Het gebruik van een filter cartridge voor filtratie van watermonsters en Winning van Environmental DNA

Het algemene doel van dit protocol is om watermonsters te filteren met een filterpatroon en milieu-DNA te extraheren zonder de behuizing open te hoeven snijden om het filter te verwijderen voor metabarcoding van eDNA van diverse aquatische organismen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het ecologische veld, zoals biodiversiteitsmonitoring en gemeenschapsecologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de filterpatronen grotere watervolumes kunnen verwerken en dat de filtratie en DNA-extractie op steriele wijze kunnen worden uitgevoerd.

Om deze procedure te starten, sluit u hogevacuümslangen aan op de ingangsaansluiting van een aspiratiepomp. Sluit het andere uiteinde van de slang aan op een manifold. Zorg ervoor dat de drie rode T-ventielen op de manifold in de uit-stand staan.

Trek vervolgens een schoon paar handschoenen aan. Plaats een female luer-koppeling aan het boveneinde van de rubberen vacuümslang. Plaats daarna een vacuümconnector aan het ondereinde.

Bevestig zorgvuldig de female luer-koppeling aan een uitlaatpoort van de filterpatroon. Bevestig vervolgens de vacuümaansluiting aan een siliconen stop. Giet één liter van het bemonsterde water in de voorbereide plastic zak.

Sluit de schroefdop aan met de mannelijke luer-lock connector. Verbind vervolgens voorzichtig een inlaatpoort van de geassembleerde filtercartridge met de mannelijke luer-lock connector. Controleer of alle verbindingen stevig vastzitten.

Hang vervolgens de plastic zak aan twee pinnen van het gaaspaneel. Plaats een siliconen stop in de inlaatpoort van het manifold. Zet daarna de aspirator aan.

Open de rode T-ventielen voor filtratie. Laat het manifold lopen totdat de filterpatroon droog is. Sluit vervolgens de rode T-ventielen.

Herhaal dit volledige proces om de gewenste hoeveelheid water te filteren. Zodra al het bemonsterde water is gefilterd, verwijdert u voorzichtig de filtercartridge uit de plastic zak en de vacuümcontainer. Sluit beide uiteinden van de cartridge af met de juiste luer-doppen.

Label vervolgens de cartridge en de luer-dop van de inlaat met een oplosmiddelbestendige stift. Bewaar bij 20 °C tot de DNA-extractie wordt uitgevoerd. Bereid voor monsters groter dan vier liter een fles van tien liter voor, zoals gedetailleerd in het tekstprotocol.

Voeg het te filteren watermonster toe. Plaats vervolgens een pipetteertip van tien milliliter stevig in het ventiel van de fles. Plaats de inlaatpoort van de filtercartridge stevig in de pipetteertip.

Plaats vervolgens een siliconen stop in de inlaatpoort van het manifold. Zet de aspirator aan. Open daarna de rode T-ventielen voor filtratie.

Laat het vacuümmanifold lopen totdat de filterpatroon droog is. Sluit na voltooiing van de filtratie de rode T-ventielen. Verwijder de patroon voorzichtig uit de plastic zak en de vacuümaansluiting.

Sluit vervolgens beide uiteinden van de cartridge af met de juiste luer-doppen. Gebruik een oplosmiddelbestendige pen om de cartridge en de luer-doppen van de inlaat te labelen. Bewaar bij 20 °C tot de DNA-extractie wordt uitgevoerd.

Verwarm een incubator voor tot 56 °C. Snijd vervolgens de scharnierende dop van een buisje van 2,0 mL af en gooi de dop weg. Verwijder de luer-inlaatdop van de filtercartridge.

Plaats vervolgens de inlaatpoort in de buis van 2,0 milliliter. Afdicht de verbinding tussen de cartridge en de opvangbuis stevig met een zelfdichtende folie. Plaats daarna de gecombineerde eenheid in een centrifuge-adapter voor een conische buis van 15 milliliter.

Centrifugeer de cartridge gedurende één minuut bij 5000 ×g om het resterende vloeistof in het filter te verwijderen. Zodra de centrifugatie is voltooid, verwijdert u de opvangbuis uit de filtercartridge en gooit u de buis weg. Sluit vervolgens de inlaatpoort opnieuw af.

Meng vervolgens 20 µL proteïne A-Case-oplossing, 220 µL fosfaatgebufferde zoutoplossing en 200 µL buffer AL. Verwijder de inlaatdop en voeg het mengsel met een pipet toe aan de cartridge door de pipet volledig in de inlaatpoort in te brengen. Sluit de inlaatpoort weer af. Plaats de filtercartridge vervolgens op een rotatieschudder.

Plaats de rotatorschudder in de voorverwarmde incubator en stel de schudder in op 20 rpm voor 20 minuten. Label tijdens de incubatie een nieuwe buis van 2,0 milliliter met een oplosmiddelbestendige pen. Plaats deze vervolgens in een conische buis van 50 milliliter.

Nadat de incubatie is voltooid, verwijdert u de inlaatdop. Plaats vervolgens de inlaatpoort in de nieuwe buis van 2,0 milliliter. Sluit de conische buis af met een schroefdop.

Centrifugeer één minuut bij 5000 ×g om het geëxtraheerde DNA te verzamelen. Verwijder vervolgens de cartridge uit de 2,0 milliliter buis met gesteriliseerde pincetten. Sluit de buis af en zuiver het geëxtraheerde DNA zoals beschreven in het tekstprotocol.

In deze procedure worden vier verschillende volumes zeewater gefilterd op hetzelfde manifold met behulp van twee unieke filters, waarna het eDNA wordt geëxtraheerd. De filterpatroon detecteerde gemiddeld 50% meer soorten dan de glasvezelfilters. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze in twee uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u watermonsters filtert met een filterpatroon, en hoe u eDNA extraheert zonder de behuizing open te hoeven snijden om het filter te verwijderen voor metabarcoding van eDNA van diverse aquatische organismen.