Name: Het gebruik van een filter cartridge voor filtratie van watermonsters en Winning van Environmental DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Leer een niet-invasieve methode voor eDNA-extractie uit watermonsters met filtercartridges voor metabarcoding van aquatische organismen. Deze techniek ondersteunt biodiversiteitsmonitoring en ecologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund als basisonderzoek door CREST van de Japan Science and Technology Agency (JST) en door subsidies van JSPS/MEXT KAKENHI (Nummer 26291083) en de Canon Foundation aan M.M. De financiers hadden geen rol in de ontwerpstudie, gegevensverzameling en -analyse, besluit om te publiceren of voorbereiding van het manuscript.

LET OP: Dit protocol heeft geen betrekking op water bemonstering en metabarcoding methoden. Water kan worden bemonsterd op verschillende manieren, afhankelijk van studiedoeleinden 16 en zie Miya et al. 12 voor meer informatie over de metabarcoding methoden waarbij MiFish primers. Merk op dat het monster erg koud water moet worden behandeld en gefiltreerd binnen enkele uren tot afbraak van eDNA voorkomen. Merk ook op dat dit protocol omvat het gebruik van een roterende schudder en een incubator, en deze moet groot genoeg zijn om de vroegere tegemoet te komen. Bovendien, een centrifuge die is geschikt zowel 15 ml en 50 ml conische buizen onontbeerlijk om de resterende vloeistof uit het filter na filtratie te verwijderen en aan geëxtraheerde DNA in de patroon verzamelen, respectievelijk. 1. Het verwerken van een schroefdop en een 1 L Plastic Bag OPMERKING: Sla deze stap als de filtratie volume&gt; 4 L. <ol><li> Boor een gat door het midden van een schroef cap (bevestigd aan een wegwerp 1 L plastic zak) met dezelfde diameter (4,8 mm) als de buis uitsteekt vanaf een mannelijke luer-lock connector. Diagonale tang inkorten buis van de mannelijke luer-lock connector op de juiste lengte (ca. 3 mm) om verstopping van een kleine hoeveelheid water in de dop na filtratie voorkomen. </li><li> Breng een lijm gespecialiseerd voor polyethyleen (PE) en polypropyleen (PP), dat zowel de bodem en het oppervlak van het mannelijke Luer-vergrendelende verbindingsorgaan en schroefdop, respectievelijk. Wacht een paar minuten voor een goede verlijming (zie de instructies van de fabrikant). </li><li> Steek de mannelijke luer-lock connector in het gat van de schroefdop. Wacht tot volledige verlijming van de twee delen (gewoonlijk&gt; 24 uur). Steriliseren de schroefdop met de mannelijke luer-lock connector met 10% commercieel bleekmiddel (ca. 0,6% natriumhypochloriet) voor gebruik. </li><li> Punch twee gaten aan de beide onderste hoeken van de 1 L plastic zak om het hangen van een mesh paneel (stap 3). Zorgen dat de diameter van de gaten groter is dan die van de pinnen van de mazen. </li></ol> 2. Montage van de Filtration System <ol><li> Attach hoog vacuüm slang aan de ingang van een aanzuigpomp en maak het andere uiteinde van de slang tot een verdeelstuk. Zorg ervoor dat de drie rode t-kleppen van het spruitstuk in de &quot;uit-stand&quot; (dwz, horizontaal). </li><li> Het dragen van een schone set handschoenen, plaatst een vrouwelijke luer fitting en een vacuum connector aan de boven- en ondereinden van het vacuüm rubber slang voor filtratie, respectievelijk. </li><li> Bevestig zorgvuldig de vrouwelijke luer fitting met een uitlaatpoort van de filterpatroon en bevestig de vacuum connector aan een silicone stopper. </li></ol> 3. Filtratie van watermonsters (≤4 L) met behulp van de Filter Cartridge OPMERKING: Sla deze stap als de filtratie volume&gt; 4 L. Deze filtratie-systeem vraagt ​​om een ​​op zichzelf staande panel fof opknoping de plastic zak gevuld met 1 liter water. Een mesh paneel, meerdere tanden en een standaard voor het panel, alle verkrijgbaar bij online winkels, zou nuttig zijn voor het samenstellen van dit toestel. Autoclaaf de inlaat en uitlaat Luer caps voor het filter voor gebruik. <ol><li> Giet de 1 L bemonsterde water in de plastic zak en sluit de schroefdop met de mannelijke luer-lock connector. </li><li> Sluit zorgvuldig een inlaatpoort van de samengestelde filterpatroon met de mannelijke luer-lock connector van de plastic tas. Niet te strak de luer-lock connector; anders wordt het toestel zal lekken zodra het pompen begint. Zorg ervoor dat alle aansluitingen goed vastzitten voordat opknoping de plastic zak uit een mesh panel. </li><li> hang voorzichtig de plastic zak met de filter cartridge uit twee tanden op de mazen en plaats een silicone stopper in een inlaatpoort van het spruitstuk. </li><li> Schakel de afzuiger. Open de rode t-kleppen voor filtratie. Voer het verdeelstuk tot de filterpatroon droog, tduivin draai de rode t-klep naar de stand uit. </li><li> Herhaal 3,1-3,4 stappen totdat de gewenste hoeveelheid water wordt gefilterd. OPMERKING: voor 1 liter water uit de subtropische koraalriffen, het duurt ongeveer drie minuten voor de filtratie. </li><li> Verwijder voorzichtig het filter uit de plastic zak en het vacuüm connector. </li><li> Cap beide uiteinden van de cassette met de inlaat en uitlaat luer caps. </li><li> Label de cartridge en de inlaat Luer-dop op de juiste wijze met een oplosmiddel-proof pen voor snel drogende en niet smerend labeling. </li><li> Bewaar de filterpatroon bij -20 ° C voor DNA-extractie. </li></ol> 4. Filtratie van het Water (&gt; 4 L) Monsters met behulp van de Filter Cartridge Opmerking: Sla deze stap over als het water filtratie volume ≤4 L. filtratie-systeem vereist een 10 L boek fles voorzien van een klep en een wegwerp 10-ml pipet tip. Een binnendiameter van 10 ml pipetpunt (15,0 mm) en een tapsheid van de tipend moeten passen aan een buitendiameter van de klep (15,0 mm) en de inlaatpoort van de filterpatroon, respectievelijk. Beide aansluitingen goed vastgehouden tijdens het filtreren in een wrijvingspassing. Steriliseer de pipet tip met 10% commercieel bleekmiddel (ca. 0,6% natriumhypochloriet) voor gebruik. <ol><li> Breng de gewenste hoeveelheid bemonsterde water in de fles boek. Nauw plaats de 10 ml pipet tip in de klep van 10 L boek fles. </li><li> Nauw plaats de uitlaatpoort van de filterpatroon in de pipetpunt uiteinde en steek de silicone stopper in de inlaatpoort van het verdeelstuk. Schakel de afzuiger. Open de rode t-kleppen voor filtratie. Voer het spruitstuk tot de filter cartridge droog is, zet de rode t-klep naar de stand uit. NB: Voor 10 liter zeewater uit de subtropische buitenste koraalriffen, het duurt ongeveer 30-40 min voor de filtratie. </li><li> Verwijder voorzichtig het filter uit de plastic zak en het vacuüm connector. Cap beideuiteinden van de cartridge met de inlaat en uitlaat luer caps. Label de cartridge en de inlaat Luer-dop op de juiste wijze met een oplosmiddel-proof pen voor snel drogende en niet smerend labeling. Bewaar de filterpatroon bij -20 ° C voor DNA-extractie. </li></ol> 5. Winning van eDNA van de Filter NB: In de stappen 4 en 5, maken we gebruik van een commerciële kit, grotendeels naar aanleiding van een protocol voor &quot;met kern bloed&quot; die door de kit. Voor de eenvoud beschrijven we de procedure voor de behandeling van een individu cartridge. In de praktijk wordt aanbevolen verwerking 8 (of het maximum aantal centrifuge) of minder filters tegelijk. <ol><li> Verwarm een ​​incubator op 56 ° C. </li><li> Bereid een 2,0 ml buis door het snijden van de scharnierende dop van de buis. Gooi de dop. OPMERKING: Deze buis wordt gebruikt als een verzamelbuis voor de resterende vloeistof in het filter. </li><li> Verwijder de inlaat (NOT uitlaat) Luer-dop van de filter cartridge en plaats de inlaatpoort into de collectie buis. Goed af, een verbinding tussen de patroon en verzamelbuis met een zelfsluitende film. </li><li> Plaats de samengevoegde eenheid in een centrifuge adapter voor een 15-ml conische buis. Centrifugeer de cartridge bij 5000 xg gedurende 1 min om de resterende vloeistof in het filter te verwijderen. </li><li> Verwijder de collectie buis van de filter cartridge en gooi de buis. Re-cap de inlaatpoort van de patroon. </li><li> Maak een mengsel van 20 pl proteïnase-K-oplossing, 220 ul PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing, niet door de kit) en 200 gl buffer AL. LET OP: De filter cartridge biedt plaats aan maximaal vier keer de omvang van het mengsel (. Ca 1,8 ml). </li><li> Verwijder de inlaat dop en voeg het mengsel (440 pi) in de filter cartridge met een pipet tip. Plaats de pipet volledig in de inlaatpoort zodat de pipetpunt is zichtbaar in de cassette juist boven het membraan. </li><li> Re-cap de inlaatpoort en plaats het filter autocartridge op een roterende shaker. </li><li> Plaats de roterende schudder in de voorverwarmde incubator bij 56 ° C en zet de schudder bij een snelheid van 20 rpm gedurende 20 min. </li><li> Tijdens de incubatie, bereiden een nieuwe 2,0 ml buis, het etiket van de buis op de juiste wijze met een oplosmiddel-proof pen en plaats deze in een 50 ml conische buis. OPMERKING: De eerste (2,0 ml) en tweede buizen (50 ml) worden gebruikt voor het verzamelen van het geëxtraheerde DNA en voor het vasthouden van de buis 2,0 ml, respectievelijk. </li><li> Na de incubatie, verwijder de inlaat dop en plaats de inlaat (niet uitlaat) poort van de patroon in de buis 2,0 ml in de 50 ml conische buis. Sluit de 50 ml conische buis met een schroefdop. </li><li> Centrifugeer de 50 ml conische buis bij 5000 xg gedurende 1 min naar het geëxtraheerde DNA uit de patroon verzamelen. Verwijder de filter cartridge en de 2,0 ml buis met behulp van gesteriliseerde pincet en de dop op de buis. Gooi de filter cartridge. </li></ol> 6. Zuivering van geëxtraheerd DNA LET OP: We elueren eDNA met 100 ui buffer AE in plaats van 200 ul in de handleiding van de commerciële kit. <ol><li> Voeg 200 gl ethanol (96-100%) voor het geëxtraheerde DNA in 2,0 ml-buis van de bovenstaande stap (ongeveer 440 ui) en meng door vortexen. </li><li> Pipet het mengsel in een spinkolom in een 2 ml verzamelbuis. Centrifugeer bij 5000 xg gedurende 1 min. Gooi de doorstroom en de verzamelbuis. </li><li> Plaats de spinkolom in een nieuwe 2 ml verzamelbuis, voeg 500 ul buffer AW1 en centrifugeer gedurende 1 min bij 5000 x g. Gooi de doorstroom en de verzamelbuis. </li><li> Plaats de spinkolom in een nieuwe 2 ml verzamelbuis, voeg 500 pl buffer AW2 en centrifugeer gedurende 3 min bij 20.000 x g. Gooi de doorstroom en de verzamelbuis. </li><li> Bereid een nieuwe 1,5 ml buis (niet door de kit) en label de buis met een geschikte waterdichte pen voor sneldrogende en niet smerend labeling. Transfer de spin kolom to de 1,5 ml buis. </li><li> Elueer het DNA door het toevoegen van 100 pi buffer AE naar het midden van de spinkolom membraan. Incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en centrifugeer bij 6000 xg gedurende 1 min. </li><li> Gooi de spin-kolom en de dop op de buis. Bewaar de gezuiverde DNA bij -20 ° C. </li></ol>

<ol><li>Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+environmental+DNA+to+estimate+the+distribution+of+an+invasive+fish+species+in+ponds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds.</a> PLoS ONE. 8, e56584(2013).</li>
<li>Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+fish+biomass+using+environmental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Estimation of fish biomass using environmental DNA.</a> PLoS ONE. 7, e35868(2012).</li>
<li>Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+near-extinct+European+weather+loach+in+Denmark+based+on+environmental+DNA+from+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Conserv%22%5BJournal%5D)">Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples.</a> Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).</li>
<li>Jerde, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Asian+carp+DNA+as+part+of+a+Great+Lakes+basin-wide+surveillance+program%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Fish.+Aquat.+Sci%22%5BJournal%5D)">Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program.</a> Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).</li>
<li>Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BSight-unseen%26%2334%3B+detection+of+rare+aquatic+species+using+environmental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Conserv.+Lett%22%5BJournal%5D)">&#34;Sight-unseen&#34; detection of rare aquatic species using environmental DNA.</a> Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).</li>
<li>Mahon, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+eDNA+surveillance+sensitivity+for+detection+of+Asian+carps+in+controlled+and+field+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments.</a> PLoS ONE. 8, e58316(2013).</li>
<li>Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+of+fish+species+composition+using+environmental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology%22%5BJournal%5D)">Surveillance of fish species composition using environmental DNA.</a> Limnology. 13, 193-197 (2012).</li>
<li>Keskin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+invasive+freshwater+fish+species+using+environmental+DNA+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Syst.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey.</a> Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).</li>
<li>Wilcox, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+detection+of+rare+species+using+environmental+DNA%3A+the+importance+of+primer+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity.</a> PLoS ONE. 8, e59520(2013).</li>
<li>Thomsen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+a+diverse+marine+fish+fauna+using+environmental+DNA+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples.</a> PLoS ONE. 7, e41732(2012).</li>
<li>Kelly, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+DNA+to+improve+environmental+management%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Harnessing DNA to improve environmental management.</a> Science. 344, 1455-1456 (2014).</li>
<li>Miya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mifish%2C+a+set+of+universal+PCR+primers+for+metabarcoding+environmental+DNA+from+fishes%3A+detection+of+more+than+230+subtropical+marine+species%5BTitle%5D)+AND+%22Roy.+Soc.+Open+Sci%22%5BJournal%5D)">Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species.</a> Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088(2015).</li>
<li>Port, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+vertebrate+biodiversity+in+a+kelp+forest+ecosystem+using+environmental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA.</a> Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).</li>
<li>Yamamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+DNA+provides+a+%27snapshot%27+of+fish+distribution%3A+a+case+study+of+Japanese+jack+mackerel+in+Maizuru+Bay%2C+Sea+of+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Environmental DNA provides a 'snapshot' of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan.</a> PLoS ONE. 11, e0149786(2016).</li>
<li>Valentini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+monitoring+of+aquatic+biodiversity+using+environmental+DNA+metabarcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding.</a> Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).</li>
<li>Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+The+detection+of+aquatic+animal+species+using+environmental+DNA+-+a+review+of+eDNA+as+a+survey+tool+in+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology.</a> J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).</li>
<li>Stewart, F. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStewart%2C+FJ+%22Microbial+metagenomics%2C+Metatranscriptomics%2C+and+metaprotenomics+Vol.+531+Methods+in+Enzymology%22">Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology</a>. DeLong, E. E. 10, Elsevier. Ch. 10 187-218 (2013).</li>
<li>Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+%2820L%2B%29+filtration+of+coastal+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples.</a> J Vis Exp. (28), e1161(2009).</li>
<li>Smalla, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmalla%2C+K+%22Molecular+Microbial+Ecology+Manual%22">Molecular Microbial Ecology Manual</a>. Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. , Springer. 13-22 (1995).</li>
<li>Thomsen, P. F., Willerslev, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+DNA+-+An+emerging+tool+in+conservation+for+monitoring+past+and+present+biodiversity%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Conserv%22%5BJournal%5D)">Environmental DNA - An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity.</a> Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).</li>
<li>Pedersen, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+and+modern+environmental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Ancient and modern environmental DNA.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383(2015).</li>
<li>Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+basin+scale+application+of+environmental+DNA+assessment+for+rare+endemic+species+and+closely+related+exotic+species+in+rivers%3A+a+case+study+of+giant+salamanders+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Ecol%22%5BJournal%5D)">A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan.</a> J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).</li>
<li>Yamanaka, H., Minamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+environmental+DNA+of+fishes+as+an+efficient+method+of+determining+habitat+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol.+Indicators%22%5BJournal%5D)">The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity.</a> Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).</li>
<li>Moss, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliated+protists+from+the+nepheloid+layer+and+water+column+of+sites+affected+by+the+Deepwater+Horizon+oil+spill+in+the+Northeastern+Gulf+of+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22Deep+Sea+Res.+Pt+I%22%5BJournal%5D)">Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico.</a> Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).</li>
<li>Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metatranscriptomics+of+N2-fixing+cyanobacteria+in+the+Amazon+River+plume%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume.</a> The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).</li>
<li>Deiner, K., Walser, J. -C., Mächler, E., Altermatt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+capture+and+extraction+methods+affect+detection+of+freshwater+biodiversity+from+environmental+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Conserv%22%5BJournal%5D)">Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA.</a> Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).</li>
<li>Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+techniques+to+capture+and+extract+environmental+DNA+for+detection+and+quantification+of+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol.+Res%22%5BJournal%5D)">Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish.</a> Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).</li>
<li>Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLemarchand%2C+K+%22Sample+Preparation+Techniques+for+Soil%2C+Plant%2C+and+Animal+Samples%27Springer+Protocols+Handbooks%22">Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples'Springer Protocols Handbooks</a>. Micic, M. , Springer. 325-339 (2016).</li>
<li>Turner, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+size+distribution+and+optimal+capture+of+aqueous+macrobial+eDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Ecol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA.</a> Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).</li>
<li>Barnes, M. A., Turner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecology+of+environmental+DNA+and+implications+for+conservation+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Conserv.+Genet%22%5BJournal%5D)">The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics.</a> Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).</li>
<li>Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopolymers+for+sample+collection%2C+protection%2C+and+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biopolymers for sample collection, protection, and preservation.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).</li>
<li>Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+room+temperature+preservation+of+filtered+environmental+DNA+samples+and+assimilation+into+a+Phenol-Chloroform-Isoamyl+alcohol+DNA+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol.+Res%22%5BJournal%5D)">The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction.</a> Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In veel metabarcoding studies met behulp van milieu monsters zoals water en bodem, post-filtratie behandeling van de filter cartridge is over het algemeen als volgt 24,25: 1) opensnijden of kraken van de behuizing met handgereedschap (slang mes of een tang); 2) verwijdering van het filter uit de patroon; en 3) het snijden van de filter in kleine stukjes met een scheermesje voor DNA-extractie. Om dergelijke omslachtige en tijdrovende procedures die gevoelig zijn voor besmetting in het laboratorium zijn, hebben...

Environmental DNA (eDNA) in het aquatisch milieu verwijst naar genetisch materiaal gevonden in de waterkolom. Recente studies toonden het nut van eDNA voor het detecteren van vissen uit verschillende aquatische milieus, zoals vijvers 1-3, 4-8 rivieren, beken 9 en zeewater 10-14. De meeste van deze studies gericht op de detectie van een enkele of een paar invasieve 1,4-6,8,14 en zeldzame of bedreigde diersoorten 3,9, terwijl sommige recente studies geprobeerd simultane detectie van meerdere soorten in lokale vis gemeenschappen 7,9, 12,13,15 en mesokosmossen 11,12. De laatste benadering wordt genoemd &quot;metabarcoding&quot; en eDNA metabarcoding maakt gebruik van één of meerdere sets van PCR-primers aan een gen regio coamplify over taxonomisch diverse monsters. Daarna volgt bibliotheek preparaat met indexering en toevoeging adapter en de geïndexeerde bibliotheken geanalyseerd door high-throughput parallel sequencingplatform. Onlangs Miya et al. 12 ontwikkelde universele PCR primers voor metabarcoding eDNA van vissen (genaamd &quot;MiFish&quot;). De MiFish primers richten op een hypervariabel gebied van het mitochondriale 12S rRNA-gen (163-185 bp), die voldoende informatie bevat om vissen te identificeren taxonomische familie, geslacht en soort met uitzondering van enkele nauw verwante soortgenoten. Met het gebruik van deze primers in eDNA metabarcoding, Miya et al. 12 ontdekt meer dan 230 subtropische mariene soorten van aquarium tanks met bekende soortensamenstelling en koraalriffen in de buurt van het aquarium. Terwijl het optimaliseren van de metabarcoding protocol natuurlijk zeewater tegemoet met verschillende niveaus van eDNA concentratie van vissen, hebben we gemerkt dat de MiFish primers af en toe niet in geslaagd om het doelgebied voor de latere uitwerking bibliotheek te versterken. Een van de meest voorkomende reden hiervoor mislukte PCR amplificatie gebrek aan voldoende hoeveelheden van de template DNA in kleine hoeveelheden water gefilterd (dwz 1-2 L). Hoewel eDNA concentratie van een bepaalde taxonomische groep onkenbaar is voor de versterking, filtratie van grote volumes water (&gt; 1-2 L) zou een eenvoudige en effectieve manier om meer eDNA te halen op het aquatisch milieu met schaarse vis overvloed en biomassa, zoals open oceaan en de diepzee-ecosystemen. Ten opzichte schijf vezelfilters gewoonlijk in een aantal vissen eDNA onderzoek 16, filterpatronen het voordeel opvang grotere waterhoeveelheden voor verstopping 17. Eigenlijk, een recente studie toonde groot volume (&gt; 20 L) filtratie van de kust zeewater monsters met behulp van filter cartridges 18. Bovendien worden zij afzonderlijk verpakt en steriel en verschillende stappen van de experimentele workflow kan worden uitgevoerd in het filterhuis, waardoor de kans op besmetting door het laboratorium 19 verminderen. Het laatsteeigenschap is essentieel voor eDNA metabarcoding, waarbij het risico van verontreiniging blijft een van de grootste uitdagingen experimentele 20,21. Ondanks deze technische voordelen van de filter cartridges, is deze nog niet gebruikt in eDNA studies van vissen met twee uitzonderingen 8,15. Hier bieden we een protocol voor filtratie van watermonsters met het filterpatroon en extractie van eDNA uit de filter zonder opengesneden de behuizing. We bieden ook twee alternatieve waterfiltratie systemen afhankelijk van de waterstand volumes (≤4 L of&gt; 4 L). Om de prestaties van de nieuw ontwikkelde protocol en een eerder gebruikte protocol met behulp van een glasvezel filter in onze onderzoeksgroep 12,14,22,23 vergelijken, we voeren eDNA metabarcoding analyse van zeewater uit een enorme aquarium tank (7.500 m 3 ) met bekende soortensamenstelling en tonen het aantal gedetecteerde species afgeleid van de twee protocollen als representatieve resultaten. Dit protocol hzoals ontwikkeld voor metabarcoding eDNA van vissen, maar ook voor eDNA uit andere organismen.

<table><tbody><tr><td>Mesh panel</td><td>Iris Ohyama</td><td>MPP-3060-BE</td><td></td></tr><tr><td>Metal prong</td><td>Iris Ohyama</td><td>MR12F</td><td></td></tr><tr><td>Stand for the mesh panel</td><td>No brand</td><td>4184-9507</td><td>beschikbaar bij Amazon Japan</td></tr><tr><td>1 L plastic bag with screw cap</td><td>Yanagi</td><td>DP16-TN1000</td><td></td></tr><tr><td>Male luer-lock connector</td><td>ISIS</td><td>11620</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipette tip</td><td>Eppendorf</td><td>0030 000.765</td><td></td></tr><tr><td>10 L book bottle with valve</td><td>As One</td><td>1-2169-01</td><td></td></tr><tr><td>Sterivex-HV filter</td><td>Millipore</td><td>SVHVL10RC</td><td>aangeduid als "filter cartridge" in het hele document en gebruikt in het protocol</td></tr><tr><td>Male luer fitting</td><td>As One</td><td>1-7379-04</td><td></td></tr><tr><td>Female luer fitting</td><td>As One</td><td>5-1043-14&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Inlet luer cap</td><td>ISIS</td><td>VRMP6</td><td></td></tr><tr><td>Outlet luer cap</td><td>ISIS</td><td>VRFP6</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum tubing</td><td>As One</td><td>6-590-01</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum connector</td><td>As One</td><td>6-663-02</td><td></td></tr><tr><td>Silicone stopper</td><td>As One</td><td>1-7650-07</td><td></td></tr><tr><td>Manifold</td><td>As One</td><td>2-258-01</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator-GAS-1</td><td>As One</td><td>1-7483-21</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp; Tissue Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit</td><td>MO BIO</td><td>14600-50-NF</td><td>aangeduid als "optioneel kit" in het document</td></tr><tr><td>Tabletop Centrifuge</td><td>Kubota</td><td>Model 4000</td><td>Maximale snelheid 6.000 rpm</td></tr><tr><td>Fixed-angle rotor</td><td>Kubota</td><td>AT-508C</td><td></td></tr><tr><td>Adaptor for a 15 ml conical tube</td><td>Kubota</td><td>055-1280</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater Stabilization Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Parafilm</td><td>PM992</td><td>aangeduid als "zelfklevende film"</td></tr></tbody></table>

het gebruik van een filter cartridge voor filtratie van watermonsters en winning van environmental dna

Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA

Recente studies toonden aan dat het gebruik van omgevings-DNA (eDNA) van vissen geschikt is als niet-invasieve monitoringtool. De meeste van deze studies gebruikten schijfvezelfilters om eDNA uit watermonsters te verzamelen, hoewel een aantal microbiële studies in aquatische omgevingen filterpatronen hebben gebruikt, omdat de patroon het voordeel heeft dat deze grote watervolumes kan opnemen en over het algemeen gemakkelijk te gebruiken is. Hier bieden we een protocol voor het filtreren van watermonsters met behulp van de filterpatroon en het extraheren van eDNA uit de filter zonder dat het huis hoef te worden opengesneden. De belangrijkste onderdelen van dit protocol bestaan uit 1) het filteren van watermonsters (watervolumes ≤4 L of >4 L); (2) extractie van DNA op de filter met behulp van een rolschudder geplaatst in een voorverwarmde incubator; en (3) zuivering van DNA met behulp van een commercieel kit. Met het gebruik van dit en eerder gebruikte protocollen, voeren we metabarcoding-analyse uit van eDNA genomen uit een enorm aquarium (7.500 m3) met bekende soortensamenstelling, en tonen het aantal gedetecteerde soorten per bibliotheek van de twee protocollen als de representatieve resultaten. Dit protocol is ontwikkeld voor metabarcoding van eDNA van vissen, maar is ook toepasbaar op eDNA van andere organismen.

Het is technisch moeilijk te isoleren en te kwantificeren alleen vis eDNA van de geëxtraheerde massa eDNA, omdat de MiFish primers coamplify het doelgebied van een aantal niet-vis gewervelde dieren, zoals vogels en zoogdieren, met PCR-producten van dezelfde grootte (ca. 170 bp ) 12. In plaats van het kwantificeren van vis eDNA, voeren we MiFish metabarcoding analyse van eDNA uit een aquarium tank met bekende soortensamenstelling met de twee verschillende methoden van ...

We beschrijven een protocol voor het filtreren van watermonsters met een filtercartridge en het extraheren van omgevings-DNA (eDNA) zonder dat het behuizing hoef te worden geopend om de filter te verwijderen. Dit protocol is ontwikkeld voor metabarcoding van eDNA van vissen, maar is ook toepasbaar op eDNA van andere organismen.

Het gebruik van een filter cartridge voor filtratie van watermonsters en Winning van Environmental DNA

Recent studies demonstrated the use of environmental DNA (eDNA) from fishes to be appropriate as a non-invasive monitoring tool. Most of these studies ...

Het algemene doel van dit protocol is om watermonsters te filteren met een filterpatroon en milieu-DNA te extraheren zonder de behuizing open te hoeven snijden om het filter te verwijderen voor metabarcoding van eDNA van diverse aquatische organismen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het ecologische veld, zoals biodiversiteitsmonitoring en gemeenschapsecologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de filterpatronen grotere watervolumes kunnen verwerken en dat de filtratie en DNA-extractie op steriele wijze kunnen worden uitgevoerd.Om deze procedure te starten, sluit u hogevacuümslangen aan op de ingangsaansluiting van een aspiratiepomp. Sluit het andere uiteinde van de slang aan op een manifold. Zorg ervoor dat de drie rode T-ventielen op de manifold in de uit-stand staan.Trek vervolgens een schoon paar handschoenen aan. Plaats een female luer-koppeling aan het boveneinde van de rubberen vacuümslang. Plaats daarna een vacuümconnector aan het ondereinde.Bevestig zorgvuldig de female luer-koppeling aan een uitlaatpoort van de filterpatroon. Bevestig vervolgens de vacuümaansluiting aan een siliconen stop. Giet één liter van het bemonsterde water in de voorbereide plastic zak.Sluit de schroefdop aan met de mannelijke luer-lock connector. Verbind vervolgens voorzichtig een inlaatpoort van de geassembleerde filtercartridge met de mannelijke luer-lock connector. Controleer of alle verbindingen stevig vastzitten.Hang vervolgens de plastic zak aan twee pinnen van het gaaspaneel. Plaats een siliconen stop in de inlaatpoort van het manifold. Zet daarna de aspirator aan.Open de rode T-ventielen voor filtratie. Laat het manifold lopen totdat de filterpatroon droog is. Sluit vervolgens de rode T-ventielen.Herhaal dit volledige proces om de gewenste hoeveelheid water te filteren. Zodra al het bemonsterde water is gefilterd, verwijdert u voorzichtig de filtercartridge uit de plastic zak en de vacuümcontainer. Sluit beide uiteinden van de cartridge af met de juiste luer-doppen.Label vervolgens de cartridge en de luer-dop van de inlaat met een oplosmiddelbestendige stift. Bewaar bij 20 °C tot de DNA-extractie wordt uitgevoerd. Bereid voor monsters groter dan vier liter een fles van tien liter voor, zoals gedetailleerd in het tekstprotocol.Voeg het te filteren watermonster toe. Plaats vervolgens een pipetteertip van tien milliliter stevig in het ventiel van de fles. Plaats de inlaatpoort van de filtercartridge stevig in de pipetteertip.Plaats vervolgens een siliconen stop in de inlaatpoort van het manifold. Zet de aspirator aan. Open daarna de rode T-ventielen voor filtratie.Laat het vacuümmanifold lopen totdat de filterpatroon droog is. Sluit na voltooiing van de filtratie de rode T-ventielen. Verwijder de patroon voorzichtig uit de plastic zak en de vacuümaansluiting.Sluit vervolgens beide uiteinden van de cartridge af met de juiste luer-doppen. Gebruik een oplosmiddelbestendige pen om de cartridge en de luer-doppen van de inlaat te labelen. Bewaar bij 20 °C tot de DNA-extractie wordt uitgevoerd.Verwarm een incubator voor tot 56 °C. Snijd vervolgens de scharnierende dop van een buisje van 2,0 mL af en gooi de dop weg. Verwijder de luer-inlaatdop van de filtercartridge.Plaats vervolgens de inlaatpoort in de buis van 2,0 milliliter. Afdicht de verbinding tussen de cartridge en de opvangbuis stevig met een zelfdichtende folie. Plaats daarna de gecombineerde eenheid in een centrifuge-adapter voor een conische buis van 15 milliliter.Centrifugeer de cartridge gedurende één minuut bij 5000 ×g om het resterende vloeistof in het filter te verwijderen. Zodra de centrifugatie is voltooid, verwijdert u de opvangbuis uit de filtercartridge en gooit u de buis weg. Sluit vervolgens de inlaatpoort opnieuw af.Meng vervolgens 20 µL proteïne A-Case-oplossing, 220 µL fosfaatgebufferde zoutoplossing en 200 µL buffer AL. Verwijder de inlaatdop en voeg het mengsel met een pipet toe aan de cartridge door de pipet volledig in de inlaatpoort in te brengen. Sluit de inlaatpoort weer af. Plaats de filtercartridge vervolgens op een rotatieschudder.Plaats de rotatorschudder in de voorverwarmde incubator en stel de schudder in op 20 rpm voor 20 minuten. Label tijdens de incubatie een nieuwe buis van 2,0 milliliter met een oplosmiddelbestendige pen. Plaats deze vervolgens in een conische buis van 50 milliliter.Nadat de incubatie is voltooid, verwijdert u de inlaatdop. Plaats vervolgens de inlaatpoort in de nieuwe buis van 2,0 milliliter. Sluit de conische buis af met een schroefdop.Centrifugeer één minuut bij 5000 ×g om het geëxtraheerde DNA te verzamelen. Verwijder vervolgens de cartridge uit de 2,0 milliliter buis met gesteriliseerde pincetten. Sluit de buis af en zuiver het geëxtraheerde DNA zoals beschreven in het tekstprotocol.In deze procedure worden vier verschillende volumes zeewater gefilterd op hetzelfde manifold met behulp van twee unieke filters, waarna het eDNA wordt geëxtraheerd. De filterpatroon detecteerde gemiddeld 50% meer soorten dan de glasvezelfilters. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in twee uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u watermonsters filtert met een filterpatroon, en hoe u eDNA extraheert zonder de behuizing open te hoeven snijden om het filter te verwijderen voor metabarcoding van eDNA van diverse aquatische organismen.

use-filter-cartridge-for-filtration-water-samples-extraction

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

We beschrijven een methode voor de extractie van een hoog moleculair gewicht genomische DNA van plankton biomassa geconcentreerd op 0,22 micrometer Sterivex filters, gevolgd door een cesium chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie voor zuivering.

DNA-extractie van 0,22 uM Sterivex Filters en Cesium Chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie

Dit manuscript beschrijft een geautomatiseerde aanpak voor gelgrootteselectie voor het zuiveren van DNA-fragmenten voor next-generation sequencing. De Ranger-technologie biedt volledige automatisering van het gehele proces van agarose gel laden, elektroforetische analyse en herstel van gerichte DNA-fragmenten, waardoor high-throughput en hoge kwaliteit next-generation sequencing bibliotheken mogelijk zijn.

Geautomatiseerde Gel Size Selectie om de kwaliteit van next-generation sequencing bibliotheken Bereid uit Environmental watermonsters Verbeteren

Dit protocol is voor de extractie en concentratie van eiwitten en DNA uit microbiële biomassa die is verzameld uit zeewater, gevolgd door de generatie van tryptische peptiden die geschikt zijn voor proteomische analyse op basis van tandem massaspectrometrie.

Een Aquatic Microbial MetaProteomics Workflow: Van cellen tot Tryptic Peptiden geschikt voor Tandem massaspectrometrie-gebaseerde Analyse

Twee complementaire analyses van biologische atmosferische deeltjes uit bemonsterde luchtfilters worden hier beschreven: de extractie en detectie van endotoxine en van DNA.

-Air bemonsterd Filter Analyse voor endotoxinen en DNA Content

We beschrijven hier een eenvoudige en snelle papieren DNA extractiewerkwijze HIV provirale DNA uit vol bloed gedetecteerd met kwantitatieve PCR. Dit protocol kan worden verlengd voor gebruik bij het detecteren andere genetische merkers of alternatieve amplificatiewerkwijzen.

Filtratie Isolatie van nucleïnezuren: Een eenvoudige en snelle DNA Extraction Method

Hier presenteren we een protocol om de effecten van hydraulische breuken op nabijgelegen beken te onderzoeken door hun water- en sedimentmicrobiële gemeenschappen te analyseren.

Evaluatie van de impact van hydraulische breuk op stromen met behulp van microbiële moleculaire handtekeningen

Hier presenteren we een eenvoudige techniek om antimicrobiële resistentie in het milieu (AMR) te beoordelen door het aandeel extracellulair DNA met een laag moleculair gewicht te verbeteren. Voorafgaande behandeling met 20%-30% PEG en 1,2 M NaCl maakt detectie van zowel genomische als horizontaal overgedragen AMR-genen mogelijk. Het protocol leent zich voor een kit-vrij proces met extra optimalisatie.

Verbeterde extractie van DNA met een laag moleculair gewicht uit afvalwater voor uitgebreide beoordeling van antimicrobiële resistentie 

Hier presenteren we een nieuw protocol om marien eDNA op te halen door het verzamelen en filteren van zeewatermonsters van operationele veerboten en andere commerciële schepen.

Het drijvende laboratorium: standaard operationele procedure voor het verzamelen en filteren van zeewatermonsters van operationele veerboten voor milieu-DNA-analyse

Betrouwbare en nauwkeurige vormen van veldinzetbare DNA-analyse zijn cruciaal voor veel industrieën. Dit artikel biedt twee methoden voor milieumicrobiële analyse in het veld: 1) de isolatie van microbieel DNA uit omgevingsmonsters met behulp van een biologische extractie-veldkit, en 2) de analyse van DNA via de field qPCR-eenheid.

Microbieel DNA-onderzoek in het veld met behulp van een biologische extractie-veldkit en een veld-qPCR-eenheid

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde workflow voor het verzamelen van ececa DNA (eDNA)-monsters van walvisobservatievaartuigen. De haalbaarheid voor onderzoekers en getrainde burgerwetenschappers wordt vooropgesteld, terwijl omgevingsomstandigheden, filtratietijd, troebelheid en logistiek aan boord de praktische grenzen van de toepassing bepalen.

Milieu-DNA-monsters van walviskijkvaartuigen voor walvisachtige monitoring

Leer een niet-invasieve methode voor eDNA-extractie uit watermonsters met filtercartridges voor metabarcoding van aquatische organismen. Deze techniek ondersteunt biodiversiteitsmonitoring en ecologisch onderzoek.

Het gebruik van een filter cartridge voor filtratie van watermonsters en Winning van Environmental DNA

Meer video's verkennen