Name: A-drijfvermogen gebaseerde methode voor het bepalen vetgehalte in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T11:15:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Leer een drijfvermogen-gebaseerde methode om vetgehalte te meten in Drosophila melanogaster larven. Deze snelle, economische techniek helpt onderzoekers bij het screenen van vetopslagveranderingen door genetica of dieet.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

K.E.H. werd ondersteund door de Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730. Dit werk werd ondersteund door NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 en AHA Award 12BGIA11930014 aan T.R.

1. Verzamel eieren van Vliegen met genotypen van Interest OPMERKING: Ideale kruisen bestaan ​​uit 150 virgin vliegen en ten minste 75 mannen. De verzamelingen moet bestaan ​​uit ten minste 200 vliegen. <ol><li> Bereid druif platen. <ol><li> Voeg 37,5 g agar tot 1,5 liter gedestilleerd water in een 4 L kolf. </li><li> Autoclaaf water / agar mix voor 50 min bij 121 ° C (250 ° F). </li><li> Terwijl water / agar mix is ​​een autoclaaf, voeg 50 g sucrose tot 500 ml druivensap en roer met een roerstaaf op een verwarmde roer plaat totdat sucrose is opgelost. </li><li> Zet het vuur en blijf roeren tot het druivensap / sucrose mengsel afkoelen tot onder de 70 ºC. Test de binnentemperatuur met een alcohol thermometer. </li><li> Voeg 3 g Drosophila schimmelwerend middel (bijvoorbeeld Tegosept) tot druivensap / sucrose mengsel opwarmen en roer om op te lossen. </li><li> Wanneer het water / agar mengsel uit de autoclaaf, laat de kolf afkoelen tot de aanraking door zwenken af ​​en toe. </li><li&gt; Combineer water / agar mengsel en druivensap / sucrose mengsel en roer tot goed gemengd. </li><li> Gebruik een serologische pipet tot 8 toe - 10 ml van de druif mengsel aan de deksel van een kleine petrischaal (35 x 10 mm stijl). Laat het mengsel hogere kroon dan de hoogte van het deksel muren om een ​​convexe vorm te vormen. </li><li> Sta druif platen afkoelen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd en vervolgens in een luchtdichte houder bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Bereid gist plakken. <ol><li> Voeg 6 ml fosfaatbufferoplossing (PBS) tot 4 gram levend actieve gedroogde gist in een 50 ml conische buis en meng met een spatel tot een gladde massa. </li><li> Store gist plakken bij 4 ºC. </li></ol></li><li> Voeg een kleine klodder (ongeveer 1/8 theelepel) van gist deeg naar het midden van een druif plaat. Gladstrijken eventuele ruwe randen met een spatel. </li><li> Plaats druif platen in een incubator totdat omgevingstemperatuur bereikt. </li><li> Transfer vliegen van belang in een eicel opvangruimte en plaats druif plaat wet gist pasta naar binnen gericht op de top. Tape druif plaat om het ei collectie kamer om te voorkomen dat de plaat vallen. Zorg ervoor dat u belangrijke genotype en actuele informatie over de bodem van de druif plaat te schrijven. </li><li> Upend het ei collectie kamer om de vliegen om eieren te leggen op de druif plaat. </li><li> Plaats een doos of bedekken het ei verzameling kamers en plaats ze in een incubator bij 25 ºC. </li><li> Laat vliegen om eieren te leggen voor 4-6 uur. </li><li> Einde collectie door het nemen van de druif plaat uit het ei opvangruimte en de overdracht van de vliegen terug in hun fles voedsel. Gebruik een spatel om af te vegen overtollige gist plakken van de druif plaat. Store druif plaat in een grotere petrischaal in een bevochtigde incubator bij 25 ºC voor ~ 24 uur. </li></ol> 2. Breng Larven naar Experimental Eten <ol><li> Bereid experimentele voedsel. LET OP: Dit voedsel recept is gebaseerd op de Bloomington voorraad centrum recept 18. belangrijke wijzigingenomvatten verhoogde hoeveelheid gist om de voedingswaarde van het levensmiddel optimaliseren zoals beoordeeld door timing van zwerven fase (tussen 112-120 uur na eierverzameling bij 25 ° C). Hoewel we dit recept ideaal voor de gezondheid en ontwikkeling van onze experimentele larven gevonden, geen voedsel recept is aanvaardbaar gezien kalibratie met positieve en negatieve controles, waarvan voorbeelden in stap 3.10 worden vermeld. <ol><li> Meet 1600 ml gedestilleerd water. </li><li> Meng 134 g maïsmeel, 10,6 g Drosophila Agar Type II, en wat water (~ 500 ml) in een 1 L beker. Meng gedurende 2 minuten met een gemotoriseerde handmixer. </li><li> Meng 70 gram levend actieve gedroogde gist, 18,4 g sojameel, 84,8 g moutextract, en wat water (~ 500 ml) in een 1 L beker. Meng gedurende 2 minuten met een gemotoriseerde handmixer. </li><li> Swirl elke beker en giet het in een 4 L kolf. Gebruik de rest van het water te spoelen de bekers en toe te voegen in de kolf. </li><li> Meet 140 ml lichte glucosestroop en toe te voegen aan de kolf, meng door zwenken. &lt;/ Li&gt; <li> Autoclaaf gedurende 50 minuten bij 121 ° C (250 ° F) in de vloeibare omgeving. </li><li> Na behandeling in een autoclaaf, giet het voedsel in een 4 L beker en laat afkoelen. Help het koelproces door het mengen met een gemotoriseerde handmixer. </li><li> Zodra de kolf genoeg aan de orde is afgekoeld, voeg 8,8 ml propionzuur en 16,8 ml Drosophila antischimmelmiddel / ethanoloplossing. Goed mengen. (Voeg Drosophila anti-schimmel middel oplossing door het toevoegen van 380 g Drosophila anti-schimmel middel tot 1 L 200 proof ethanol en roeren op een warm bord totdat het is opgelost, zorg ervoor dat de oplossing niet hoger is dan 70 ºC.) </li><li> Giet voedsel in flesjes tot het eten ongeveer 1 inch diep en laat het afkoelen bij kamertemperatuur 2-3 uur. Plug flesjes en op te slaan in een incubator bij 25 ºC. Gebruik binnen een week. </li></ol></li><li> Duik een spatel een paar keer in de bovenste laag van de flacon van het voedsel te scoren. Dit zal helpen de larven te graven en te voeden. </li><li> 22-24 uur na ei collectie heeftended, gebruik dan een kleine penseel tot 50 eerste larvestadium (L1) larven van ongeveer dezelfde grootte te verzamelen. Plaats larven in de experimentele voeding. Reinig het penseel op een laboratorium doekje en zorgen dat er geen resterend larven op de verfkwast over te gaan naar een ander genotype. </li><li> Plaats flacon van larven in een incubator bij 25 ° C en laten ontwikkelen. </li></ol> 3. Bepaal vetgehalte in Larven <ol><li> Bereid oplossingen. <ol><li> Bereid 1 L 10x PBS voorraad. <ol><li> Voeg 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4 en 2,4 g KH 2 PO 4-800 ml water in een 2 L bekerglas met een roerstaaf. Roer met geen warmte totdat alle zouten worden opgenomen. Breng de pH tot 7,4. Verhoog het volume op 1 liter met water. </li></ol></li><li> Bereid 2 L 1x PBS. Voeg 200 ml 10x PBS stockoplossing aan 1800 ml water. </li><li> Gebruik deze voorraad 1x PBS om 20% w / v sucrose. </li></ol></li><li> Verwijder de flacon van larven van deincubator zodra er 20-40 larven dwalen de zijkanten van de flacon (meestal op de vijfde dag na de ei-collecties). De datum en tijd van de test en het aantal larven zwerven. </li><li> Bereid experimentele door toevoeging van 11,5 ml PBS en 9 ml 20% sucrose een 50 ml conische buis. </li><li> Voeg 20% ​​sucrose aan het flesje tot het 0,5-1 inch vanaf de bovenkant van de flacon. </li><li> Met een spatel roer de toplaag van voedsel aan vrije larven die nog gravende in het voedsel. Alle larven naar de oppervlakte van het sucrose-oplossing. </li><li> Tang om de larven voorzichtig brengen in de oorspronkelijke sucrose concentratie van stap 3,3. </li><li> Met een spatel roer de larven in deze oplossing. </li><li> Cap de conische buis en upend meerdere malen om de oplossing goed te mengen. </li><li> Haal het beschermkapje van de conische buis en schud om een ​​zachte vortex te creëren. </li><li> Laat de larven bezinken, hetzij drijven naar de top van de oplossing of siNKing onderaan. Wacht 2-5 minuten voor de larven om zich te vestigen. LET OP: Als er nog steeds larven die niet zijn zeker ofwel drijvende of zinken, kies een lijn te gebruiken als een afkappunt om de larven te bestempelen als ofwel een floater of een verzwaringslichaam. Breng dit hetzelfde criterium om alle genotypen. We gebruiken de hoek bij de bodem van de conische buis als onze grens. ADP of Sir2 17 mutant larven kan worden gebruikt als een positieve controle en lsd2 19 mutanten kan worden gebruikt als negatieve controle voor het kalibreren van de test. </li><li> Noteer het aantal drijvende larven en de specifieke geteste concentratie. </li><li> Voeg 1 ml 20% sucrose om de experimentele oplossing om de dichtheid te verhogen. </li><li> Herhaal stap 3,7-3,10. Noteer het aantal drijvende larven en deze nieuwe concentratie. </li><li> Verder stappen 3,12 en 3,13 tot ten minste 95% van de larven drijven. </li><li> Gebruik een tang om alle larven verzamelen in een dissectie schotel gevuld met PBS. </li><li> ObsErve larven onder een microscoop en de opmerking als er sprake is van kleine larven, pre-poppen, poppen, of enige andere verschillen tussen genotypen. Opmerking: In het ideale geval zouden alle larven homogeen en tegelijk ontwikkelingsstadium weergegeven. We hebben alleen waargenomen in overeenstemming vet metingen onder deze omstandigheden. </li><li> Noteer het totale aantal larven. </li><li> Behulp van een tang, transfer 10 larven naar een laboratorium vegen drogen. Label een microcentrifugebuis en plaats 10 larven in de buis. </li><li> Flash bevriezen van de larven in vloeibare stikstof. Bewaar de buis bij -20 ºC. </li></ol>

<ol><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+the+golden+bug%2C+emerges+as+a+tool+for+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).</li>
<li>Liu, Z., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+in+Drosophila+development+and+disease+Using+Drosophila+System+to+Study+Lipid+Metabolism+Lipids+Function+in+Drosophila+Early+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism in Drosophila development and disease Using Drosophila System to Study Lipid Metabolism Lipids Function in Drosophila Early Development.</a> Acta Biochim Biophys Sin. 45 (1), 44-50 (2013).</li>
<li>Ruden, D. M., Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+conservation+of+metabolism+explains+howDrosophila+nutrigenomics+can+help+us+understand+human+nutrigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Nutr%22%5BJournal%5D)">Evolutionary conservation of metabolism explains howDrosophila nutrigenomics can help us understand human nutrigenomics.</a> Genes Nutr. 1 (2), 75-84 (2006).</li>
<li>Wolf, M. J., Rockman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+genetic+screens%2C+and+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Drosophila, genetic screens, and cardiac function.</a> Circ. Res. 109, 794-806 (2011).</li>
<li>Trinh, I., Boulianne, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+obesity+and+its+associated+disorders+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Modeling obesity and its associated disorders in Drosophila.</a> Physiology (Bethesda). 28 (2), 117-124 (2013).</li>
<li>Azeez, O. I., Meintjes, R., Chamunorwa, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+body%2C+fat+pad+and+adipose+tissues+in+invertebrates+and+vertebrates%3A+the+nexus%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Fat body, fat pad and adipose tissues in invertebrates and vertebrates: the nexus.</a> Lipids Health Dis. 13, 71(2014).</li>
<li>Dourlen, P., Sujkowski, A., Wessells, R., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+transport+proteins+in+disease%3A+New+insights+from+invertebrate+models%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Fatty acid transport proteins in disease: New insights from invertebrate models.</a> Prog. Lipid Res. 60, 30-40 (2015).</li>
<li>Hildebrandt, A., Bickmeyer, I., Kühnlein, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+Drosophila+body+fat+quantification+by+a+coupled+colorimetric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliable Drosophila body fat quantification by a coupled colorimetric assay.</a> PLoS One. 6 (9), e23796(2011).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68, 105-115 (2014).</li>
<li>Al-Anzi, B., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+measurement+of+triglycerides+cannot+provide+an+accurate+measure+of+stored+fat+content+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Colorimetric measurement of triglycerides cannot provide an accurate measure of stored fat content in Drosophila.</a> PLoS One. 5 (8), e12353(2010).</li>
<li>Thanh, N. T. K., Stevenson, G., Obatoml, D., Bach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Lipids+in+Animal+Tissues+by+High-Performance+Thin-Layer+Chromatography+with+Densitometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Planar+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Determination of Lipids in Animal Tissues by High-Performance Thin-Layer Chromatography with Densitometry.</a> J. Planar Chromatogr. 13, 375-381 (2000).</li>
<li>Borrull, A., Lopez-Martinez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozes, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Lipid+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> Eur. J. Lipid Sci. Technol. 117, 274-280 (2015).</li>
<li>Shui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+one+step+analysis+of+cellular+lipidomes+using+liquid+chromatography+coupled+with+mass+spectrometry%3A+application+to+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Toward one step analysis of cellular lipidomes using liquid chromatography coupled with mass spectrometry: application to Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe lipidomics.</a> Mol. Biosyst. 6, 1008-1017 (2010).</li>
<li>Farvid, M. S., Ng, T. W. K., Chan, D. C., Barrett, P. H. R., Watts, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+adiponectin+and+resistin+with+adipose+tissue+compartments%2C+insulin+resistance+and+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes.+Obes.+Metab%22%5BJournal%5D)">Association of adiponectin and resistin with adipose tissue compartments, insulin resistance and dyslipidaemia.</a> Diabetes. Obes. Metab. 7 (4), 406-413 (2005).</li>
<li>Urbanchek, M. G., Picken, E. B., Kalliainen, L. K., Kuzon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+force+deficit+in+skeletal+muscles+of+old+rats+is+partially+explained+by+the+existence+of+denervated+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol.+A.+Biol.+Sci.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Specific force deficit in skeletal muscles of old rats is partially explained by the existence of denervated muscle fibers.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56A (5), B191-B197 (2001).</li>
<li>Mosher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+between+Drosophila+Arc1+and+a+specific+population+of+brain+neurons+regulates+organismal+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordination between Drosophila Arc1 and a specific population of brain neurons regulates organismal fat.</a> Dev. Biol. 405 (2), 280-290 (2015).</li>
<li>Reis, T., van Gilst, M. R., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+buoyancy-based+screen+of+drosophila+larvae+for+fat-+storage+mutants+reveals+a+role+for+Sir2+in+coupling+fat+Storage+to+Nutrient+Availability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A buoyancy-based screen of drosophila larvae for fat- storage mutants reveals a role for Sir2 in coupling fat Storage to Nutrient Availability.</a> PLoS Genet. 6 (11), e1001206(2010).</li>
<li>Current Bloomington Recipe for Drosophila Medium. , Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University. Available from:
 <a target="_blank" href="http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/bloomfood.htm">http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/bloomfood.htm</a> (2014).</li>
<li>Teixeira, L., Rabouille, C., Rørth, P., Ephrussi, A., Vanzo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Perilipin%2FADRP+homologue+Lsd2+regulates+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Drosophila Perilipin/ADRP homologue Lsd2 regulates lipid metabolism.</a> Mech. Dev. 120 (9), 1071-1081 (2003).</li>
<li>Perez, C. L., Van Gilst, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+13C+Isotope+Labeling+Strategy+Reveals+the+Influence+of+Insulin+Signaling+on+Lipogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">A 13C Isotope Labeling Strategy Reveals the Influence of Insulin Signaling on Lipogenesis in C. elegans.</a> Cell Metab. 8, 266-274 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Er zijn een groot aantal technieken die zijn ontwikkeld om lipiden te meten 8-10. Echter, elk van deze methoden geleverd met een aantal belangrijke nadelen zijn die onder het drijfvermogen gebaseerde test hierboven beschreven. Ten eerste, deze test is erg snel. Het testen van een volledige concentratie gradiënt duurt niet langer dan 30 - 60 min. Dit is een enorme verbetering ten opzichte van de meeste van de technieken die momenteel worden gebruikt. Bijvoorbeeld lipide kwantificering doo...

Drosophila melanogaster is gebruikt voor meer dan een eeuw in de studie van de genetica en andere fundamentele biologische vragen. In de afgelopen decennia is duidelijk geworden dat Drosophila is een krachtig instrument in de studie van vele ziekten bij de mens. 70 - 80% van de genen geassocieerd met ziekten bij de mens een geïdentificeerde fly ortholoog 1-4, Drosophila biedt een vereenvoudigde, doch vertaalbare systeem om complexe ziekten te bestuderen. Metabolisme in het bijzonder heeft geprofiteerd van een dergelijke studie. Niet alleen zijn de genetica van metabolisme goed geconserveerd tussen vliegen en mensen, maar de betrokken organen en celtypen zijn ook vergelijkbaar 2,5. Bijvoorbeeld, het vet lichaam van de vlieg winkels zowel triacylglyceriden (TAG) en glycogeen, functioneert analoog met die welke in zoogdierlijke lever en wit vetweefsel 6. Met behulp van Drosophila als model voor humane obesitas is enorm verbeterd ons begrip van lipidemetabolisme en de genetica van obesitas 7. Het larvale stadium van ontwikkeling is bijzonder nuttig voor het bestuderen van de scheiding van voedingsmiddelen bij opslag en gebruik zoals het is gewijd aan voeding en energieopslag in verpopping te gebruiken. Momenteel zijn er veel verschillende kwantitatieve werkwijzen voor het bepalen vetopslag niveaus in Drosophila. De meest gebruikte methode is de gekoppelde colorimetrische assay (CCA) 8,9. CCA is ontwikkeld voor het bepalen TAG niveaus in serum en werkt op de vooronderstelling dat glycerol bevrijd van de ruggengraat van triglyceriden De volgende reacties ondergaan uiteindelijk resulteert in een redox-gekoppelde reactie opwekken van een gekleurd product. De absorptie van specifieke golflengten van licht wordt dan gemeten op de aanvankelijke hoeveelheid glycerol aanwezig bepalen. Echter, kan glycerol worden bevrijd van mono- en diacylglycerides naast TAG en derhalve kan geen nauwkeurige maat s bedragentroleerd lichaamsvet 9. Bovendien kan oog pigment gemalen volwassen vliegen storen met absorptie lezingen en compliceren resultaten 9,10. Daarom moet CCA vergezeld en gevalideerd door dunnelaagchromatografie (TLC), waardoor de scheiding van de meeste families lipide dat kan worden gekwantificeerd met densitometrie 10,11. Echter, sommige lipide klassen zoals sterolen niet worden geanalyseerd en moeten op een andere manier 12 worden gekwantificeerd. Massaspectrometrie (MS) is een nauwkeurige manier om alle klassen van de grote mobiele lipiden 12,13 kwantificeren. Echter, de lipide-extractie procedures die nodig zijn om te analyseren door MS zijn zowel tijdrovend (de meeste nemen bijna een hele dag) en kostbaar. Hier geven we een alternatieve methode om snel en goedkoop organismale vetgehalte bepalen de L3 larven van Drosophila melanogaster. De methode hieronder maakt gebruik van het verschil in dichtheid tussen vetweefsel en mager weefsel. Mammalian fat weefsel heeft een dichtheid van ongeveer 0,9 g / ml 14 terwijl skeletspier een dichtheid van 1,06 g / ml 15. Dit verschil betekent dat dieren met hogere slaat vet lagere dichtheid dan dieren met een lagere winkels vet, waardoor ze beter zweven in een oplossing van vaste dichtheid hebben. Deze eigenschap maakt extreem snelle screening van een groot aantal dieren terwijl zowel goedkoop en niet-invasief. Drijfvermogen gebaseerde analyse is gebruikt om zowel de fenotypen van wijziging bekende regulatoren van vetgehalten en om nieuwe genetische en neurologische regulatoren identificeren van obesitas 16,17 bevestigen.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Welch's Original 100% Grape Juice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher</td><td>S512</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-259</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Baker's yeast</td><td>Fleichmann's</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yellow Corn Meal</td><td>Quaker</td><td></td><td>Verrijkt ontkiemd</td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Apex</td><td>66-104</td><td></td></tr><tr><td>Soy Flour</td><td>ADM Specialty Ingredients</td><td>062-100</td><td></td></tr><tr><td>Malt Extract</td><td>Breiss</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Light Corn Syrup</td><td>Karo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propionic Acid</td><td>VWR</td><td>U330-09</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher</td><td>50147491</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate anhydrous</td><td>Fisher</td><td>S3933</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P330-500</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm petri plate</td><td>Fisher</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical</td><td>Fisher</td><td>50-869-569</td><td></td></tr></tbody></table>

a-drijfvermogen gebaseerde methode voor het bepalen vetgehalte in<em&gt; drosophila</em

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Drosophila melanogaster is een belangrijk experimenteel systeem in de studie van vetregulatie. Er bestaan momenteel talrijke technieken om de niveaus van opgeslagen vet in Drosophila te meten, maar de meeste zijn duur en/of arbeidsintensief en hebben duidelijke beperkingen. Hier presenteren we een methode om snel en goedkoop de vetniveaus van organismen in L3 Drosophila-larven te bepalen. De techniek is gebaseerd op de verschillen in dichtheid tussen vet- en magere weefsels en maakt een snelle detectie van vette en magere fenotypen mogelijk. We hebben de nauwkeurigheid van deze methode geverifieerd door vergelijking met het percentage lichaamsvet zoals bepaald door extractie van neutrale lipiden en gaschromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (GCMS). Verder geven we gedetailleerde protocollen voor het verzamelen en synchroniseren van larven, evenals relevante experimentele recepten. De hieronder gepresenteerde techniek overwint de belangrijkste tekortkomingen van de meest gebruikte methoden voor lipidenkwantificering en biedt een krachtige manier om snel en gevoelig L3-larven te screenen op fenotipen van vetregulatie, terwijl de integriteit van de larven behouden blijft. Deze assay heeft brede toepassingen voor de studie van metabolisme en vetregulatie met behulp van Drosophila.

Figuur 1 geeft een voorbeeld van hoe het drijfvermogen gebaseerde test zowel hogere als lagere vetopslag in genetisch gemanipuleerde larven kunnen detecteren. Figuur 1A toont dat excitatie of silencing van een bepaalde subset van neuronen (E347) in het larvale hersenen induceert lagere en hogere vetgehalte winkels respectievelijk. Dezelfde genetische achtergrond controle werd gebruikt in beide gevallen. Figuur 1B is een voorbeeld van hoe...

Hier presenteren we een methode om organismal vetgehalte in het derde instar (L3) larvale stadium van Drosophila melanogaster gemeten. Deze methode maakt gebruik van de relatief lage dichtheid van vetweefsel om onderscheid te maken tussen de larven met gewijzigde vetreserves. Drijfvermogen gebaseerde analyse is een waardevol hulpmiddel voor snelle, reproduceerbare en economisch screening.

A-drijfvermogen gebaseerde methode voor het bepalen vetgehalte in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat ...

Het algemene doel van deze assay is om eventuele veranderingen in de vetopslagniveaus vast te stellen die kunnen worden veroorzaakt door een verandering in genetica, dieet of behandeling. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van het metabolisme, zoals genetische of neuronale bijdragen aan de aanleg voor obesitas. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze snel, economisch en zeer reproduceerbaar is in vergelijking met andere momenteel gebruikte methoden.Personen die niet bekend zijn met deze methode of met het werken met larven in het zwerfstadium kunnen moeite hebben met dit protocol, aangezien de ontwikkelingstijdlijn van verschillende genotypen sterk kan variëren. Begin deze procedure door een kleine hoeveelheid gistpasta in het midden van een roosterplaat aan te brengen. Strijk eventuele ruwe randen glad met een spatel.Breng vervolgens de gewenste vliegen over naar een eieropvangkamer en plaats de roosterplaat met gistpasta aan de bovenkant met de voorkant naar binnen. Plak daarna de roosterplaat aan de eieropvangkamer vast om te voorkomen dat deze eruit valt. Zorg ervoor dat belangrijke informatie over het genotype en de datum op de onderkant van de roosterplaat wordt genoteerd.Keer vervolgens de eieropvangkamer om zodat de vliegen eieren op de roosterplaat kunnen leggen. Plaats daarna een open doos over de eieropvangkamer en zet de afgedekte eieropvangkamer vier tot zes uur in een incubator bij 25 degrees celsius om de vliegen de tijd te geven eieren te leggen. Haal na afloop de roosterplaat uit de eieropvangkamer en breng de vliegen terug naar hun oorspronkelijke voedingsfles.Gebruik een spatel om overtollige gistpasta van de roosterplaat af te vegen. Bewaar de roosterplaat vervolgens in een grotere Petrischaal in een bevochtigde incubator bij 25 degrees celsius gedurende 24 uur. Maak in deze procedure inkepingen in de bovenste laag van het voedsel door er meerdere keren met een spatel in te prikken, zodat de larven kunnen graven en zich kunnen voeden.Gebruik 22 tot 24 uur na de eiverzameling een klein penseel om 50 eerste-instarslarven van ongeveer dezelfde grootte te verzamelen en plaats de larven in het experimentele voedingsbuisje. Het is zeer belangrijk dat larven van ongeveer dezelfde grootte worden geselecteerd en overgebracht naar het experimentele voeding. Dit garandeert een nauwe coördinatie van de larvale ontwikkeling.Maak vervolgens het penseel schoon met een laboratoriumdoekje en zorg ervoor dat er geen larven meer aan het penseel zitten voordat u overgaat naar een ander genotype. Plaats de vial met larven daarna in een incubator bij 25 °C en laat ze zich ontwikkelen. Haal de vial met larven uit de incubator zodra er 20 tot 40 larven langs de wanden van de vial omhoog kruipen.Noteer de datum en het tijdstip van de assay en het aantal dwalende larven. Bereid vervolgens de experimentele oplossing voor door 11,5 milliliters PBS en negen milliliters 20%sucrose aan een 50 milliliter conische buis toe te voegen. Voeg 20%sucrose toe aan het vial totdat het een inch vanaf de bovenkant van het vial bereikt.Gebruik een spatel om de bovenlaag van het voedsel voorzichtig door te roeren om de larven die er nog in graven te bevrijden. Alle larven zullen naar het oppervlak van de sucrose-oplossing drijven. Breng de larven vervolgens voorzichtig over naar de initiële sucrose-oplossing en roer ze voorzichtig door.Wees voorzichtig dat u de larven niet fijnknijpt of doorprikt tijdens het overbrengen naar de experimentele oplossing. Dit kan de resultaten van de assay beïnvloeden. Sluit de conische buis af en keer deze enkele malen om om de oplossing grondig te mengen.Verwijder vervolgens de dop van de conische buis en draai deze rond om een zachte vortex te creëren. Wacht twee tot vijf minuten tot de larven zijn bezonken, waarbij ze ofwel naar de bovenkant van de oplossing drijven of naar de bodem zinken. Noteer het aantal drijvende larven en de specifieke geteste sucroseconcentratie.Voeg vervolgens één milliliter 20% sucrose toe aan de experimentele oplossing om de dichtheid te verhogen. Gebruik daarna een spatel om de larven voorzichtig te roeren. Sluit vervolgens de conische buis af en keer deze meerdere keren om om de oplossing grondig te mengen.Verwijder vervolgens de dop van de conische buis en draai deze kort om een zachte vortex te creëren. Noteer het aantal drijvende larven en de nieuwe concentratie. Zet dit proces voort totdat ten minste 95% van de larven drijft.Voeg 20% sucrose toe aan de conische buis tot deze ongeveer 2,5 cm van de bovenkant is gevuld. Verzamel vervolgens alle larven in een dissectieschaal gevuld met PBS. Onderzoek de larven onder een microscoop op de aanwezigheid van kleine larven, prepupae, pupae of andere verschillen tussen genotypen om te controleren of de procedures correct zijn uitgevoerd.Noteer vervolgens het totaal aantal larven. Plaats daarna 10 larven op een laboratoriumdoekje om ze te drogen. Label een microcentrifugebuisje en plaats de larven in het buisje.Bevries de larven vervolgens snel in vloeibare stikstof en bewaar de buis bij min 20 graden celsius. Hier wordt een voorbeeld getoond van hoe de assay op basis van drijfvermogen zowel een hogere als een lagere vetopslag in de genetisch gemanipuleerde larven kan detecteren. Deze figuur laat zien dat excitatie of silencing van een specifieke subset neuronen in het larvale brein respectievelijk leidt tot een lagere en hogere vetopslag.In beide gevallen werd dezelfde genetische achtergrondcontrole gebruikt. Hier is een voorbeeld van hoe dit fenotype, verkregen via de dichtheidsanalyse, wordt bevestigd door extractie van neutrale lipiden en kwantificering via GCMS. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze binnen 30 minuten worden voltooid indien correct uitgevoerd, en kan deze gelijktijdig met andere genotypen worden uitgevoerd.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de ontwikkeling van de experimentele larven zoveel mogelijk te synchroniseren. Na deze procedure kunnen de larven snel worden ingevroren in vloeibare stikstof om te worden gebruikt in andere methoden, zoals gaschromatografie-massaspectrometrie, om aanvullende informatie te verkrijgen, zoals de specifieke klassen lipidtypes in de larven. Na de ontwikkeling van deze techniek is de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van het metabolisme om de genetische en/of neuronale bijdragen aan obesitas bij Drosophila te onderzoeken.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u genotypes snel kunt screenen op veranderingen in de hoeveelheid opgeslagen vetten.

a-buoyancy-based-method-of-determining-fat-levels-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates an assay to monitor gut acidification in Drosophila flies. After the ingestion of food supplemented with a pH indicator dye, the acidification of the intestinal lumen results in a change in the color of the dye. Visual inspection of the digestive tract of the flies to examine the color change provides evidence of acidification.

Gut Acidification Monitoring Assay: A Technique to Study the Acidification of the Intestinal Lumen in Drosophila using Bromophenol Blue Dye

We stellen robuuste biochemische en microscopische methoden voor het...

Biochemische en High Throughput microscopische beoordeling van Fat Mass in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

Hier beschrijven we een methode voor een snelle en nauwkeurige meting van vliegprestaties in Drosophila, waardoor high-throughput screening.

Een verbeterde methode voor nauwkeurige en snelle meting van Vliegprestaties in<em&gt; Drosophila</em

Metabole stoornissen behoren tot een van de meest voorkomende ziekten bij mensen. De genetisch handelbaar modelorganisme D. melanogaster kan worden gebruikt om nieuwe genen te identificeren die metabolisme regelen. Dit artikel beschrijft een relatief eenvoudige methode die het mogelijk maakt het bestuderen van de stofwisseling in vliegen door het meten van hun CO 2-productie.

Meting van Metabolic Rate in<em&gt; Drosophila</em&gt; Gebruik respirometrietest

Zebravissen ontwikkelen zich tot een waardevol model voor de verwerking van voedingslipiden en metabole ziekten. Beschreven worden protocollen van lipide-rijke larvale voeders, live beeldvorming van voedingsfluorescente lipide-analoga en kwantificering van voedselinname. Deze technieken kunnen worden toegepast op een verscheidenheid aan screenings-, beeldvormings- en hypothesegestuurde onderzoekstechnieken.

Vetrijke Feeding Paradigm voor larvale zebravis: Voeden, Live Imaging, en kwantificering van voedselinname

De CApillary FEeder (CAFE) test is een eenvoudige, budgetvriendelijke en zeer betrouwbare methode voor het onderzoeken van mechanismen die ten grondslag liggen aan voedselinname. Gebruikt met het zeer veelzijdige genetische modelorganisme Drosophila melanogaster, biedt het een krachtig middel om nieuwe inzichten te verkrijgen in de regulerende mechanismen van voedselinname.

De capillaire Feeder test meet voedselinname bij<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dit werk biedt een methode om de abdominale pigmentatie van Drosophila melanogaster snel en nauwkeurig te kwantificeren met behulp van digitale beeldanalyse . Deze methode stroomlijnt de procedures tussen fenotype-acquisitie en data-analyse en omvat voorbeeldmontage, beeldverzameling, pixelwaarde-extractie en eigenschappen van eigenschappen.

Kwantificering van buikpigmentatie in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dit is een hoog vet dieet voeding protocol om zwaarlijvigheid in Drosophila, een model voor begrip fundamentele moleculaire mechanismen betrokken bij lipotoxicity. Het biedt ook een hoge doorvoersnelheid triglyceride assay voor het meten van vet accumulatie in Drosophila en mogelijk andere (insect) modellen onder verschillende voeding, milieu, genetische of fysiologische omstandigheden.

Hoog vet dieet voeding en High Throughput triglyceride test bij Drosophila Melanogaster

Gepresenteerd hier zijn gedetailleerde methoden voor de dissectie en lipide druppel kleuring van oenocyten in Drosophila larven met behulp van bodipy 493/503, een lipide druppel-specifieke fluorescerende kleurstof.

Dissectie en lipide druppel kleuring van Oenocyten in Drosophila larven

Hier wordt een protocol beschreven dat de colorimetrische kwantificering mogelijk maakt van de hoeveelheid voedsel die binnen een bepaald tijdsinterval wordt gegeten door Drosophila melanogasterlarven die worden blootgesteld aan diëten van verschillende macronutriëntenkwaliteit. Deze assays worden uitgevoerd in de context van een neuronaal thermogenetisch scherm.

Kwantificering van de inname van macronutriënten in een thermogenetisch neuronaal scherm met drosophilalarven

Het huidige protocol beschrijft de inductie van autofagie in het Drosophila melanogaster larvaal vetlichaam via nutriëntendepletie en analyseert veranderingen in autofagie met behulp van transgene vliegenstammen.

Analyse van door uithongering geïnduceerde autofagie in het Drosophila melanogaster larvale vetlichaam

Leer een drijfvermogen-gebaseerde methode om vetgehalte te meten in Drosophila melanogaster larven. Deze snelle, economische techniek helpt onderzoekers bij het screenen van vetopslagveranderingen door genetica of dieet.

A-drijfvermogen gebaseerde methode voor het bepalen vetgehalte in

Meer video's verkennen