te klikken.Kies het type tellers door op het juiste vakje te klikken. Tel daarna het totale aantal cellen en sla de markeringen op door op Save Markers te klikken. Zodra de markeringen zijn opgeslagen, laadt u de maximale projectie van de fluorescentie-image hyperstack.Open de Cell Counter-plugin en laad de markers door op Load Markers te klikken. Kies vervolgens het markertype voor cytosolische foci en tel de cellen. De bestaande markers kunnen als leidraad dienen voor de positie van individuele cellen.Berekent het aantal tellingen per plakje door op Resultaten te klikken en sla de tellingen vervolgens elders op voor verdere berekeningen. In deze studie werd de distributie van GFP-gelabeld polyglutamine-proteïne Q103 in Dictyostelium-cellen waargenomen. Onder normale groeicondities is Q103-GFP diffuus verdeeld in het cytoplasma.Tijdens hittestress coalesceert de Q103-GFP-marker tot punctate structuren. Na het wegnemen van de stress en groei onder normale groeiomstandigheden lossen deze structuren op. De herverdeling van Q103-GFP en de vorming van door hittestress geïnduceerde cytosolische foci worden gekwantificeerd met behulp van beeldanalyse.De representatieve resultaten van de hittestressrespons zijn hier te zien. Het aantal cellen met cytosolische Q103-GFP-foci neemt toe bij aanhoudende hittestress. Tijdens hittestress raakt het systeem voor eiwitkwaliteitscontrole overbelast, waardoor aggregatiegevoelige eiwitten niet in een oplosbare toestand kunnen worden gehouden.Na hittestress neemt het aantal cellen met cytosolische foci af, wat suggereert dat de geaggregeerde eiwitten oplossen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u hittestress-geïnduceerde verstoringen in de amoebe Dictyostelium discoideum kunt monitoren. Tijdens het beeldvormen is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de focus correct is ingesteld, indien uw microscoop niet over een hardwarematige autofocus beschikt.De temperatuurregeling die in dit protocol wordt getoond, kan ook buiten het gebied van de hittestressrespons worden gebruikt. Beeldvorming onder normale groeicondities met behulp van temperatuurregeling kan fototoxische effecten aanzienlijk verminderen.

studying-protein-quality-control-system-d-discoideum-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Werkwijze voor het observeren individuele DNA-moleculen in levende cellen beschreven. De techniek is gebaseerd op de binding van een fluorescent gelabeld lac repressor eiwit bindingsplaatsen ontworpen in het DNA van belang. Deze methode kan worden aangepast aan vele recombinant DNA volgen in levende cellen in de tijd.

Monitoring Plasmide Replicatie in Live zoogdiercellen over meerdere generaties door fluorescentie microscopie

Source: Wagner, K. et al., Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the visualization of membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells using eGFP-tagged TRPL proteins. It details the preparation of transgenic flies for imaging, the capture of fluorescence images of photoreceptor cells, and the quantification of TRPL trafficking by measuring relative eGFP fluorescence in the...

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells

Cellulaire levensvatbaarheid hangt af van een tijdige en efficiënte beheer van eiwit misfolding. Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren van de verschillende potentiële lot van een verkeerd gevouwen eiwitten: hervouwing, afbraak of opslag in insluitsels. We demonstreren het gebruik van een opvouwbare sensor,...

4D beeldvorming van eiwitaggregatie in levende cellen

Time-lapse microscopie van fluorescent gelabelde autofagie markers zorgt voor de opvolging van de dynamische autofagie respons met een hoge temporele resolutie. Met specifieke autofagie en organel markers in een combinatie van 3 verschillende kleuren, kunnen we de bijdrage van een eiwit autophagosome vorming in een robuuste ruimtelijke en temporele context volgen.

Live cell imaging van Vroege Autophagy Evenementen: Omegasomes en Beyond

Om de relatie tussen eiwithomeostase, stress en veroudering te bestuderen, hebben we veranderingen in eiwitvouwing gemonitord door eiwitdisfunctie, eiwitlocalisatie in de cel en eiwitstabiliteit op organismisch, cellulair en eiwitniveau te volgen, met behulp van de genetisch hanteerbare metazoa Caenorhabditis elegans als modelsysteem.

Gebruik Caenorhabditis elegans Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

We beschrijven beeldvormingsbenaderingen we gebruiken om de verdeling en mobiliteit van de getransfecteerde fluorescerende eiwitten in het endoplasmatisch reticulum (ER) inwoner via de confocale beeldvorming van levende cellen te onderzoeken. We hebben ook ultrastructureel analyseren het effect van hun expressie op de architectuur van deze subcellulaire compartiment.

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum subdomeinen bij gekweekte cellen

Studies van biomoleculen in vivo zijn cruciaal voor het begrijpen van moleculaire functie in een biologische context. Hier beschrijven we een nieuwe methode die de internalisatie van fluorescerende biomoleculen, zoals DNA of eiwitten, in levende micro-organismen mogelijk maakt. Analyse van in vivo gegevens opgenomen door middel van fluorescentiemicroscopie wordt ook gepresenteerd en besproken.

Internalisatie en observatie van TL biomoleculen in levende micro-organismen via Electroporatie

Hier beschrijven we methoden voor de beoordeling van de cellulaire reactie op acute mechanische stimulatie. In de microscopie gebaseerde assay onderzoeken we lokalisatie van fluorescently-geëtiketteerden biosensoren na korte stimulatie met schuintrekken stroom. We testen ook activering van verschillende eiwitten van belang in reactie op acute mechanische stimulatie biochemically.

Beoordeling van Dictyostelium discoideum reactie op Acute mechanische stimulatie

Beeldvorming van bacteriële cellen is een opkomende systeembiologiebenadering gericht op het definiëren van statische en dynamische processen die de functie van grote macromoleculaire machines dicteren. Hier wordt integratie van kwantitatieve live celbeeldvorming en cryo-elektronentomografie gebruikt om legionella pneumophila type IV secretiesysteemarchitectuur en -functies te bestuderen.

Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Hier worden niet-invasieve methoden beschreven voor de lokalisatie van fotoreceptormembraaneiwitten en de beoordeling van retinale degeneratie in het drosophila samengestelde oog met behulp van eGFP-fluorescentie.

Onderzoek naar membraaneiwithandel in drosophila-fotoreceptorcellen met behulp van eGFP-gelabelde eiwitten

Leer temperatuur-gecontroleerde live cell imaging voor eiwitkwaliteitscontrole in Dictyostelium discoideum. Deze methode maakt precieze observatie van warmtestress en eiwitaggregatie mogelijk voor celbiologisch onderzoek.

Het bestuderen van de Protein Quality Control System van D. discoideum Met behulp van Temperatuur gecontroleerde live cell imaging (Video) | JoVE Journal

Het bestuderen van de Protein Quality Control System van

Meer video's verkennen