Een efficiënte methode voor de synthese van peptoïden met Gemengde lysine-type / Arginine-type monomeren en evaluatie van hun anti-leishmania Activity

Het algemene doel van deze procedure is om zowel lysine- als arginine-type monomeren te introduceren binnen dezelfde peptoïdesequentie en om de activiteit van deze verbindingen te evalueren tegen Leishmania mexicana, de veroorzakende parasieten van de verwaarloosde tropische ziekte cutane leishmaniasis. Nieuwe therapieën zijn dringend nodig voor cutane leishmaniasis en deze procedure kan helpen om peptoïden te identificeren en te ontwikkelen als een nieuwe klasse van potentiële anti-infectiva voor deze verwaarloosde tropische ziekte. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat peptoïden kunnen worden gesynthetiseerd die gemengde cationische functionaliteit bevatten.

Dit is zeer wenselijk omdat het kan helpen om de biologische activiteiten van de sequenties te moduleren. Hoewel dit wordt getest tegen de zoogdiervorm van de parasiet, kan het ook worden gebruikt tegen de insectenstadium van Leishmania mexicana of toegepast op zoogdiercellijnen. Visuele demonstratie van deze methode is erg nuttig omdat het de stapsgewijze aard van de synthese en ook de parasietencultuur op verschillende punten in de levenscyclus van Leishmania mexicana laat zien.

Om deze procedure te beginnen, bereid oplossingen in dimethylformamide voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg vervolgens 0,1 millimol Fmoc-beschermde rink amidehars toe aan een afgesloten 20-milliliter polypropyleen reactievat met twee fritten. Voeg vijf milliliter dimethylformamide toe en laat het vat 60 minuten staan bij kamertemperatuur.

Drain vervolgens het DMF met behulp van een vacuümplatform voor vastefase-extractie. Voeg vervolgens twee milliliter van de bereide piperidine-oplossing toe. Plaats het vat op een schudplatform op 450 RPM bij kamertemperatuur en schud gedurende vijf minuten.

Drain de oplossing met behulp van het vacuümstation. Voeg vervolgens twee milliliter piperidine-oplossing toe en schud gedurende 15 minuten onder dezelfde omstandigheden. Nadat het schudden voltooid is, drain de oplossing via een vacuümstation.

Voeg twee milliliter DMF toe en meng gedurende 30 seconden om de hars te wassen. Drain de DMF en herhaal het wassen drie keer. Om te beginnen met submonomer-synthese, voeg een milliliter van de bereide bromoazijnzuur-oplossing en 0,2 milliliter van de bereide DIC-oplossing toe.

Schud gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Drain vervolgens de oplossing en was drie keer met twee milliliter DMF per keer. Voeg een milliliter van de bereide amine-oplossing toe.

Schud vervolgens de hars gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Drain de oplossing en was de hars drie keer met twee milliliter DMF per keer. Voeg vervolgens een milliliter bromoazijnzuur-oplossing en 0,2 milliliter DIC-oplossing toe.

Schud gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Drain vervolgens de oplossing en was drie keer met twee milliliter DMF per keer. Om een guanidine-gefunctionaliseerd monomer toe te voegen, voeg je een milliliter van de onbeschermde diamine-oplossing toe aan de hars.

Schud gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Drain vervolgens de oplossing en was de hars drie keer met twee milliliter DMF. Voeg 0,5 milliliter van de bereide 2-acetyl dimedone-oplossing toe.

Schud gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Drain vervolgens de oplossing en was de hars drie keer met twee milliliter DMF. Ga door met de submonomer-synthese totdat de gewenste sequentie is gemaakt.

Voeg vervolgens vier milliliter van de bereide hydrazine-oplossing toe en schud gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Drain de oplossing en herhaal drie keer. Was vervolgens de hars drie keer met twee milliliter DMF voor elke wasbeurt.

Voeg DIPEA en zes equivalenten pyrazoool-1-carboxamidinde toe per vrije amine in de peptoïdesequentie. Schud gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Nadat het schudden voltooid is, drain de oplossing.

Was de hars drie keer met twee milliliter dichloromethaan voor elke wasbeurt. Laat de hars 10 minuten drogen en bewaar voor toekomstig gebruik. Een testsplitsing kan worden uitgevoerd na amine-toevoegingen om de voortgang van de synthese te controleren.

Om de laatste splitsing te beginnen, voeg je vier milliliter splitsingscocktail toe aan dezelfde fritreactor die voor de synthese werd gebruikt en dek het vat af. Schud gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik vervolgens de fritreactor om de splitsingscocktail van de hars in een rondbodemkolf te filteren.

Verdampen de splitsingscocktail met behulp van een roterende verdamper. Voeg twee milliliter anhydreus di-ethylether toe om de peptoïde te laten bezinken. Gebruik een pipette om de di-ethylether te verwijderen en weg te gooien.

Herhaal vervolgens de di-ethylether-bezinking drie keer. Zodra de bezinking voltooid is, lost u de ruwe peptoïde op in 10 milliliter van de bereide acetonitril- en aangezuurde wateroplossing. Breng over naar een vooraf gewogen container.

Bevriest vervolgens bij min 20 graden Celsius en lyofiliseert tot een droog poeder klaar voor zuivering door middel van reverse-phase HPLC. Na het kweken van de Leishmania mexicana-parasieten en transformatie naar de axenische amastigotestadium, begint u de cytotoxiciteitstest door de compound-voorraadoplossing voor te bereiden zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg twee microliter van vijf millimolair peptoïdevoorraadoplossing, amfotericine B-controle en DMSO-controle toe aan de bovenste rij van een 96-wellplaat zoals beschreven in het tekstprotocol.

Gebruik een multikanaals pipette om 48 microliter vers medium toe te voegen aan de bovenste rij. Voeg 25 microliter vers medium toe aan alle andere rijen. Voer vervolgens een seriële verdunning uit door 25 microliter oplossing uit de bovenste rij te pipetten, deze toe te voegen aan de onderliggende rij en te mengen.

Herhaal de verdunning voor de hele plaat en gooit de laatste 25 microliter weg die uit de onderste rij is gepipetteerd. Breng vervolgens een parasie