Bepaling van de Relatieve celoppervlak en Total Expressie van recombinant Ion kanalen met flowcytometrie
28 september 2016
Erfelijke hartritmestoornissen worden vaak veroorzaakt door mutaties die de oppervlakte levering van één of meer ionkanalen wijzigen. Hier passen we flowcytometrie assays een kwantificering van de relatieve totale en celoppervlak-eiwit expressie van recombinant ionenkanalen tot expressie gebracht in TSA-201 cellen.
Het algemene doel van deze methode is om de expressie van membraaneiwitten op het celoppervlak te kwantificeren met behulp van een fluorescerende spaced assay. Het grote voordeel van deze techniek is dat flowcytometrie-assays kwantificeerbare eindpunten opleveren over grote volumes levende cellen in één experiment. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar een diagnose en een therapie van cardiale ventrikelaritmieën omdat deze pathologieën vaak geassocieerd zijn met genetische mutaties die defecten veroorzaken in het transport van cardiale ionenkanalen.
Over het algemeen worstelen individuen die nieuw zijn met deze methode om een geschikte externe invoegplaats voor het epitoop te identificeren die hun eiwitfunctie niet beschadigt en een sterk fluorescerend signaal genereert in de aanwezigheid van het geconjugeerde antilichaam. Het demonstreren van deze procedure zal Benoite Bourdin zijn, een onderzoeksassistent uit mijn lab. Om te beginnen, dubbel label DNA-constructies met mCherry aan het intracellulaire C-uiteinde.
Druk ook een extracellig gerichte hemagglutinine-epitoop uit, die kan worden gemeten met behulp van een fluorescentie-antilichaam om de expressie van membraaneiwitten op het celoppervlak te schatten. Vervolgens kweekt u een bord TSA201-cellen met behulp van standaardtechnieken totdat ze 90% confluency bereiken. Bereid voor elk monster de transfectiereagentia voor in twee buisjes.
Bereid één buisje van 1,5 milliliter met vier microgram DNA en 250 microliter gereduceerd serummedium, en een tweede buisje met 10 microliter van het liposoomgemedieerde transfectiereagens en 250 microliter gereduceerd kweekmedium. Meng de twee buisjes voorzichtig en incubeer ze gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Combineer vervolgens voorzichtig de inhoud van buisje één en buisje twee en incubeer de liposoom-DNA-complexen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
Voeg de complexen toe aan de gekweekte cellen en wieg voorzichtig de kweekschaal. Plaats de schaal terug op 37 graden Celsius en onder een 5% kooldioxide-atmosfeer gedurende 24 uur. 24 uur na de toevoeging van het transfectiereagens, verwijder het medium uit de kweekschaal en was de cellen voorzichtig met 400 microliter voorverwarmde Trypsin-EDTA.
Voeg vervolgens 400 microliter Trypsin-EDTA toe en incubeer de schaal gedurende vijf minuten om de cellen los te laten komen van de schaal. Zodra ze loslaten, stop de enzymdigestie door één milliliter koud kweekmedium zonder penicilline of streptomycine toe te voegen aan de cellen. Pipetteer het medium voorzichtig vier tot vijf keer over de plaat om alle cellen van het oppervlak te wassen.
Verzamel vervolgens de cellen in steriele 1,5 milliliter buisjes en plaats ze onmiddellijk op ijs. Gebruik voor de volgende stappen ijskoud oplossing en houd de cellen op vier graden om de internalisatie van het oppervlakte-epitoop te voorkomen. Verminder ook de blootstelling van de cellen aan licht om de fotobleken van het fluorescerende signaal te beperken.
Centrifugeer vervolgens de buisjes om de cellen te pelletten. Aspibeer vervolgens voorzichtig en gooi de resulterende supernatant weg. Resuspendeer het pellet om een enkele cel suspensie te bereiden met behulp van één milliliter PBS.
Centrifugeer vervolgens de buisjes kort. Pellet en resuspendeer de cellen nogmaals om het kweekmedium volledig te verwijderen. Resuspendeer vervolgens het cellenpellet in 600 microliter PBS.
Meet de celconcentratie en pas deze aan tot ten minste drie miljoen cellen per milliliter. Verdeel vervolgens de cellen in nieuwe 1,5 milliliter buisjes. Zorg ervoor dat u de juiste controles opneemt om specifieke kleuring te onderscheiden van niet-specifieke kleuring en voor extracellulaire kleuring en ook voor intracellulaire kleuring.
Het isotoopcontrole-antilichaam zal helpen om het niveau van achtergrondkleuring te beoordelen en moet overeenkomen met het primaire antilichaam, voorspoedige isotoop en fluorfoor. Het is belangrijk om de controle-isotoopantilichaam en het fluorescente antilichaam in dezelfde concentratie te gebruiken. Om de expressie van membraaneiwitten op het celoppervlak te schatten, labelt u eerst alleen het extracellulaire HA-epitoop met behulp van een fluorescent lichtgeconjugeerd antilichaam.
Voeg vervolgens een FITC-geconjugeerd monoklonaal anti-HA-antilichaam toe bij vijf microgram per milliliter aan het buisje. Vortex de cellen kort en incubeer ze vervolgens op een rocker platform in het donker. Verwijder de cellen uit het donker en voeg 900 microliter PBS toe.
Centrifugeer vervolgens het buisje om de cellen te pelletten en aspireer het supernatant. Was vervolgens de cellen door de pellet op te schalken in één milliliter PBS en de cellen kort te vortexen. Herhaal vervolgens de centrifugeer stap om de cellen opnieuw te pelletten.
Herhaal deze wasstap in totaal drie keer om eventueel ongebonden antilichaam te verwijderen. Na de laatste wasstap, resuspendeer de cellen in 500 microliter PBS en breng de enkele cel suspensie over naar een vijf milliliter flowcytometriebuisje. Bewaar de cellen in het donker op vier graden Celsius totdat het monster wordt uitgevoerd.
Om de intracellulaire expressie van totaal eiwit te schatten, labelt u vervolgens de gepermeabiliseerde cellen. Dit wordt bereikt met behulp van een vergelijkbaar protocol als de extracellulaire labeltechniek, maar met de toevoeging van een saponine-gebaseerde celpermeabilisatie buffer. Pellet de cellen, gooi het supernatant weg en resuspendeer de cellen in 100 microliter fixatie-permeabilisatie oplossing direct uit de voorbereide voorraad.
Incubeer de cellen in het donker bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Voeg vervolgens 100 microliter vers bereide permeabilisatie wasbuffer toe en vortex de cellen kort. Pellet vervolgens de cellen en was ze nog twee keer met behulp van de permeabilisatie wasbuffer.
Voeg vervolgens het FITC-geconjugeerde monoklonale anti HA-antilichaam toe bij 5 microgram per milliliter en 100 microliter van de permeabilisatie wasbuffer. Vortex de cellen kort en incubeer de cellen in het donker bij vier graden Celsius gedurende
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het kwantificeren van de celoppervlakte-expressie van membraaneiwitten met behulp van flowcytometrie-assays. De techniek is vooral relevant voor het bestuderen van hartritmestoornissen die verband houden met genetische mutaties die de ionenkanaalverkeersstroming beïnvloeden.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Hartritmestoornissen
- Ionenkanaalbiologie
- Flowcytometrietechnieken
Achtergrond
- Erfelijke hartritmestoornissen zijn vaak het gevolg van mutaties in ionenkanalen.
- Deze mutaties kunnen de oppervlaktelevering van ionenkanalen verstoren.
- Flowcytometrie maakt de analyse van grote volumes levende cellen mogelijk.
- Het identificeren van geschikte insertieplaatsen voor epitope tagging is cruciaal voor succesvolle experimenten.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het kwantificeren van membraaneiwitexpressie.
- Om de diagnose en therapie van ventrikelaritmieën te vergemakkelijken.
- Om de begrip van defecten in ionenkanaalverkeer te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van flowcytometrie-assays voor kwantificering.
- Dubbele tagging van DNA-constructen met mCherry aan het intracellulaire C-uiteinde.
- Beoordeling van celoppervlakte-eiwitexpressie in tsA-201 cellen.
- Demonstratie van de procedure door een onderzoeksassistent.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van totale en celoppervlakte-eiwitexpressie.
- Identificatie van effectieve epitope-insertieplaatsen.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode voor levende celanalyse.
- Inzichten in de relatie tussen genetische mutaties en ionenkanaalfunctie.
Conclusies
- De methode biedt een betrouwbare benadering voor het bestuderen van membraaneiwitten.
- Het heeft mogelijke implicaties voor het begrijpen van hartritmestoornissen.
- Toekomstige toepassingen kunnen therapeutische strategieën voor getroffen individuen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of membrane protein expression is critical for de-risking ion channel targets in cardiac arrhythmia drug discovery. This flow cytometry method enables high-throughput, reproducible assessment of total and cell surface expression in live cells, supporting target validation and mechanistic de-risking. It provides quantitative endpoints that improve predictive confidence in early discovery by linking genetic variants to trafficking defects.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying relative cell surface versus total expression of recombinant ion channels.
- Operational Value: Supports biological de-risking through objective, flow-based measurement of trafficking efficiency in tsA-201 cells.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying constructs with preserved surface expression despite genetic or posttranslational modifications.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative fluorescence readouts (mCherry for total, HA-FITC for surface) suitable for assay optimization.
- Operational Value: Delivers reproducible, large-volume analysis (10⁴–10⁶ cells) with minimal variability, enabling robust compound or mutant screening.
- Assay Readiness: Establishes a scalable, two-color flow cytometry platform adaptable to ion pumps, transporters, and other multi-spanning transmembrane proteins.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase expression data to functional outcomes by correlating surface levels with electrophysiological recordings.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes trafficking defects from gating alterations, clarifying disease-relevant mechanisms in ion channelopathies.
- Preclinical Model Support: Provides a disease-relevant system for evaluating how mutations affect membrane residency of cardiac L-type calcium channels.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering quantitative expression data that informs go/no-go decisions prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating the variable of membrane trafficking from channel function through dual-tag quantification.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility, critical for evaluating large libraries of ion channel variants or modulators.
- Analytics: Delivers mean fluorescence intensity and percentage-positive readouts that allow direct comparison of expression conditions across experimental groups.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing expression data that can be linked to functional assays in native or disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable flow cytometry workflow for membrane protein quantification across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by reducing ambiguity between expression and function.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across teams through a defined, antibody-based staining protocol.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of trafficking-defective variants, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying the proportion of expressed protein reaching the cell surface.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning to design C-terminally tagged constructs with extracellular epitope insertion.
- Dependent on flow cytometry instrumentation capable of detecting mCherry and FITC fluorescence with appropriate compensation.
- Necessitates standardization of antibody titration and permeabilization protocols across users to ensure consistent surface versus total signal discrimination.
- Involves adaptation considerations when extending to other membrane proteins, particularly regarding epitope accessibility and transfection efficiency.
- Limited by the need to validate that epitope tagging does not disrupt protein folding or function, requiring functional controls.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:08
Liposome Mediated Transient Transfection
2:35
Preparing Cell Samples for Staining
4:51
Extracellular Staining of Cell Samples
6:10
Intracellular Staining of Cell Samples
7:51
Data Analysis
8:55
Results: Simultaneaous Mutations of N-glycosylation Sites Disrupted Cell Surface Expression of CaVα2δ1
10:25
Conclusion
