Name: Vetrijke Feeding Paradigm voor larvale zebravis: Voeden, Live Imaging, en kwantificering van voedselinname (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Leer een vetrijk voedingsprotocol voor larvale zebravis met fluorescerende lipiden voor live imaging en kwantificering van voedselinname. Deze methode ondersteunt metabolismeonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken Meng-Chieh Shen voor de afbeeldingen, Jennifer Anderson voor het geven van nuttige commentaren op het manuscript, en leden van het Farber laboratorium voor hun bijdragen bij het ontwikkelen van deze technieken. Dit onderzoek werd gefinancierd door NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker en Co-PI S.A.F) en F32DK096786 (J.P.O.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van NIH. Aanvullende ondersteuning werd verstrekt door de G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation aan het laboratorium van S.A.F en de Carnegie Institution for Science endowment.

Deze protocollen zijn goedgekeurd door het Carnegie Institution for Science Institutional Animal Care en gebruik Comite (protocol nr. 139). 1. Dierlijke Voorbereiding <ol><li> Handhaaf volwassenen en larven bij 28 ° C op een 14 uur: 10 uur licht: donker cyclus. Feed volwassenen tweemaal daags met shell gratis Artemia (decapsulated, niet uitkomen, te beginnen bij 14 DPF) en commerciële micropellets. </li><li> Deze protocollen zijn geoptimaliseerd voor het gebruik van 6-7 dpf larven door natuurlijke paaien van de AB achtergrond verzameld. Protocollen kunnen worden aangepast voor de larven van andere leeftijden en achtergronden. Bieden geen exogeen voedsel vóór 6 DPF. </li><li> Verdoven larven tricaïne in embryomedium (EM) (4,2 ml 4 mg / ml tricaïne per 100 ml EM) bij kamertemperatuur (RT). </li></ol> 2. Bereiding van Lipid-rijke eigeel Feed <ol><li> Voor te bereiden en op te slaan de kip eidooiers. Scheid de dooier en wit van 12 kippeneieren. Zwembad de dooiers, monster 1 ml in 1,5ml buizen en bewaar bij -80 ° C tot 1 jaar (12 dooiers maakt ~ 80 monsters). Zwembad de blanken, op te slaan en te gebruiken als een lipide-arme, eiwitrijke voeding. </li><li> Bereid fluorescerende lipide analoog (en) worden toegevoegd aan het eigeel geven indien gewenst. <ol><li> Schorsen de gekochte, gepoederde fluorescerende lipide analoge in 100% ethanol en 100% chloroform bij 0,1 ug / ul (zie opmerking hieronder bespreken oplosmiddelen), aliquot in ondoorzichtige glazen buizen, afdichting met parafilm en opslag volgens de instructies van de fabrikant. Door snelle verdamping van organische oplosmiddelen niet gebruikte hoeveelheid volumes van minder dan ~ 400 ul voor langdurige opslag. Opmerking: Als de lipide analoge in ethanol gesuspendeerd, worden grote hoeveelheden van het lipide analoge worden gebruikt omdat het sneller droogt onder N2 dan chloroform. Indien de lipide analoge in ethanol wordt opgeschort hoeft niet te worden gedroogd en geresuspendeerd alvorens het aan het liposoom voeding in stap 2.2.4, maar de totale ethanolconcentratie mag niet meer dan 0.1% in de voeding liposoom teneinde mogelijk verstorende fysiologische effecten van ethanol voorkomen. </li><li> Voor fluorescente vetzuur analogen: Bereid een totaal volume van 20 ml 5% eierdooier emulsie in EM. Vanaf dat bereiden 5 ml aliquots met een eindconcentratie van 6,4 uM 4,4-difluor-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indaceen (BODIPY C 16) voor levende confocale beeldvorming en voedselinname assays of 1 ug / ml BODIPY C 12 voor stereomicroscoop beeldvorming. Breng de gewenste hoeveelheid van de fluorescente lipide analoge in een 1,5 ml plastic buis. Droog het lipide onder een stroom N2, verzorgen het lipide niet te blazen van de buis. </li><li> Onmiddellijk hersuspenderen in 5 pi 100% ethanol door pipetteren een stroom langs de zijkanten van de buis, voeg 95 ul EM en meng goed. Opmerking: Het mengsel moet homogeen te verschijnen; Als gekleurde lipide blijft aan de zijkanten van de buis of de vloeistof klonterig is het lipide niet volledig oplosbaar en vereist meer ethanol. Bescherm de buis weerm licht en op te slaan op het ijs. </li><li> Voor TL cholesterol analoge: bereid een eindconcentratie van 2,4 ug / ml cholesterol in 5 ml 0,5-5% eigeel emulsie voor levende imaging studies. Breng de gewenste hoeveelheid cholesterol in een 1,5 ml plastic buis. Droog het lipide onder een stroom N2, verzorgen het lipide niet te blazen van de buis. </li><li> Onmiddellijk resuspendeer in 15 ui RT 100% ethanol door pipetteren een stroom langs de zijkanten van de buis en meng met 85 ui RT 1% vetzuur-vrij BSA in gezuiverd H 2 O. Bescherm de buis van licht en op te slaan op het ijs. </li></ol></li><li> Bereid Egg Yolk liposoom-feed. <ol><li> Voeg een ontdooide hoeveelheid van eigeel aan EM in een 50 ml conische buis. Vortex de verdunde eidooier mengsel voor 1-2 min; het mengsel moet blijken een homogene emulsie. </li><li> Giet het mengsel door een fijne zeef om eiwitten conglomeraten te verwijderen en te verzamelen in een nieuwe, frisse 50 ml conische buis. </li><li> Pulse SONICATÉ het eimengsel met een vierde inch conische micropunt (5 keer (5 x 1 seconde aan, 1 seconde uit) pauzeren 5-10 sec tussen elke set; uitgang intensiteit: 6 W) bij RT om liposomen te maken. Ultrasoonapparaat energie-instellingen zijn instrument afhankelijk en vereisen daarom optimalisatie voor elk instrument en micropunt. Opmerking: Continu rocken liposoom mengsel bij KT om de homogeniteit tot gebruik te handhaven. </li></ol></li><li> Voeg de fluorescerende lipide analoog het eigeel liposomen, indien gewenst. Onmiddellijk na sonicatie, pipet de bereide lipiden in het liposoom mengsel en vortex met hoge snelheid gedurende 30 seconden op te nemen in liposomen. Bescherm het mengsel van licht door het wikkelen van de buis in folie en blijven schommelen bij RT. </li></ol> 3. Feeding Paradigm <ol><li> Bereid de Larven voor het voeden. <ol><li> Voorafgaand aan het begin van de voeding, het scherm larven voor de hand liggende morfologische gebreken die voeding kunnen belemmeren. Transfer larven tot 60 mm x 15 mm petrischaaltjes of 6 of 12-well plates, EM verminderen tot een minimum, en vervangen door 5 ml van de bereide liposoomoplossing. </li><li> Indien nodig overbrengen unfed controle larven tot 5 ml EM en / of 5 ml 5% eiwit in EM en te behandelen in parallel. </li></ol></li><li> Schud de larven in een bebroede rocker (29-31 ° C bij 30 rpm) in het diervoeder de voedselinname te stimuleren en tegelijkertijd te beschermen tegen het licht als fluorescerende lipide-analogen aanwezig zijn. Als larven moeten worden blootgesteld aan licht, minimaliseren de belichting met een gekleurd glas incubator deksel. </li><li> Aan het eind van de voedingsperiode, spoel de vrij zwemmende larven EM 3 keer. Opmerking: Larven kan beginnen consumeren liposomen op enig moment tijdens de voeding. Als het essentieel dat larven beginnen toevoeren tegelijkertijd, scherm voedselinname (zie 3.4) na 1 h voeding en alleen terugkeren larven die begonnen toevoer aan het eigeel emulsie aan het voer voltooien. </li><li> Zeef de larven op dit punt voor de voedselinname als een klein aantal mag niet eat (algemeen ~ 0-5%). Onderzoek de ingewanden van de larven die werden verdoofd of licht afgekoeld op een metalen blok op ijs te bepalen of zij gevoed: larven die verbruikt liposomen een verduisterde darm (Figuur 1) hebben. </li><li> Afbeelding of proces larven voor voedselinname onmiddellijk. Afwisselend plaats larven in verse EM en incubeer bij 28 ° C om metabolische verwerking plaatsvindt. </li></ol> 4. Montage Larven voor Live Imaging <ol><li> Bereid de Mounting Media. <ol><li> 3% methylcellulose: voeg 0,75 g méthylcellulose 25 ml kokende buurt EM, vortex, rots bij kamertemperatuur 2-3 dagen tot volledig opgelost en bewaar bij 4 ° C gedurende jaren bij -20 ° C. Herhaalde cycli van bevriezen en ontdooien bij 4 ° C zullen luchtbellen te verwijderen. Bewaar 3% methylcellulose op het ijs tijdens het monteren larven. </li><li> Voor 1,2% low-mount agarose: voeg 0,3 g lage-smelt agarose tot 25 ml EM en oplossen door te brengen aan de kook, monster in 2 ml tUbes en te handhaven op 26-28 ° C op een warmte-blok. Ongebruikte porties kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur of -20 ° C gekookt en opnieuw op het moment van gebruik. Zorg ervoor dat agarose koel genoeg is om te handelen voordat bloot te stellen aan larven of zij kunnen oververhit. </li></ol></li><li> Voor lage-vergroting, medium-throughput live-imaging, plaats een glasplaatje op een weefsel op een metalen blok op ijs en wacht tot de glijbaan af te koelen. Breng een ruime hoeveelheid van 3% methylcellulose op de dia (die bij 4 ° C op ijs gehandhaafd), breng een larve op de 3% methylcellulose, met behulp van een visserij-line poker (0,41 mm diameter vislijn vastgelijmd aan de uiteinde van een glazen capillaire buis) een trouw om overtollig EM afvoer (zodat methyl cellulose niet zal worden verdund) en plaats de larven zoals gewenst. </li><li> Voor de korte termijn (&lt;20 min), high-vergroting live-imaging met een rechte olie emersion objectieve, monteren larven met het dekglaasje lean-to-methode. <ol><li> Gebruik cyanoacrylaat lijm op (Superlijm) naarattach aa 22 mm x 30 mm dekglaasje aan één uiteinde van een glasplaatje. Gebruik een poker om een ​​dunne lijn van 3% methylcellulose op de dia naast het dekglaasje te zetten en over te dragen larven aan de dia met een brede boring Pasteur pipet. Verwijder overtollig EM, zodat het de methylcellulose niet verdunnen. </li><li> Met behulp van een poker voorzichtig positioneren larven in de methylcellulose op hun kant (linkerkant tot beeld meer van de lever, rechtop op beeld de galblaas) met hun hoofden naast het dekglaasje. </li><li> Spot superlijm in de hoeken van een tweede dekglaasje en plaats voorzichtig een rand van het dekglaasje over het dekglaasje geplaatst en de andere op de dia overbruggen van de larven. Zorg dat u niet teveel druk uit te oefenen tijdens deze stap of met het doel, terwijl beeldvorming, zodat de larven blijven ongedeerd. </li></ol></li><li> Voor de lange termijn, high-vergroting beeldvorming met een rechtopstaande immersie objectief, zet larven in agarose. Voeg een larve van een kleine hoeveelheid van 1,2% low melt agarose vervolgens over delarve in een klein volume van agarose een petrischaal. <ol><li> Snel de positie van de larven met een poker voordat de agarose stolt. Laat de agarose drogen 2-3 min en dek de agarose volledig met verse EM om te voorkomen dat het drogen. </li></ol></li><li> Voor de lange termijn, high-vergroting beeldvorming met een omgekeerde doel, monteren larven op een glazen bodem schaal in agarose. <ol><li> Cool een metalen blok op het ijs. Plaats de schaal op het metalen blok gescheiden door een weefsel om overmatige koeling en larvale bevriezing te voorkomen. Transfer een larve aan het gerecht en verwijder de EM door wicking met een tissue. </li><li> Plaats een druppel van 28 ° C laag smeltpunt agarose (1,2%) op de top van de larve en meteen te positioneren met een poker (links naar beneden om het beste imago van de lever, recht naar beneden om het beeld van de galblaas). Verwijder schotel uit de koude blok, laten drogen 2-3 min en voeg een voldoende hoeveelheid verse EM de agarose bedekken (~ 2-5 ml). </li></ol></li></ol> 5. voedselinnameanalyse <ol><li> Aan het einde van een eidooier liposoom diervoeders die 6,4 uM BODIPY C 16, zwembad een minimum van 10 gewassen larven in een plastic 1,5 of 2 ml tube, verwijder EM, en snap bevriezen. De monsters worden bewaard bij -80 ° C beschermd tegen licht gedurende enkele maanden. Opmerking: Indien mogelijk, verzamel meerdere herhalingen. Het is belangrijk om unfed larven verzamelen in deze stap te normaliseren voor achtergrond fluorescentie lipide (bij voorkeur larven van dezelfde koppeling worden gebruikt). </li><li> Voer een aangepaste Bligh-Dyer vetextractie 3,21. <ol><li> Voeg 100 ul homogenisatiebuffer (20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) om het monster op ijs (alternatief gezuiverd H 2 O kan worden gebruikt). Homogeniseren op ijs met een micropunt ultrasoonapparaat (5 sec totaal: 1 sec op 1 sec uit). Controleer of de larven zijn geheel gehomogeniseerd; zo niet, herhalen. Over te dragen aan een 13 ml wegwerp glascultuur buis (andere glazen buizen kunnen worden gebruikt). Let op: Chloroform is gevaarlijk; voeren alle daaropvolgende lipide extractie stappen bij kamertemperatuur in een chemische kap. </li><li> Voor elke 100 gl homogenisatiebuffer gebruikt, voeg 375 pl van 1: 2 (chloroform: methanol). Vortex 30-60 sec, incubeer 10 min, voeg 125 pl chloroform per 100 gl homogenisatiebuffer gebruikt en vortex 30 sec. </li><li> Voeg 125 ul van 200 mM Tris pH 7,5 per 100 gl homogenisatiebuffer gebruikt, 30 sec vortex en gecentrifugeerd (2000 x g, 5 min, kamertemperatuur, beschermd tegen licht). Haal de monsters uit de centrifuge. Ze worden gescheiden in twee fasen: een bovenste waterige fase, een interface van larvale puin, en een onderste organische fase (bevat lipiden). </li><li> Met een schone glazen pipet het verzamelen van de bodem, organische fase en over te dragen in een schone 13 ml glazen buis. Let op: Zorg ervoor dat de waterfase en larvale puin op het grensvlak te voorkomen; indien besmetting optreedt, herhaal centrifugeren stap en Recollect. Gooi de bovenste, waterige fase; kan het nuttig zijn om te verwijderen en gooi dezefase voor het verzamelen van de organische fase. Het monster kan maximaal 1 maand bewaard bij -80 ° C. </li><li> Droog de organische fase onder vacuüm (0,12 atm), terwijl de bescherming tegen licht. Niet verder de monsters drogen na het vocht verdampt als het lipide oplosbaarheid vermindert. Resuspendeer de lipiden in 2: 1 (chloroform: methanol) en bewaar op ijs. De optimale omvang van de chloroform: methanoloplossing afhankelijk van de gebruikte detectiemethode; start lage en verder verdund zoals nodig. Een algemene richtlijn dat 10 gl gebruiken 10 pooled larven. </li></ol></li><li> Spot de gehele monster volumes in gelijkmatig tussenpozen op een gekanaliseerd TLC-plaat en scan de plaat met een laserscanner routinematig gebruikt voor biomoleculaire imaging (bijvoorbeeld een fluorescerende plaat lezer). Voor de fluorescerende lipide analogen opgenomen in de lijst van materialen die een excitatiemaxima 500-650 nm en emissie maxima hebben 510-665 nm, gebruikt een 488 nm laser en emissie bij 520 nm collectie. <ol><li> Kwantificeren van de totale fluorescentie van elke plek met imaging software. Let op: Correct voor de natuur voorkomende achtergrond lipide fluorescentie door het aftrekken van de fluorescentie van gepaarde, unfed larvale monsters. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Carten, J. D., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+system+swims+into+focus%3A+using+the+zebrafish+to+visualize+intestinal+metabolism+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lipidol%22%5BJournal%5D)">A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo.</a> Clin Lipidol. 4 (4), 501(2009).</li>
<li>Babin, P. J., Vernier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+lipoproteins+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Plasma lipoproteins in fish.</a> J Lipid Res. 30 (4), 467-489 (1989).</li>
<li>Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+digestive+organ+morphology+and+function+using+differential+fatty+acid+metabolism+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish.</a> Dev Biol. 360 (2), 276-285 (2011).</li>
<li>Marza, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+and+nutritional+regulation+of+a+zebrafish+gene+homologous+to+mammalian+microsomal+triglyceride+transfer+protein+large+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit.</a> Dev Dyn. 232 (2), 506-518 (2005).</li>
<li>Stoletov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+lipid+accumulation%2C+lipoprotein+oxidation%2C+and+macrophage+lipid+uptake+in+hypercholesterolemic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish.</a> Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).</li>
<li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+effects+of+high-carbohydrate+feeding+of+larvae+on+adult+glucose+metabolism+in+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio.</a> Br J Nutr. 111 (5), 808-818 (2014).</li>
<li>Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+a+combined+high+cholesterol+diet+and+high+glucose+environment+on+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature.</a> PLoS One. 8 (12), 81485(2013).</li>
<li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+and+attenuation+of+oxidized+lipid+accumulation+in+hypercholesterolemic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish.</a> J Clin Invest. 121 (12), 4861-4869 (2011).</li>
<li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+a+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li>
<li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).</li>
<li>Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+steatosis+in+response+to+acute+alcohol+exposure+in+zebrafish+requires+sterol+regulatory+element+binding+protein+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation.</a> Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).</li>
<li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18%2C+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).</li>
<li>Matthews, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFalpha-dependent+hepatic+steatosis+and+liver+degeneration+caused+by+mutation+of+zebrafish+S-adenosylhomocysteine+hydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase.</a> Development. 136 (5), 865-875 (2009).</li>
<li>Oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+in+zebrafish+shares+common+pathophysiological+pathways+with+mammalian+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity.</a> BMC Physiol. 10, 21(2010).</li>
<li>Chu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Akt1+enhances+adipogenesis+and+leads+to+lipoma+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish.</a> PLoS One. 7 (5), 36474(2012).</li>
<li>Song, Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+genetic+model+of+obesity+in+a+teleost%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Creation of a genetic model of obesity in a teleost.</a> FASEB J. 21 (9), 2042-2049 (2007).</li>
<li>Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+approaches+to+the+study+of+zebrafish+nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition.</a> ILAR J. 53 (2), 144-160 (2012).</li>
<li>Farber, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+digestive+physiology+using+fluorescent+phospholipid+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters.</a> Science. 292 (5520), 1385-1388 (2001).</li>
<li>Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+yolk+lipid+processing%3A+a+tractable+tool+for+the+study+of+vertebrate+lipid+transport+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism.</a> Dis Model Mech. 7 (7), 915-927 (2014).</li>
<li>Otis, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+apolipoprotein+biology%3A+comprehensive+expression+analysis+and+a+role+for+ApoA-IV+in+regulating+food+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake.</a> Dis Model Mech. 8 (3), 295-309 (2015).</li>
<li>Bligh, E., Dyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).</li>
<li>Otis, J. P., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+vertebrate+digestive+function+and+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Dis+Models%22%5BJournal%5D)">Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism.</a> Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).</li>
<li>Andre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+fatty+acid+binding+protein+gene+expression+reveals+the+cephalocaudal+patterning+during+zebrafish+gut+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis.</a> Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).</li>
<li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PLoS One. 7 (12), 52549(2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier beschreven technieken kunnen onderzoekers larvale zebravis behandelen met een lipide-rijke voeding, visualiseren dieet lipide verwerking in levende larven, en te kwantificeren larvale voedselinname. Om succes te garanderen, moet speciale aandacht worden besteed aan een aantal kritische stappen. Commerciële kippeneieren variëren; mogelijke variabiliteit te minimaliseren voeren wij alle assays biologische eieren van kooi-kippen die niet zijn verrijkt voor omega-3 vetzuren. Lagere voeden tarieven kunnen worden waar...

De mechanismen waarmee de darm reguleert dieet lipide verwerking, de lever stuurt complex lipidesynthese en lipoproteïne metabolisme, en hoe deze organen met het centrale zenuwstelsel voedselinname zijn onvolledig begrepen. Het is van biomedische belang deze biologie verhelderen in het licht van de huidige epidemieën van zwaarlijvigheid, hart- en vaatziekten, diabetes en niet-alcoholische steatohepatitis. Studies in celcultuur en muizen hebben op voorwaarde dat de meerderheid van onze kennis van de mechanistische relaties tussen de voeding vetten en de ziekte, en de zebravis (Danio rerio) zijn in opkomst als een ideaal model om dit werk aan te vullen. Zebravis soortgelijke gastrointestinale (GI) organen, lipidemetabolisme en lipoproteïne transport hogere vertebraten 1,2, snel ontwikkelen en genetisch handelbaar. De optische helderheid van de larvale zebravis vergemakkelijkt in vivo studies, een particular voordeel voor de studie van het GI-systeem als zijn extracellulaire milieu (dwz, gal, microbiota, endocriene signalering) is het vrijwel onmogelijk om te modelleren ex vivo. Volgens een lichaam van het onderzoek combineren van de genetische tractability en bevorderlijk zijn beeldvorming van de zebravis larven leven diverse manipulaties dieet (vetrijk 3,4, 5 -cholesterol en -carbohydrate diëten 6,7) en modellen van hart- en vaatziekten 8, diabetes 9,10, hepatische steatose 11-13, 14-16 en obesitas, ontstaan ​​van een groot aantal metabole inzichten. Essentieel overgang de larvale zebravis in de metabole activiteit is het optimaliseren van technieken die in andere modeldieren de zebravis en de ontwikkeling van nieuwe assays die de unieke sterktes van de zebravis benutten. Dit protocol presenteert technieken ontwikkeld en geoptimaliseerd om larvale zebravis diervoeders een Lipid-rijke maaltijd, visualiseren dieet lipide de verwerking van het hele lichaam naar subcellulaire resolutie, en meet voedselinname. Kip eidooier werd gekozen om de vetrijke maaltijd samenstellen aangezien het een hoog gehalte aan vetten en cholesterol (lipiden samen ~ 58% kip eigeel, waarvan ~ 5% cholesterol, 60% triglyceriden en 35% fosfolipiden ). Kip eidooier bevat meer vet dan typische commerciële zebravis micropellet voedingsmiddelen (~ 15% lipiden) en het voordeel dat het een gestandaardiseerde feed met bekende percentages van specifieke vetzuren species, zoals zebravis dieet en voeding regimenten niet in laboratoria 17 gestandaardiseerd. Bovendien fluorescerende lipide analogen die in de eidooier visualiseren transport en de accumulatie van voedingslipiden 18, stock celcomponenten inclusief vetdruppels door zowel fungeert als vitale kleurstoffen 3 en door covalente opname in complexe lipiden onderzoeken metabolisme met dunnelaagchromatografie (TLC) 19 </sup&gt; En hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) (SAF ongepubliceerde gegevens), en een kwantitatieve assay voor totale voedselinname 20.

<table><tbody><tr><td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Anesthesie voor larven van zebravisjes</td></tr><tr><td>Chicken eggs</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Organische, kooi-vrije eieren, niet verrijkt met omege-3 vetzuren</td></tr><tr><td>Ultrasonic processor 3000 sonicator</td><td>Misonix, Inc.</td><td>S-3000</td><td>Om liposomen uit eigeel te maken</td></tr><tr><td>Sonabox acoustic enclosure</td><td>Misonix, Inc.</td><td>432B</td><td>Om liposomen uit eigeel te maken</td></tr><tr><td>1/8&rdquo; tapered microtip</td><td>Misonix, Inc.</td><td>419</td><td>Om liposomen uit eigeel te maken</td></tr><tr><td>Amber vials (4 ml, glass)</td><td>National Scientific</td><td>13-425</td><td>Lipide opslag; inclusief flesjes, open-top doppen en dop septa</td></tr><tr><td>Incu-Shaker Mini&nbsp;</td><td>Benchmark</td><td>1222U12</td><td>Geïncubeerde shaker voor voeding</td></tr><tr><td>BODIPY FL C16&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3821</td><td>Fluorescente lipide analoog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Zuur)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C12&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3822</td><td>Fluorescente lipide analoog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Zuur)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3834</td><td>Fluorescente lipide analoog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Zuur)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D2183</td><td>Fluorescente lipide analoog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid)</td></tr><tr><td>TopFluor cholesterol&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>810255</td><td>Fluorescente lipide analoog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol</td></tr><tr><td>Fatty acid-free BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0281-1G</td><td>Voor TopFluor cholesterol solubilisatie</td></tr><tr><td>Methyl cellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387</td><td>Bevestigingsmedium voor live larven beeldvorming; 75 x 25 x 1 mm</td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Bevestigingsmedium voor live larven beeldvorming; 22 x 30</td></tr><tr><td>VWR microscope slides&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>16004-422</td><td>Larven monteren voor live beeldvorming</td></tr><tr><td>Coverslips&nbsp;</td><td>Cover Glass</td><td>12-544A</td><td>Larven monteren voor live beeldvorming</td></tr><tr><td>Super glue</td><td>Loctite</td><td>LOC01-30379</td><td>Larven monteren voor live beeldvorming</td></tr><tr><td>FluoroDish (glass bottom dish)</td><td>World Precision Instruments, Inc.&nbsp;</td><td>FD35-100</td><td>Larven monteren voor live beeldvorming; 35 mm schaal, 23 mm glas, 0,17 mm glas dikte&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica Microsytems</td><td>SP-2, SP-5</td><td>Microscoop voor hoge vergroting live beeldvorming</td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Nikon</td><td>SM21500</td><td>Microscoop voor lage vergroting live beeldvorming</td></tr><tr><td>Glass culture tubes&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>73500-13100</td><td>Lipide extractie; (13 x 100 mm; 13 ml)</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Plus&nbsp;</td><td>ThermoQuest</td><td>SC210A</td><td>Lipide extractie</td></tr><tr><td>Channeled TLC plates</td><td>Whatman Scientific</td><td>WC4855-821</td><td>Voedselinname test; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um dik; Uit productie</td></tr><tr><td>Channeled TLC plates</td><td>Analtech, Inc.</td><td>66911</td><td>Voedselinname test; Directe vervanging voor Whatman Scientific TLC platen</td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Variable Mode Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>9410</td><td>Fluorescente platenlezer voor voedselinname test</td></tr><tr><td>ImageQuant software</td><td>GE Healthcare</td><td>29000605</td><td>Analyse van voedselinname test</td></tr><tr><td>5 3/4&rsquo; Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>63A53WT</td><td>Overbrengen van larven</td></tr></tbody></table>

vetrijke feeding paradigm voor larvale zebravis: voeden, live imaging, en kwantificering van voedselinname

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Zebravissen ontwikkelen zich tot een model voor de verwerking van voedingslipiden en metabole ziekten. Dit protocol beschrijft hoe larvale zebravissen een lipiderijke maaltijd kunnen worden gevoerd, die bestaat uit een emulsie van kippenlegueel-liposomen, gemaakt door het sonificeren van het eigeel in embryomedia. Gedetailleerde instructies worden gegeven om de larven te screenen op eigeelconsumptie, zodat larven die niet voeren de experimentele resultaten niet zullen verwarren. De kippenlegueel-liposomen kunnen worden verrijkt met fluorescerende lipide-analoga, inclusief vetzuren en cholesterol, waardoor zowel systemische als subcellulaire visualisatie van de verwerking van voedingslipiden mogelijk is. Er worden verschillende methoden beschreven om larven te monteren die bevorderlijk zijn voor korte- en langetermijnbeeldvorming met zowel rechtopstaande als omgekeerde objectieven bij hoge en lage vergroting. Daarnaast wordt een assay gepresenteerd om de voedselinname van larven te kwantificeren door de lipiden van larven gevoed met fluorescerende lipide-analoga te extraheren, de lipiden op een dunnelaagchromatografieplaat aan te brengen en de fluorescentie te kwantificeren. Ten slotte worden kritische aspecten van de procedures, belangrijke controles, opties voor het wijzigen van de protocollen om specifieke experimentele vragen aan te pakken en mogelijke beperkingen besproken. Deze technieken kunnen niet alleen worden toegepast op gerichte, hypothesegestuurde onderzoeken, maar ook op een verscheidenheid aan screenings- en live-imagingtechnieken om de stofwisseling van voedingslipiden en de controle van voedselinname te bestuderen.

Bij toediening op een rocker bij 29-31 ° C, zal de meerderheid van gezonde larven (≥95%) eten op 1 uur. Na het nuttigen van het eigeel emulsie, de larvale darm donkerder van kleur. Zeer donkere darmen kan worden waargenomen bij 2 uur (figuur 1). Als larven zijn unfed of niet te voeden, de darm blijft duidelijk. Larven gevoed eiwit vertonen een opgezwollen darmlumen die niet donkerder van kleur. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54735/...

Zebravissen ontwikkelen zich tot een waardevol model voor de verwerking van voedingslipiden en metabole ziekten. Beschreven worden protocollen van lipide-rijke larvale voeders, live beeldvorming van voedingsfluorescente lipide-analoga en kwantificering van voedselinname. Deze technieken kunnen worden toegepast op een verscheidenheid aan screenings-, beeldvormings- en hypothesegestuurde onderzoekstechnieken.

Vetrijke Feeding Paradigm voor larvale zebravis: Voeden, Live Imaging, en kwantificering van voedselinname

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

Het algemene doel van dit experimentele protocol is om larvale Zebravissen een vetrijke maaltijd te voeren die kan worden verrijkt met een fluorescente lipide-analoog, om zo de visuele dynamiek van lipide-opname in de larven te volgen en de dieetgebonden lipide-inname te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in de velden van het metabolisme en de gastro-intestinale biologie, zoals de wijze waarop dieetlipiden worden gemetaboliseerd en hoe de voedselinname wordt gereguleerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat fluorescente lipide-analogen efficiënt kunnen worden toegediend in dieetliposomen.De optische helderheid van de Zebrafish-larve maakt het mogelijk om via microscopie subcellulaire lipideverwerking zichtbaar te maken. Begin hiermee door één milligram gepoederde fluorescente lipide-analogon te suspenderen in twee milliliters 100% chloroform voor een uiteindelijke concentratie van 0,5 micrograms per microliter. Verdeel de analogon in aliquoten in amberkleurige glazen buisjes met schroefdoppen die compatibel zijn met het oplosmiddel en voorzien zijn van een Teflon-pakking.Bewaar deze stocks in de vriezer. Voeg 10,4 µL van d

high-fat-feeding-paradigm-for-larval-zebrafish-feeding-live-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wij presenteren een nieuwe methode voor microgavage van zebravislarven met gebruik van standaardapparatuur voor embryo-microinjectie en stereomicroscopie. We tonen aan dat microgavage een veilige en efficiënte techniek is die nuttig is voor het toedienen van gecontroleerde hoeveelheden uiteenlopende materialen specifiek in het lumen van de darm van de zebravislarve.

Microgavage van zebravis Larven

De video beschrijft de vermijding en thigmotaxis-test van zebravislarven. De video onderzoekt het gedrag van zebravislarven als reactie op visuele aversieve stimulus.

Zebrafish Avoidance and Thigmotaxis Assay: een methode met hoge doorvoer om larvaal gedrag te onderzoeken als reactie op aversieve visuele stimulus

Ons laboratorium ontwikkelde een nieuwe high-throughput geautomatiseerde imaging systeem dat nuttig is voor de detectie van verschillende gedragingen in 7 dagen oude zebravis larven. Het systeem kan worden gebruikt voor het detecteren van subtiele veranderingen in het gedrag na de larven zijn blootgesteld aan milieu-toxische stoffen of geneesmiddelen.

Geautomatiseerde High-throughput Behavioral Analyses in zebravis Larven

Hier presenteren we een protocol te onderzoeken larvale zebravis en fathead minnow motorische activiteiten en photomotor Reacties (PMR) met behulp van een geautomatiseerd tracking-software. Wanneer opgenomen in algemene toxicologie bioassays, geven analyses van deze gedragingen een diagnostisch instrument om te onderzoeken van chemische topicale. Dit protocol wordt beschreven met behulp van cafeïne, een neurostimulant model.

Experimentele Protocol voor de behandeling van de gedragsmatige reactie profielen in larvale vissen: toepassing op de Neuro-stimulerende cafeïne

Het doel van dit protocol is voor het meten van de transittijd van fluorescently geëtiketteerde voedsel door de darm van larvale zebrafish in een hoge doorvoersnelheid mode.

High-throughput meting van darm transittijd met behulp van larvale zebravis

Zebrafish (Danio rerio) worden een veel gebruikte gewervelde diermodel voor microbiële kolonisatie en de pathogenese. Dit protocol beschrijft het gebruik van de protozoan Paramecium caudatum als een voertuig voor voedsel overgedragen infectie in zebrafish larven. P. caudatum gemakkelijk internaliseert bacteriën en krijgen overgenomen door larvale zebrafish via natuurlijke azen gedrag.

Met behulp van de eencellige Paramecium caudatum als een voertuig voor voedsel overgedragen infecties in Zebrafish larven

Hier demonstreren we een methode voor het kwantificeren van levergrootte bij larve zebravissen, die een manier bieden om de effecten van genetische en farmacologische manipulaties op levergroei en ontwikkeling te beoordelen.

Kwantificerende levergrootte bij larvale zebravissen met behulp van Brightfield Microscopie

Hier presenteren we hoe we een niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) -geassocieerd Hepatocellulair Carcinoom (HCC) zebravismodel kunnen genereren om de impact van cholesteroloverschot op de micro-omgeving van de lever en het immuuncellandschap te bestuderen.

Analyse van levermicro-omgeving tijdens vroege progressie van niet-alcoholische leververvetting-geassocieerd hepatocellulair carcinoom bij zebravissen

Optische helderheid is een groot voordeel voor celbiologisch en fysiologisch werk bij zebravissen. Robuuste methoden voor het meten van celgroei bij individuele dieren worden beschreven die nieuwe inzichten mogelijk maken in hoe de groei van skeletspieren en naburige weefsels worden geïntegreerd met de groei van het hele lichaam.

Real-time en herhaalde meting van skeletspiergroei in individuele levende zebravissen die worden blootgesteld aan veranderde elektrische activiteit

Hier beschrijven we een methode voor het monteren van zebravis embryo's voor de lange termijn imaging, twee-foton beeldvorming en weefsel-schade technieken en time-lapse confocale beeldvorming.

Twee-foton axotomy en time-lapse confocale imaging in levende zebravis embryo&#39;s

Leer een vetrijk voedingsprotocol voor larvale zebravis met fluorescerende lipiden voor live imaging en kwantificering van voedselinname. Deze methode ondersteunt metabolismeonderzoek.

Vetrijke Feeding Paradigm voor larvale zebravis: Voeden, Live Imaging, en kwantificering van voedselinname

Meer video's verkennen