Name: Een efficiënte methode voor de synthese van peptoïden met Gemengde lysine-type / Arginine-type monomeren en evaluatie van hun anti-leishmania Activity (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Leer een efficiënte methode voor de synthese van peptoïden met gemengde lysine- en arginine-type monomeren en hun evaluatie tegen Leishmania mexicana. Dit protocol ondersteunt de ontwikkeling van nieuwe anti-infectiva.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de Raad voor Onderzoek Techniek en Exacte Wetenschappen (EPSRC) voor financiële steun (HLB). We danken ook Sridevi Maalika Ramanoudjame voor haar hulp tijdens het filmen van deze procedure.

1. Vaste-fase synthese van peptoïden LET OP: peptoïden worden gesynthetiseerd handmatig met de submonomer werkwijze van vaste fase peptoïde synthese. Deze methode maakt het mogelijk hoge koppeling efficiëntie en goed eindproduct opbrengsten. Synthese op vaste fase laat ook overmaat reactanten gemakkelijk te verwijderen aan het einde van elke stap en de methode is hier aangepast om verschillende gefunctionaliseerde kationische monomeren (bijvoorbeeld, arginine-type en lysine-type residuen) laten vallen binnen dezelfde volgorde. 1,2 <ol><li> Synthese van een lineair peptoïde Let op: Voer veiligheidsbeoordeling vóór het begin van de synthese. Voer alle reacties in een zuurkast en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen zo nodig (dat wil zeggen, disposable nitril handschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas). Wees vooral voorzichtig bij het gebruik van de volgende reagentia en oplosmiddelen. Dimethylformamide (DMF) is een vermoed teratogeen en dichloromethane (DCM) is een kankerverwekkende stof. N, N &#39;-diisopropylcarbodiimide (DIC) en piperidine gevaarlijk zijn voor de ogen, de huid, via de luchtwegen inademing en kan de huid gevoelig maken. Hydrazine is een verdacht carcinogeen, dodelijk bij inademing en veroorzaakt ernstige brandwonden op de huid of ogen. Broomazijnzuur is ook gevaarlijk voor de huid, de ogen en de luchtwegen en kan brandwonden veroorzaken bij contact. Trifluorazijnzuur (TFA) is een vluchtige vloeistof en kan ernstige brandwonden veroorzaken dus wees voorzichtig. Heavy duty handschoenen worden aanbevolen. <ol><li> Voeg 0,12 g-Fmoc beschermd Rink Amide-hars (0,1 mmol, typische belading 0,7 mmol / g) een afgedekte 20 ml polypropyleen reactievat met twee frits. Voeg 5 ml dimethylformamide (DMF) om de hars te zwellen en laat het vat gedurende ten minste 60 minuten bij kamertemperatuur staan. Giet de DMF behulp van een vaste-fase extractie vacuüm platform. </li><li> Om de Fmoc-groep op de gezwollen hars ontschermen, 2 ml piperidine-oplossing (20% in DMF v / v). Plaats het vat opeen schudplatform bij kamertemperatuur (450 tpm) en schud gedurende 5 min. Verwijder de oplossing via vacuümcentrale. <ol><li> Herhaal Fmoc ontscherming met 2 ml piperidine-oplossing en schud gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Giet de oplossing als voorheen. </li></ol></li><li> Was de hars door toevoeging van 2 ml DMF en het mengen van de hars gedurende 30 sec. Giet de DMF en herhaal dit drie keer. </li><li> Voor de acetylering, voeg 1 ml broomazijnzuur oplossing (0,6 M in DMF) en 0,2 ml N, N -diisopropylcarbodiimide oplossing &#39;(DIC, 50% in DMF v / v). Laat reactievat te schudden gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Giet de oplossing en was de hars met 2 ml DMF drie keer. </li><li> Voor de verplaatsing, voeg 1 ml amineoplossing (1,5 M in DMF). Schud de hars gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Giet de oplossing en was de hars met 2 ml DMF drie keer. <ol><li> Om een ​​arginine-type monomeer toe te voegen, volgt u stap 1.7. Afhankelijk van de gewenste sequentie peptoïde, verschillende aminenzal toegevoegd worden. </li></ol></li><li> Herhaal stap 1.1.4 en 1.1.5. </li><li> Een guanidine gefunctionaliseerd monomeer (dat wil zeggen N Arg) omvatten, voeg 1 ml onbeschermde diamine-oplossing (1,5 M in DMF) aan de hars en schud gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. <ol><li> Giet de oplossing en was de hars met 2 ml DMF drie keer. </li><li> Voeg 2-acetyldimedone (0,2 g, 1 mmol in 0,5 ml DMF, 10 equivalenten) aan de Dde-groep aan de vrije primaire amine toe en schud gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Giet de oplossing en was de hars met 2 ml DMF drie keer. </li></ol></li><li> Doorgaan submonomer synthese zoals in 1.1.4 tot 1.1.7, totdat de gewenste sequentie wordt gemaakt. Voeg 2 ml DMF aan het hars wassen en herhaal dit drie keer. </li><li> Om de Dde groep hars bescherming te ontdoen, voeg 4 ml 2% hydrazine-oplossing (in DMF v / v) en schud gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Giet de oplossing en herhaal drie keer. </li><li> Giet de oplossing en was de hars met 2 ml DMF drie tIMES. </li><li> Add pyrazool-1-carboxamidine (6 equivalenten per vrije amine, dat wil zeggen per N Arg monomeren, in een minimale hoeveelheid DMF) en N, N-diisopropylethylamine of DIPEA (6 equivalenten per vrij amine) en schud bij kamertemperatuur gedurende 60 min . </li><li> Giet de oplossing en was de hars met 2 ml dichloormethaan drie keer. Laat het hars te drogen in de lucht gedurende 10 minuten wordt de hars kan worden opgeslagen tot splitsing (deel 2). </li><li> De synthese onderbreken, was de hars met 2 ml DMF driemaal. Voeg 2 ml DMF, sluit de synthese vat en laat bij kamertemperatuur in een zuurkast. NB: De synthese kan worden onderbroken na een eventuele verplaatsing stap (met uitzondering van de tweede verplaatsing stap als diketopiperazines kunnen worden gevormd). </li></ol></li><li> Zijketen ontscherming en afsplitsing van hars <ol><li> Onderneem een ​​test aanhangen om de voortgang van de synthese (zuiverheid en massa) op elk moment tijdens de synthese na de displacement stappen, toevoeging of verwijdering van Dde-beschermende groep of na de laatste sequentie is gemaakt. <ol><li> Breng ongeveer 10 harskorrels uit het reactievat in een nieuwe 8 ml polypropyleen gefrit cartridge. </li><li> Voeg 1 ml trifluorazijnzuur splitsing cocktail (met 95% TFA, 2,5% H2O, 2,5% triisopropylsilaan) en schud gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Filter de TFA splitsing cocktail van de hars met behulp van de gefrit reactievat in een 10 ml rondbodemkolf. </li><li> Damp de splitsing cocktail met een rotatieverdamper en de resulterende olie opnieuw op te lossen in 1 ml acetonitril / water voorgelegd aan LC-MS of analytische HPLC. </li></ol></li><li> Voor de uiteindelijke splitsing: dezelfde gefritte polypropyleen reactiemengsel cartridge gebruikt voor synthese, voeg 4 ml TFA klieving cocktail (95% TFA, 2,5% H2O, 2,5% triisopropylsilaan) en bedekken het vaartuig. Schud gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> filter the TFA splitsing cocktail van de hars met behulp van de gefrit reactievat in een 50 ml rondbodemkolf. </li><li> Damp de splitsing cocktail met een rotatieverdamper. Nadat het TFA verwijderd is, moet het product worden verkregen als een olie. Om TFA verwijdering te helpen uit deze ruwe olie, voeg 2 ml watervrije diethylether en de peptoïde moeten neerslaan. <ol><li> Verwijder de diethylether via pipet en ontdoen of verdampen met een rotatieverdamper. Herhaal diethylether neerslag driemaal. </li></ol></li><li> Los de ruwe peptoïde in 10 ml acetonitril / water aangezuurde oplossing (50% acetonitril, 0,1% TFA in water v / v). Verwijzing naar een vooraf gewogen container, invriezen bij 20 ° C en lyofiliseren tot een droog poeder. </li></ol></li></ol> 2. Karakterisering en Zuivering OPMERKING: De peptoïde synthese kan worden gevolgd en de laatste peptoïde bepaald via analytische reverse-fase HPLC met een C18-kolom en electrospray vloeibare chromatografie-massaspectrometrie (LC-MS). Alle HPLC oplosmiddelen oplosmiddelen voor LC-MS moet vers worden bereid. <ol><li> analytische HPLC <ol><li> Weeg 1 mg peptoïde in een klein glazen flesje. Voeg de minimale hoeveelheid acetonitril op te lossen en te verdunnen tot 1 ml met water. Zorg ervoor dat de peptoïde volledig is opgelost. </li><li> Injecteer 10 pi analytische HPLC (voorgesteld gradiënt 0-100% solvent B gedurende 30 minuten, waarbij oplosmiddel A = 95% water, 5% acetonitril, 0,05% TFA en oplosmiddel B = 95% acetonitril, 5% water, 0,03% TFA) , volgens instructies van de fabrikant. </li><li> Visualiseer UV-spectrum bij 220 nm. </li></ol></li><li> ESI LC-MS <ol><li> Voeg 1 mg / ml peptoïde oplossing volgens stap 2.1.1. </li><li> Injecteer 1 ul tot elektrospray LC-MS om te bepalen of het molecuulgewicht van het doelwit peptoïde aanwezig is, volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Controleer het doelwit massa van de peptoïde sequentie met behulp van een Peptoid calculator, volgens de instructies op de rekenmachine. 26 Deze web tool maakt het ook mogelijk de toewijzing van eventuele schrapping / toevoeging producten te zien in de massa spectrum. 26 </li></ol></li><li> Preparatieve reverse fase HPLC <ol><li> Lossen ruwe peptoïden in 2 ml aangezuurd water / acetonitril (95% water, 5% MeCN, 0,1% TFA) en zuiver door middel van preparatieve RP-HPLC met protocol van de fabrikant. Bepaal het verloop van de elutietijd verkregen van analytische HPLC en de geïnjecteerde zal afhangen van de kolomdimensies bedrag. </li><li> Visualiseren met behulp van een detector ingesteld op 220 nm. </li><li> Verzamel fracties in 15 ml centrifugebuizen invriezen bij 20 ° C en Lyophilize. </li><li> Re-fracties te analyseren met behulp van LC-MS en analytische HPLC volgens het protocol van de fabrikant. Recombineren gezuiverde fracties. </li></ol></li></ol> 3. Biologische Testen tegen Leishmania mexicana Parasieten Cautie:. Veiligheid evaluaties moeten vóór het begin van de synthese worden uitgevoerd Leishmania mexicana is geclassificeerd als gevaarlijk groep 2 ziekteverwekker in de adequate controle maatregelen Verenigd Koninkrijk en moeten worden getroffen voor het begin van het testen. Alle werkzaamheden moeten in een klasse 2 veiligheid microbiologische kabinet en adequate persoonlijke beschermingsmiddelen gedragen als passend (dwz, nitril handschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas) worden uitgevoerd. <ol><li> Subcultuur van parasieten <ol><li> Ontdooi 1 ml -150 ° C ingevroren voorraad Leishmania mexicana M379 door het plaatsen van flacon in een 37 ° C waterbad gedurende 30 sec. </li><li> Breng de stockoplossing aan 10 ml Schneider Insect medium (pH 7,0 aangevuld met 15% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine) in een 25 cm 3 celkweekkolf met een niet-ontluchtingsdop. </li><li> Incubeer bij 26 ° C gedurende 72 uur. </li><li> Onderzoek parasieten onder de microscoop (400X vergroting) om de conditie te controleren. they moet insect stadium promastigoten, procyclische vormen in de log-fase met veel delende cellen. </li><li> Handhaaf procyclische promastigoten door sub-kweken parasieten tot een concentratie van 5 x 10 5 parasieten / ml om de drie dagen. Aantal cellen met een verbeterde Neubauer hemocytometer. </li></ol></li><li> Transformatie van L. mexicana insect podium in zoogdiercellen stadium axenic amastigoot formulier 27 <ol><li> Dag 0: Bereid 10 ml kweek van log parasieten bij 5 x 10 5 parasieten / ml in Schneider&#39;s insectenmedium (bij pH 7,0 aangevuld met 15% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine) in een 25 cm 3 cell kolf met een niet-ontluchtingsdop. </li><li> Incubeer bij 26 ° C gedurende 48 uur. </li><li> Dag 3: Breng 10 ml kweek aan een 50 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 447 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Giet oude medium en voeg 10 ml Schneider Insect medium (bij pH 5,5 aangevuld met 20% heet-geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine). Voorzichtig resuspendeer de pellet van parasieten in het nieuwe medium met een pipet. </li><li> Tel het aantal parasieten met een verbeterde Neubauer hemocytometer. Verdunnen tot een concentratie van 5 x 10 5 parasieten / ml bij pH 5,5 medium overgebracht in een 25 cm 3 celkweekkolf. </li><li> Incubeer bij 26 ° C gedurende ongeveer 6 dagen. </li><li> Dag 9: Onderzoek parasieten onder een microscoop (400X). Zij moeten in de niet-replicerende, infectieuze metacyclische promastigoot fase. </li><li> Tel het aantal parasieten met een verbeterde Neubauer hemocytometer. Verdunnen tot een concentratie van 5 x 10 5 parasieten / ml bij pH 5,5 medium. </li><li> Verwijder 10 ml van celkweek en over te dragen aan celkweek kolf. Incubeer bij 32 ° C gedurende 5 dagen. </li><li> Dag 14: Controleer het uiterlijk van parasieten onder de microscoop (400X). Ze moeten in de pathogene amastigoot podium, zonder de flagellum karakteristic van promastigoten, en klaar voor de test. </li></ol></li><li> Cytotoxiciteit assay op L. mexicana axenic amastigoten. LET OP: De biologische testen van peptoids maakt gebruik van high-throughput testen in platen met 96 putjes uitgevoerd. Dit protocol beschrijft het testen van L. mexicana axenic amastigoten, maar identieke assays kunnen ook buiten op het podium promastigoot parasieten in geschikte media worden uitgevoerd. Verbindingen worden geïncubeerd met parasieten bij concentraties 3-100 pM voor 60 min en vervolgens gedurende 24 uur na een 10-voudige verdunning. Resultaten worden verkregen door het meten van de fluorescentie van putjes na incubatie met Resazurin gebaseerde oplossing levensvatbaarheid van de cellen (bijvoorbeeld AlamarBlue). <ol><li> Bereid verbinding voorraad oplossingen. Weeg 1 mg van het uiteindelijke gezuiverde peptoïde product met behulp van een analytische balans. Voeg de juiste hoeveelheid moleculaire biologie graad dimethylsulfoxide (DMSO) tot een concentratie van 5 mM. Maak 6 pi porties eninvriezen bij -20 ° C. </li><li> Bereid samengestelde oplossingen 96 putjes (een aanbevolen plaatindeling te zien in de resultaten sectie, figuur 6) in drievoud 100-3 uM. Voeg 2 ul van 5 mM voorraadoplossing van elke verbinding in de bovenste rij (dat wil zeggen, A). Voeg 48 ul vers Schneider&#39;s insectenmedium (bij pH 5,5 en 20% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline / streptomycine (P / S)) naar bovenste rij een multi-kanaal pipet. Voeg 25 ul van Schneider Insect middellange tot alle andere rijen (B - F). <ol><li> Voer een seriële verdunning door pipetteren 25 pi oplossing uit de bovenste rij. Toe te voegen aan de rij onder en meng. Verricht verdunningen tot de laatste rij, waar de laatste 25 ul oplossing moet worden weggegooid. </li><li> Gebruik amfotericine B (5 mM voorraad) als een positieve controle en DMSO (2% oplossing) als een negatieve controle in drievoud. </li></ol></li><li> Bereid parasiet oplossing: overdracht van cultuur in een 50 ml centrifugebuis en centrifugeer bij447 g gedurende 5 min. Afgieten oude medium en voeg 10 ml Schneider&#39;s insectenmedium (bij pH 5,5 en 20% FBS, 1% P / S). </li><li> Voorzichtig los de pellet van parasieten in het nieuwe medium met een pipet en tel met een verbeterde Neubauer hemocytometer. Verdun cultuur tot 8 x 10 6 parasieten / ml. </li><li> Voeg 25 ul L. mexicana cultuur aan elk putje. Incubeer de platen gedurende 60 minuten bij 32 ° C. </li><li> Verwijder plaat uit de incubator en verwijder 40 ul-oplossing van elk putje. </li><li> Voeg 90 ul vers medium en incubeer gedurende 24 uur bij 32 ° C. </li><li> Voeg 10 ul Resazurin gebaseerde cellevensvatbaarheid oplossing in elk putje. Incubeer gedurende 4 uur bij 32 ° C. </li><li> Meet de fluorescentie met behulp van een plaatlezer (ex λ = 540 nm, em λ = 600 nm), volgens instructies van de fabrikant. Gegevens analyseren door verwijdering gemiddelde achtergrond (van alleen medium putjes) en het vergelijken van de fluorescentie van putjes in normaal naar tHij DMSO controles. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+method+for+the+preparation+of+peptoids+oligo%28N-substituted+glycines%29+by+submonomer+solid-phase+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Efficient method for the preparation of peptoids oligo(N-substituted glycines) by submonomer solid-phase synthesis.</a> J. Am. Chem. Soc. 114, 10646-10647 (1992).</li>
<li>Bolt, H. L., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+method+for+the+synthesis+of+peptoids+containing+both+lysine-type+and+arginine-type+monomers%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A practical method for the synthesis of peptoids containing both lysine-type and arginine-type monomers.</a> Org. Biomol. Chem. 14, 1211-1215 (2016).</li>
<li>Mojsoska, B., Zuckermann, R. N., Jenssen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+study+of+novel+peptoids+that+mimic+the+structure+of+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship study of novel peptoids that mimic the structure of antimicrobial peptides.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2015).</li>
<li>Chongsiriwatana, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptoids+that+mimic+the+structure%2C+function%2C+and+mechanism+of+helical+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 2794-2799 (2008).</li>
<li>Eggimann, G. A., Bolt, H. L., Denny, P. W., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+Anti-leishmanial+Effects+of+Linear+Peptoids%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigating the Anti-leishmanial Effects of Linear Peptoids.</a> Chem Med Chem. 10, 233-237 (2015).</li>
<li>Kapoor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+Peptoids+Are+Effective+against+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial Peptoids Are Effective against Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 55, 3054-3057 (2011).</li>
<li>Ryge, T. S., Frimodt-Moller, N., Hansen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+activities+of+twenty+lysine-peptoid+hybrids+against+clinically+relevant+bacteria+and+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial activities of twenty lysine-peptoid hybrids against clinically relevant bacteria and fungi.</a> Chemotherapy. 54, 152-156 (2008).</li>
<li>Huang, M. L., Benson, M. A., Shin, S. B. Y., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+Cyclic+Peptoids+That+Exhibit+Antimicrobial+Activity+by+Disrupting+Staphylococcus+aureus+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic Cyclic Peptoids That Exhibit Antimicrobial Activity by Disrupting Staphylococcus aureus Membranes.</a> Eur. J. Org. Chem. , 3560-3566 (2013).</li>
<li>Huang, M. L., Shin, S. B. Y., Benson, M. A., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+Linear+and+Cyclic+Peptoid+Oligomers+as+Potent+Antimicrobial+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">A Comparison of Linear and Cyclic Peptoid Oligomers as Potent Antimicrobial Agents.</a> Chem Med Chem. 7, 114-122 (2012).</li>
<li>Bolt, H. L., Eggimann, G. A., Denny, P. W., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarging+the+Chemical+Space+of+Anti-leishmanials%3A+a+Structure-Activity+Relationship+Study+of+Peptoids+against+Leishmania+mexicana%2C+a+Causative+Agent+of+Cutaneous+Leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Chem+Comm%22%5BJournal%5D)">Enlarging the Chemical Space of Anti-leishmanials: a Structure-Activity Relationship Study of Peptoids against Leishmania mexicana, a Causative Agent of Cutaneous Leishmaniasis.</a> Med Chem Comm. , (2016).</li>
<li>The World Health Organisation. Leishmaniasis. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/leishmaniasis/en/">http://www.who.int/leishmaniasis/en/</a> (2016).</li>
<li>Chon, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+overuse+and+resistance+in+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+therapy%22%5BJournal%5D)">Antibiotic overuse and resistance in dermatology.</a> Dermatologic therapy. 25, 55-69 (2012).</li>
<li>Alvar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmaniasis+Worldwide+and+Global+Estimates+of+Its+Incidence%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Leishmaniasis Worldwide and Global Estimates of Its Incidence.</a> PLOS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+of+trypanosomiases+and+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis.</a> Trends Parasitol. 21, 508-512 (2005).</li>
<li>Kedzierski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmaniasis+Vaccine%3A+Where+are+We+Today%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Global+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Leishmaniasis Vaccine: Where are We Today?</a> J Global Infect Dis. 2, 177-185 (2010).</li>
<li>Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+in+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Drug resistance in leishmaniasis.</a> Clin Microbiol Rev. 19, 111-126 (2006).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+from+Host-Defense+Peptides%3A+Cationic%2C+Amphipathic+Peptoids+with+Potent+Anticancer+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Learning from Host-Defense Peptides: Cationic, Amphipathic Peptoids with Potent Anticancer Activity.</a> PLOS ONE. 9, (2014).</li>
<li>Wender, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Design%2C+Synthesis%2C+and+Evaluation+of+Molecules+That+Enable+or+Enhance+Cellular+Uptake%3A+Peptoid+Molecular+Transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Design, Synthesis, and Evaluation of Molecules That Enable or Enhance Cellular Uptake: Peptoid Molecular Transporters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 13003-13008 (2000).</li>
<li>Schröder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptoidic+Amino-+and+Guanidinium-Carrier+Systems%3A+Targeted+Drug+Delivery+into+the+Cell+Cytosol+or+the+Nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptoidic Amino- and Guanidinium-Carrier Systems: Targeted Drug Delivery into the Cell Cytosol or the Nucleus.</a> J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008).</li>
<li>Kömel, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptoids%3A+Introduction+of+novel+cationic+side+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptoids: Introduction of novel cationic side chains.</a> Eur. J. Med. Chem. 79, 231-243 (2014).</li>
<li>Hein-Kristensen, L., Knapp, K. M., Franzyk, H., Gram, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+membrane+activity+of+%CE%B1-peptide%2F%CE%B2-peptoid+chimeras%3A+Influence+of+amino+acid+composition+and+chain+length+on+the+activity+against+different+bacterial+strains%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial membrane activity of α-peptide/β-peptoid chimeras: Influence of amino acid composition and chain length on the activity against different bacterial strains.</a> BMC Microbiology. 11, 1-12 (2011).</li>
<li>Su, Y., Doherty, T., Waring, A. J., Ruchala, P., Hong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Arginine+and+Lysine+Residues+in+the+Translocation+of+a+Cell-Penetrating+Peptide+from+%2813%29C%2C+%2831%29P+and+%2819%29F+Solid-State+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Roles of Arginine and Lysine Residues in the Translocation of a Cell-Penetrating Peptide from (13)C, (31)P and (19)F Solid-State NMR.</a> Biochem. 48, 4587-4595 (2009).</li>
<li>Andreev, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanidino+groups+greatly+enhance+the+action+of+antimicrobial+peptidomimetics+against+bacterial+cytoplasmic+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Guanidino groups greatly enhance the action of antimicrobial peptidomimetics against bacterial cytoplasmic membranes.</a> BBA Biomembranes. 1838, 2492-2502 (2014).</li>
<li>Foged, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+and+membrane-destabilising+properties+of+alpha-peptide%2Fbeta-peptoid+chimeras%3A+lessons+for+the+design+of+new+cell-penetrating+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake and membrane-destabilising properties of alpha-peptide/beta-peptoid chimeras: lessons for the design of new cell-penetrating peptides.</a> BBA Biomembranes. 1778, 2487-2495 (2008).</li>
<li>Vedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiplasmodial+and+prehemolytic+activities+of+alpha-peptide-beta-peptoid+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Antiplasmodial and prehemolytic activities of alpha-peptide-beta-peptoid chimeras.</a> Chem Bio Chem. 8, 1781-1784 (2007).</li>
<li>Lear, S., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pep-Calc.com%3A+a+set+of+web+utilities+for+the+calculation+of+peptide+and+peptoid+properties+and+automatic+mass+spectral+peak+assignment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Computer-Aided+Mol+Des%22%5BJournal%5D)">Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment.</a> J Computer-Aided Mol Des. , 1-7 (2016).</li>
<li>Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+developmental+cycle+of+Leishmania+mexicana+in+axenic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol%22%5BJournal%5D)">Complete developmental cycle of Leishmania mexicana in axenic culture.</a> Parasitol. 108, 1-9 (1994).</li>
<li>Gossage, S. M., Rogers, M. E., Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+separate+growth+phases+during+the+development+of+Leishmania+in+sand+flies%3A+implications+for+understanding+the+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Two separate growth phases during the development of Leishmania in sand flies: implications for understanding the life cycle.</a> Int J Parasitology. 33, 1027-1034 (2003).</li>
<li>Seo, J., Lee, B. C., Zuckermann, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSeo%2C+J+%22Comp+Biomaterials%22">Comp Biomaterials</a>. Ducheyne, P., et al. 2, Elsevier. 53-76 (2011).</li>
<li>Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dde+-+A+selective+primary+amine+protecting+group%3A+A+facile+solid+phase+synthetic+approach+to+polyamine+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Lett%22%5BJournal%5D)">Dde - A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates.</a> Tetrahedron Lett. 37, 2625-2628 (1996).</li>
<li>Culf, A. S., Ouellette, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+synthesis+of+N-substituted+glycine+oligomers+%28alpha-peptoids%29+and+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (alpha-peptoids) and derivatives.</a> Molecules. 15, 5282-5335 (2010).</li>
<li>Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+Submonomer+Synthesis+of+Peptoid+Polymers+and+their+Self-Assembly+into+Highly-Ordered+Nanosheets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets.</a> J Vis Exp. , e3373(2011).</li>
<li>Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+unprotected+heterocyclic+side+chains+into+peptoid+oligomers+via+solid-phase+submonomer+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).</li>
<li>Nakayama, G. R., Caton, M. C., Nova, M. P., Parandoosh, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+Alamar+Blue+assay+for+cellular+growth+and+viability+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessment of the Alamar Blue assay for cellular growth and viability in vitro.</a> J Immunol Methods. 204, 205-208 (1997).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

<html> Peptoïden steeds bestudeerd in de chemische biologie en medicinale chemie velden in toepassingen zoals nieuwe therapieën 3-5, mobiele bemiddelaars 18,20 en diagnostische gereedschappen. 29 Gewoonlijk zijn sequenties kationisch een zekere selectiviteit op voor de pathogeen zoogdiercellen, het vermogen om te penetreren door celmembranen en ook steun oplosbaarheid in waterige systemen. Er zijn talloze voorbeelden van kationische peptoids die uitsluitend lysine of arginine-nabootser residuen in de literatuur bevatten. Tot op heden, de synthese van peptoïden die beide kationische resten in dezelfde volgorde bevatten, is belemmerd door gebrek aan een geschikte syntheseprocedure. De hier beschreven protocol kan gemengd kationogene peptoïden worden gesynthetiseerd op een efficiënte wijze en is zeer gewenst omdat daarmee een route naar de biologische en chemische eigenschappen van amfipathische peptoids moduleren. nt &quot;&gt; Onze methode wordt een aanpassing aan de gebruikte submonomer peptoïde synthese en maakt de toevoeging van zowel lysine en arginine-type monomeren in dezelfde volgorde. Het gebruikt kamertemperatuur koppelingen en gevestigde beschermende groep chemie zodat verwacht wordt dat deze werkwijze nuttig voor de meeste onderzoeksgroepen. Om orthogonale bescherming van het arginine-type residu toe te voegen, wordt een onbeschermde diamine toegevoegd onder standaard verplaatsing omstandigheden en beschermd in een 60 minuten koppeling met Dde-OH. verschillende diamines kunnen gebruikt die zijketens mogelijk maakt van 2 koolstofatomen tot 6 koolstofatomen lang te worden geïnstalleerd, dat wil zeggen 1,2-diamino tot 1,6 diaminohexaan respectievelijk. De beschermende Dde-OH goed oplost in DMF en is een zeer efficiënte en selectieve beschermende groep voor primaire aminen. de Dde-beschermingsgroep bladeren secundaire aminen beïnvloed, bijvoorbeeld de onbeschermde N-terminus van peptoïde keten. 30 Een beperking is dat alle van de syn-thesis werd met de hand gedaan; Echter wordt verwacht dat de ontwikkelde koppelingsomstandigheden maken de werkwijze vatbaar voor gebruik met geautomatiseerde peptide / peptoïde synthesizers. De aan hars ontscherming van de Dde-groepen wordt uitgevoerd met behulp van 2% hydrazine in DMF oplossing om vrije amines die kunnen worden guanidinylated op hars met behulp pyrazool-1-carboxamidine verlaten. Zes equivalenten van het pyrazol-1-carboxamidine en zes equivalenten DIPEA gebruikt per vrije amine op het hars (bijv zes equivalenten per N Arg monomeertype worden geïnstalleerd). Nogmaals, deze reactie is ook efficiënt en het pyrazol-1-carboxamidine reagens goede oplosbaarheid in DMF. Voltooiing van de reactie wordt typisch gezien via LC-MS na 60 minuten bij kamertemperatuur. Door de veelzijdigheid van de werkwijze submonomer, diverse primaire aminen kunnen worden toegepast bij de verdringingsstap dus voorwaarden moet worden geoptimaliseerd om koppeling effi vergrotenefficiëntie en de algehele product opbrengst of zuiverheid. 31 Voor de sequenties hierboven besproken, geen speciale voorwaarden waren nodig voor een succesvolle koppelingen. Er kon echter langere verplaatsing maal of hoger amine concentraties worden gebruikt voor problematische verplaatsingen (dat wil zeggen, voor slecht nucleofiele of sterisch volumineuze aminen). Sommige aminen kunnen niet volledig oplosbaar in DMF, in welk geval wordt aanbevolen om deze in N-methyl-2-pyrrolidon (NMP), of andere geschikte oplosmiddelen voor vaste-fase-reacties lossen plaats als in een eerder uitgebreide werkwijze voor synthese submonomer van peptoids. 32 monomeren die onbeschermd heteroatomen in de zijketens bevatten, acetylering met behulp chloorazijnzuur is effectief gebleken door andere groepen. 33 Daarnaast kunnen andere harsen worden gebruikt met deze methode peptoïden met verschillende C-terminale functionalisering verkregen. Wang harsen en 2-chloortritylchloride harsen worden gewoonlijk tersubmonomer synthese van peptoids. Zo is deze werkwijze met succes gebruikt met 2-chloortritylchloridehars in onze groep. 2 verschillende vaste dragers een ander laadprocedure eisen Rink Amide besproken (afhankelijk van de specifieke gebruikte hars), zodat dit moet worden gecontroleerd met de literatuur voorafgaand aan synthese. Soortgelijke peptidesynthese, kunnen de voorwaarden voor uiteindelijke splitsing van de peptoïde uit hars worden geoptimaliseerd voor de specifieke sequentie. In dit protocol werd een TFA splitsing cocktail gebruikt (met triisopropylsilaan en water als aaseters). De peptoïden hier gepresenteerde bevatte slechts Boc bescherming die is een redelijk zuur labiele groep. Om volledige ontscherming van sequenties garanderen met een groter deel van beschermde residuen of minder zuur-labiele beschermende groepen, langere tijden splitsing noodzakelijk zijn (dwz splitsing tijden dan 2 uur worden aanbevolen voor sequenties die Pbf of tertiaire-bu bevattenTyl ester beschermde groepen). Alternatief scavengers kunnen ook worden gebruikt voor specifieke zijketens (bijvoorbeeld ethaandithiol of 2-mercaptoethanol worden vaak gebruikt in peptiden die zwavel bevattende zijketens zoals cysteine ​​en methionine hebben). De biologische bepaling is voorgesteld een standaard cytotoxiciteit test die kan worden aangepast aan verschillende cellijnen te passen. Het is belangrijk op te merken dat elke 96-well plaat voldoende controles moeten bevatten om het vertrouwen in de bereikte resultaten mogelijk te maken. In dit geval wordt amfotericine B toegepast als een positieve controle omdat het een bekend geneesmiddel tegen de ziekte en DMSO wordt gebruikt als een negatieve controle aangezien dit het oplosmiddel waardoor verbinding voorraden maken voor de test. Als er andere cellijnen worden gebruikt, moeten alternatieve, passende controles worden verkregen en gevalideerd voor gebruik. L. mexicana wordt geïncubeerd met het peptoïde bij concentraties van 100 en 2 uM gedurende één uur, waarna de parasiet / peptoïde verdunning dooreen factor tien voor incubatie gedurende de nacht (bijv putjes aanvankelijk met 100 pM peptoïde voorraad worden verdund tot 10 uM). De cellevensvatbaarheid reagens wordt aan elk putje toegevoegd (10% van de totale wellvolume) aan het einde van de test. Een zichtbare kleurverandering wordt gezien tussen de putten met levensvatbare parasieten (roze), controleputjes zonder levensvatbare parasieten (blauw) en een spectrum tussen met tussentijdse aantallen levensvatbare parasieten. De fluorescentie is evenredig met het aantal levende cellen en komt overeen met de metabole activiteit van de cellen; Resazurin kleurstof (niet fluorescerende) omgezet in de fluorescerende resorufine door reductie reacties in metabolisch actieve cellen. 34 Bij deze assay is de incubatietijd met de cellevensvatbaarheid reagens geoptimaliseerd voor L. mexicana. Incubatietijden met de levensvatbaarheid reagens varieert van platen gezaaid bij verschillende celconcentraties of met verschillende cellijnen (bijvoorbeeld kan deze methode ook worden gebruiktmet zoogdiercellen). Afhankelijk van de exacte plaatlezer gebruikt, moeten overwegingen worden gemaakt voordat fluorescentie metingen verricht. Eventuele luchtbellen in putjes verwijderd om nauwkeurige metingen kunnen worden genomen. Sommige plaatlezers lezen van de bodem van platen, waarbij platte bodem 96-putjesplaten worden gebruikt. Andere machines kan lezen uit de bovenkant van de plaat, zodat het deksel van de plaat moet worden verwijderd voordat de meting. Tenslotte, in de toekomst dit protocol verenigbaar met geautomatiseerde synthesizers die in staat is om vele sequenties parallel bent. Bovendien is de synthese van cyclische peptoids is ook mogelijk met deze methode. Dit protocol dient onderzoekers met praktische synthetische procedure die kan worden gebruikt om nieuwe peptoïde scaffolds met zowel lysine en arginine-type monomeren, die van nut kan zijn in vele toepassingen, waaronder materialen of medicinale velden verschaffen.

Peptoïden (of poly-N-gesubstitueerde glycines) zijn een klasse van peptide-nabootsingen die soortgelijke eigenschappen als peptiden bieden en als zodanig steeds onderzocht voor medicinale toepassingen en materialen. In peptiden, wordt de zijketen van elk aminozuur verbonden met de α-koolstof van de amide ruggengraat; peptoïden in de zijketens worden afgewenteld op het stikstofatoom van de hoofdketen. Cruciaal, dit geeft peptoids grotere weerstand tegen proteolyse. Peptoïden worden gewoonlijk gesynthetiseerd met de submonomer methode ontwikkeld door Zuckermann et al., Waarbij peptoïde monomeren kunnen worden opgebouwd door opeenvolgende haloacetylation een aminefunctionaliteit gehecht aan een vaste drager en daaropvolgende verplaatsing van het halogeen met een primair amine. 1 Onze fractie heeft onlangs een aanpassing aan deze submonomer methode om lysine en arginine-type peptoïde residuen worden opgenomen in dezelfde peptoïde sequentie voor het first tijd. 2 Deze handleiding benadering vaste-fase synthese peptoïde gebruikt handel verkrijgbare middelen en gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur, toegankelijk te maken voor de meeste laboratoria. Peptoïden is aangetoond veelbelovende activiteiten tegen een groot aantal gramnegatieve bacteriën, grampositieve bacteriën en schimmels soorten die vergelijkbaar met vele bekende antimicrobiële peptiden. 3-9 In ons werk hebben peptoids gebruikt als nieuwe anti-infectieuze verbindingen voor behandeling van verwaarloosde tropische ziekte leishmaniasis. 5,10 Leishmaniasis endemisch in meer dan 80 landen en er wordt geschat dat meer dan 12 miljoen mensen wereldwijd geïnfecteerd. 11 De ziekte wordt veroorzaakt door protozoaire parasieten die door de beet van een zandvlieg overgedragen. Leishmania soort kan cutane leishmaniasis, een aandoening die leidt tot littekenvorming en schade aan de slijmvliezen, of levensbedreigende viscerale toeg veroorzakenhmaniasis, die fataal orgaanschade veroorzaakt. Geen vaccin beschikbaar voor deze ziekte en bestaande behandelingen beroep op een beperkt aantal geneesmiddelen die ernstige bijwerkingen hebben. Bovendien resistentie tegen bestaande geneesmiddelen is een opkomende en ernstig probleem dat nieuwe behandelingen zijn hard nodig om effectieve behandeling van leishmaniasis in de toekomst. 12-16 In deze antimicrobiële toepassingen worden vaak ontworpen peptoids amfipathische met een mengsel van kationische en hydrofobe monomeren zijn. 3,4 Dit kan peptoïden een zekere mate van selectiviteit voor bacteriecellen, verminderen toxiciteit voor zoogdiercellen, en hun activiteit als moleculaire transporteurs verbeteren . 17-20 de meerderheid van de anti-infectieuze peptoïden in de literatuur bevatten kationische zij ketens die uitsluitend bestaan uit ofwel amino gefunctionaliseerde lysine-type monomeren of arginine-type residu. Peptide-peptoïde chimeren, waarbij de kationische ketens bestaan ​​van eenmino lysine of arginine, werden ook gesynthetiseerd om het effect van kationische groepen de activiteit of toxiciteit te onderzoeken. 21-25 Polylysine peptoïden kan eenvoudig worden gesynthetiseerd onder toepassing van in de handel verkrijgbare Boc-beschermde aminen. De poly-arginine peptoïden gerapporteerd kan worden uitgevoerd met een werkwijze die pyrazool-1-carboxamidine als guanidinylation hulpstof. 18 Dit kan echter alleen plaatsvinden nadat de peptoïde werd gesplitst van de hars en Boc bescherming aan zijketens verwijderd, zodat elke lysine-type resten in de sequentie wordt omgezet in een argininerest. In een poging selecteerbaar om chemische en biologische eigenschappen van de verbindingen, ontwikkelden we een methode die dubbele kationische functionaliteit (bijvoorbeeld N Lys en Arg N) op te nemen in een bepaalde peptoïde sequentie voor het eerst mogelijk maakt. 2 Hierin beschrijven we de synthese, zuivering en karakterisering van two nieuwe peptoïden die zowel lysine en arginine-type residuen in dezelfde volgorde bevatten. De werkwijze maakt gebruik van orthogonale N en N-Boc -Dde beveiliging op hars met pyrazool-1-carboxamidine als guanidinylation reagens. De biologische evaluatie van deze peptoids wordt ook beschreven in cytotoxiciteit bepalingen tegen Leishmania mexicana, de verwekker van cutane leishmaniasis. Dit verschaft een praktische methode om peptoïden met dubbele kationische functionaliteit en de biologische activiteit te beoordelen. Verwacht wordt dat deze werkwijze de synthese van amfipathische peptoids zal bevorderen via de peptoïde gemeenschap in de toekomst.

<table><tbody><tr><td>Polypropyleen solid phase extractiecartridges met twee frits</td><td>Crawford Scientific</td><td>12131017 en 12131015</td><td>20 ml en 6 ml cartridges gebruikt in deze bereiding</td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur</td><td>Tokyo Chemical Industry (Europe)</td><td>T0431-100g</td><td>>98%; VOORZICHTIG: kan ernstige brandwonden en irritatie van de luchtwegen veroorzaken</td></tr><tr><td>N,N'-diisopropylcarbodiimide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>38370-100ML</td><td>>98%; VOORZICHTIG: gevaarlijk voor de ogen, de huid en via inademing, kan ook sensibilisatie veroorzaken</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Fischer Scientific</td><td>10346180</td><td>HPLC-kwaliteit; VOORZICHTIG: vermoedelijke teratogeen</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fischer Scientific</td><td>10407440</td><td>HPLC-kwaliteit</td></tr><tr><td>Dichloormethaan</td><td>Fischer Scientific</td><td>10354263</td><td>99,8%; VOORZICHTIG: vermoedelijke carcinogeen</td></tr><tr><td>Bromazetijnzuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17000-100G</td><td>>99%; VOORZICHTIG: veroorzaakt brandwonden en is gevaarlijk voor de huid, ogen en luchtwegen</td></tr><tr><td>(S)-(-)-alfa methylbenzylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>115568-100G</td><td>98%; VOORZICHTIG: schadelijk indien ingeslikt, giftig bij contact met de huid, veroorzaakt ernstige brandwonden op de huid en oogbeschadiging, gebruikt voor de synthese van de Nspe-monomeer</td></tr><tr><td>N-Boc 1,4-diaminobutaan</td><td>Tokyo Chemical Industry (Europe)</td><td>A1373-25g</td><td>>98%; VOORZICHTIG: veroorzaakt ernstige brandwonden op de huid en oogbeschadiging, gebruikt voor de synthese van de NLys-monomeer</td></tr><tr><td>N-Boc 1,2-diaminoethaan</td><td>Tokyo Chemical Industry (Europe)</td><td>A1371-25g</td><td>>97%; VOORZICHTIG: veroorzaakt ernstige brandwonden op de huid en oogbeschadiging, gebruikt voor de synthese van de Nae-monomeer</td></tr><tr><td>1,2-diaminobutaan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D13208-100G</td><td>99%; VOORZICHTIG: ontvlambare vloeistof en damp, schadelijk indien ingeslikt of ingeademd, giftig bij contact met de huid, veroorzaakt ernstige brandwonden op de huid en oogbeschadiging, gebruikt bij de synthese van de NhArg-monomeer</td></tr><tr><td>1,4-diaminoethaan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03550-250ML</td><td>>99,5%; VOORZICHTIG: ontvlambare vloeistof en damp, schadelijk indien ingeslikt of ingeademd, giftig bij contact met de huid, veroorzaakt ernstige brandwonden op de huid en oogbeschadiging, gebruikt bij de synthese van de NnArg-monomeer &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>1H-pyrazool-1-carboxamidiniumchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>402516-10G</td><td>als HCl-zout; VOORZICHTIG: schadelijk indien ingeslikt en kan een allergische huidreactie veroorzaken, veroorzaakt ernstige oogbeschadiging</td></tr><tr><td>Hydrazinemonohydraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>207942-5G</td><td>reagenskwaliteit; VOORZICHTIG: vermoedelijke carcinogeen, dodelijk indien ingeademd en veroorzaakt ernstige brandwonden op de huid en ogen</td></tr><tr><td>2-acetyl dimedon</td><td>Novabiochem</td><td>8510150005</td><td>Dde-OH</td></tr><tr><td>Rink Amide-hars</td><td>Novabiochem</td><td>8551190005</td><td>100-200 maas, hoge belasting</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>411027-1L</td><td>>99,5%, een gecontroleerde stof, dus voldoende toestemming moet worden verkregen voordat u koopt; VOORZICHTIG: zeer ontvlambare vloeistof en damp, schadelijk indien ingeslikt en giftig bij contact met de huid of indien ingeademd, veroorzaakt ernstige brandwonden op de huid en oogbeschadiging, schadelijk voor aquatisch leven met langdurige effecten</td></tr><tr><td>Triisopropylsilaan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>233781-50G</td><td>98%; VOORZICHTIG: ontvlambare vloeistof en damp, veroorzaakt huidirritatie en ernstige oogirritatie</td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>ThermoFischer&nbsp;</td><td>DAL1025</td><td>Niet geclassificeerd als gevaarlijk</td></tr><tr><td>Schneider's Insect Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9895-1L</td><td>Poeder, medium moet voor gebruik worden bereid volgens de instructies van de fabrikant; laat opwarmen tot kamertemperatuur voor gebruik in biologische tests</td></tr><tr><td>96-wells platen</td><td>VWR</td><td>734-1793</td><td>Vlakke bodem (om fluorescentiemeting vanaf de bodem mogelijk te maken), behandeld voor weefselcultuur</td></tr><tr><td>Solvent reservoirs</td><td>VWR</td><td>613-1182</td><td>Gebruikt met multi-kanaals pipet</td></tr><tr><td>Multi-kanaals pipet</td><td>Eppendorf</td><td>3122000043</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips</td><td>Starlab Group</td><td>S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810</td><td>Volume van de tip afhankelijk van de gebruikte pipet. 10&nbsp;&micro;l, 10 - 200&nbsp;&micro;l en 1.000&nbsp;&micro;l aanbevolen voor assays</td></tr><tr><td>25 cm3 celcultuurflacons</td><td>VWR</td><td>734-2312</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifugebuizen</td><td>VWR</td><td>525-0791</td><td></td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide (moleculaire biologiekwaliteit)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td>Niet geclassificeerd als gevaarlijk</td></tr><tr><td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td><td>ThermoFischer&nbsp;</td><td>10082139-100mL</td><td>Gibco</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>ThermoFischer&nbsp;</td><td>15140148-20mL</td><td>Afkorting: P/S</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46006-100mg</td><td>Amphotericin B-trihydraat, VetranalTM analytisch standaard</td></tr></tbody></table>

een efficiënte methode voor de synthese van peptoïden met gemengde lysine-type / arginine-type monomeren en evaluatie van hun anti-leishmania activity

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

Dit protocol beschrijft de handmatige vaste-fase synthese van lineaire peptoïden die twee verschillend functionele cationische monomeren bevatten. In deze procedure kunnen amino gefunctionaliseerde 'lysine' en guanido gefunctionaliseerde 'arginine' peptoïde monomeren binnen dezelfde peptoïdesequentie worden opgenomen. Deze procedure maakt gebruik van on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylideen)ethyl) of Dde bescherming, orthogonale omstandigheden ten opzichte van de Boc bescherming van lysine monomeren. Daaropvolgende deprotectie maakt een efficiënte on-resin guanidineringreactie mogelijk om de arginineresiduen te vormen. De procedure is compatibel met de algemeen gebruikte submonomer-methode van peptoïde synthese, waardoor eenvoudige peptoïden kunnen worden gemaakt met behulp van gebruikelijke laboratoriumapparatuur en commercieel verkrijgbare reagentia. De representatieve synthese, zuivering en karakterisering van twee gemengde peptoïden wordt beschreven. De evaluatie van deze verbindingen als potentiële anti-infectiva in screeningsassays tegen Leishmania mexicana wordt ook beschreven. De protozoaparasiet L. mexicana is een veroorzaker van cutane leishmaniasis, een verwaarloosde tropische ziekte die wereldwijd tot 12 miljoen mensen treft.

Als representatief resultaat, de synthese en karakterisatie van twee 12 residu peptoïden met twee lysine-type monomeren en tweewielige arginine monomeren elk zal worden beschreven. De volgende resultaten van cytotoxiciteit worden ook getoond. Twee peptoïden [(N Narg N spe N spe) (N ae N spe N spe)] 2 (a) en [(N hArg N spe N spe) (N Lys N spe N spe)] 2 (b) werden gesynthetiseerd met behulp 120 mg Rink amide hars elke (belading = 0,79 mmol / g). Alle acetylering en verdringing stappen werden uitgevoerd zoals hierboven beschreven, waarbij alle reagentia commercieel gekocht. Voor deze resten werden de volgende aminen toegepast bij de verdringingsstap: N spe (S) - (-) - α-methylbenzylamine, N ae N - (tert-butoxycarbonyl) -1,2-diaminoethane, N Lys N - (tert-butoxycarbonyl) -1,4-diaminobutaan. Voor de argininederivaat residu werden de volgende beschermde diaminen gekoppeld: N hArg 1,4-diaminobutaan of N Narg 1,2-diaminoethaan, gevolgd door on-hars beschermende 2-acetyldimedone (Dde-OH). Nadat de gehele sequentie was gesynthetiseerd, hydrazine ontscherming van de Dde geeft vrije aminen guanidinylate. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig1.jpg" /> Figuur 1. peptoïde structuren (a) [(N Narg N spe N spe) (ae N N N spe spe)] 2 en (b) [(N hArg N spe N spe) (N <stro<html> ng&gt; Lys N spe N spe)] 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig2.jpg" /> Figuur 2. De methode die wordt gebruikt om gemengde arginine / lysine peptoïden synthetiseren. I. Standaard verplaatsingsstap de submonomer methode diamine; ii. Toevoeging van Dde-OH, 90 minuten naar vrije amine te beschermen; iii. Verdere toevoegingen aan de peptoïde keten uit te breiden met behulp van de submonomer methode; iv. Ontscherming van Dde toepassing van 2% hydrazine in DMF; V. Guanidinylation vrije amine op hars met pyrazool-1-carboxamidine en DIPEA in DMF; vi. Zure klieving van de hars en ontscherming van Boc groepen.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Na afsplitsing van de hars en lyofilisatie werden de ruwe producten verkregen als een wit poeder: (a) 154 mg, (b) 163 mg. De producten werden gezuiverd door middel van RP-HPLC zoals beschreven maximum 50 mg injecties met een LC pomp met een UV-vis detector (λ = 250 nm) met een analytische kolom 250 mm x 10 mm, 5 urn; stroomsnelheid = 2 ml / min. Fracties overeenkomend met de doelmassa werden gecombineerd en verkregen als een wit poeder: (a) 54 mg (b) 65 mg, uiteindelijke opbrengsten van ongeveer 30% voor fracties&gt; 90% zuiver. De eindverbinding identiteit na zuivering werd bevestigd door LC-MS (zie figuur 3) met een drievoudige quadrupool massaspectrometer uitgerust met een UPLC en een fotodiodearraydetector. Nauwkeurige massa spectrometrie werd uitgevoerd met dezelfde spectrometer op t<html> Hij [M + 2H] 2+ ionen. De volgende berekende en de waargenomen massa&#39;s werden gevonden in nauw overleg (figuur 4): (a) berekend = 896,0026 ame, waargenomen = 896,0038 ame; (B) berekend = 952,0691 ame, waargenomen = 952,0730 amu. <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig3.jpg" /> Figuur 3. LC-MS gezuiverd peptoïden. (A) m / z = 1792 en (b) m / z = 1903. Waar de top is TIC, midden LC-MS spectrum, onder UV chromatogram bij 220 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig4.jpg" /> Figuur 4. Nauwkeurige massaspectrometrie gegevens peptoïden (a) en (b).&quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Product zuiverheid werd bepaald met analytische RP-HPLC (LC pomp met een UV-vis detector een analytische kolom, 4,6 mm x 100 mm, 3,5 urn; stroomsnelheid = 1 ml / min), en gevisualiseerd op 220 nm, de absorptie amide ruggengraat. Figuur 5a en 5b blijkt dat de verbindingen homogeen. <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig5.jpg" /> Figuur 5. Analytische HPLC van het gezuiverde peptoïden (a) en (b). Er is een gradiënt 0-100% B over 30 minuten, kolomoven bij 40 ° C (A = 95% H2O, 5% MeCN, 0,05 % TFA;. B = 95% MeCN, 5% H2O, 0,03% TFA) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig5large.jpg" target="_blank">Zoom cl</a>ick hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Het gezuiverde peptoïden (a) en (b) getest in cytotoxiciteit bepalingen tegen L. mexicana axenic amastigoten. Bevroren voorraden van L. mexicana werden ontdooid en getransformeerd naar het amastigoot podium klaar voor de test. 72 uur na het ontdooien, moet de parasieten insect stadium promastigoten in hun procyclische vorm, in de log-fase met veel delende cellen. In dit stadium parasieten kunnen worden omgezet in de amastigoot fase met de pH en temperatuur verschuiving beschreven. 27 Op dag 9 van de transformatie, de parasieten in de niet-replicerende infectieuze metacyclische promastigoot fase. Tenslotte op dag 14, moet de parasieten in de pathogene amastigoot fase waarin parasieten niet de karakteristieke flagella van de promastigoten. 28 5 mM voorraadoplossingen van de verbindingen bereid in celkweekniveau DMSO en getest in drievoud opeen minimum van twee gelegenheden om een ​​robuuste dataset te garanderen werd verzameld. Een representatieve 96-well plaat is opgenomen in figuur 6. Aan het einde van de test, werd de cellevensvatbaarheid reagens aan elk putje en de fluorescentie toegevoegd werd gemeten zoals beschreven voor de levensvatbaarheid van parasieten bij elke geteste concentratie te berekenen (zie figuur 7 ). ED 50-waarden werden berekend als peptoïde (a)&gt; 100 uM en peptoïde (b) respectievelijk 37 uM. De foutbalken uitgezet, tonen het verschil tussen putten als een standaarddeviatie en blijkt dat dit redelijk voor de meeste bars. <img alt="figuur 6" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig6.jpg" /> Figuur 6. Representatieve 96 wells plaat plan voor een cytotoxiciteit assay op 2 peptoïde-oplossingen (met inbegrip van positieve en negatieve controles). Med + = medium (Schneider&#39;s Insect Medium, pH 5,5, 20% FBS, 1% P / S). L. mex. =8 x 10 6 / ml parasiet cultuur in med +. AmphoB = 5 mM in DMSO. Peptoïde = 5 mM voorraadoplossing in DMSO. Lege putjes steriel water bevatten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 7" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig7.jpg" /> Figuur 7. Resultaten van cytotoxiciteit assay tegen L. mexicana axenic amastigoot parasieten behulp peptoïde (a) en (b). Men kan zien dat de peptoïde (b) effectiever dan peptoïde (a) vermindering van het percentage van levensvatbare parasieten, zowel verbindingen met een dosisafhankelijk effect. De fout bars uitgezet tonen de variatie tussen putten als een standaarddeviatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Een protocol voor het synthetiseren van peptoïden met gemengde kationische functionaliteit in dezelfde sequentie wordt gepresenteerd (lysine- en arginine-achtige monomeren). Het daaropvolgende testen van deze verbindingen tegen Leishmania mexicana, de protozoa-parasieten die cutane leishmaniasis veroorzaken, wordt ook beschreven.

Een efficiënte methode voor de synthese van peptoïden met Gemengde lysine-type / Arginine-type monomeren en evaluatie van hun anti-leishmania Activity

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Het algemene doel van deze procedure is om zowel lysine- als arginine-type monomeren in dezelfde peptoidsequentie te introduceren en de activiteit van deze verbindingen tegen Leishmania mexicana te evalueren, de parasieten die de verwaarloosde tropische ziekte cutane leishmaniasis veroorzaken. Er is dringend behoefte aan nieuwe therapeutische middelen voor cutane leishmaniasis, en deze procedure kan helpen bij het identificeren en ontwikkelen van peptoiden als een nieuwe klasse potentiële anti-infectiva voor deze verwaarloosde tropische ziekte. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat peptoiden kunnen worden gesynthetiseerd die gemengde kationische functionaliteit bevatten.Dit is zeer wenselijk, aangezien het kan helpen bij het moduleren van de biologische activiteiten van de sequenties. Hoewel deze test is uitgevoerd tegen de zoogdiervorm van de parasiet, kan deze ook worden gebruikt tegen het insectstadium van Leishmania mexicana of worden toegepast op zoogdiercellijnen. Een visuele demonstratie van deze methode is zeer nuttig, omdat het de stapsgewijze aard van de synthese laat zien en tevens de parasietcultuur op verschillende momenten in de levenscyclus van Leishmania mexicana.Om deze procedure te starten, bereidt u de oplossingen in dimethylformamide voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg vervolgens 0,1 millimol Fmoc-beschermde rink-amidehars toe aan een afgesloten polypropyleen reactievaat van 20 milliliter met twee fritters. Voeg vijf milliliter dimethylformamide toe en laat het vaat 60 minuten staan bij kamertemperatuur.Drain daarna de DMF met behulp van een vacuümplatform voor vaste-fase-extractie. Voeg vervolgens twee milliliters van de bereide piperidinoplossing toe. Plaats het vat op een schudplatform bij 450 RPM op kamertemperatuur en schud gedurende vijf minuten.Draineer de oplossing met behulp van het vacuümstation. Voeg vervolgens twee milliliters piperidine-oplossing toe en schud gedurende 15 minuten onder dezelfde condities. Nadat het schudden is voltooid, dient de oplossing via een vacuümstation te worden gedraineerd.Voeg twee milliliters DMF toe en meng 30 seconden om de hars te wassen. Laat het DMF weglopen en herhaal het wassen drie keer. Om te beginnen met de synthese van het submonomeer, voegt u één milliliter van de bereide bromoazijnzuuroplossing en 0,2 milliliters van de bereide DIC-oplossing toe.Schud 20 minuten bij kamertemperatuur. Giet vervolgens de oplossing af en was drie keer met telkens twee milliliters DMF. Voeg één milliliter van de bereide amine-oplossing toe.Schud de hars vervolgens 60 minuten bij kamertemperatuur. Giet de oplossing af en was de hars drie keer met telkens twee milliliters DMF. Voeg daarna één milliliter bromoazijnzuuroplossing en 0,2 milliliters DIC-oplossing toe.Schud 20 minuten bij kamertemperatuur. Giet vervolgens de oplossing af en was drie keer met telkens twee milliliter DMF. Voeg één milliliter onbeschermde diamine-oplossing toe aan de hars om een guanidine-gefunctionaliseerd monomeer te introduceren.Schud 60 minuten lang bij kamertemperatuur. Giet vervolgens de oplossing af en was de hars drie keer met twee milliliters DMF. Voeg 0,5 milliliters van de bereide 2-acetyldimedonoplossing toe.Schud 60 minuten bij kamertemperatuur. Giet vervolgens de oplossing af en was de hars drie keer met twee milliliters DMF. Zet de synthese van de submonomeer voort tot de gewenste sequentie is verkregen.Voeg vervolgens vier milliliters van de bereide hydrazine-oplossing toe en schud drie minuten bij kamertemperatuur. Giet de oplossing af en herhaal dit drie keer. Was daarna de hars drie keer met telkens twee milliliters DMF.Voeg DIPEA en zes equivalenten pyrazol-1-carboxamidine per vrije amine in de peptoidsequentie toe. Schud gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Giet de oplossing af nadat het schudden is voltooid.Was de hars drie keer met twee milliliters dichloormethaan per wasbeurt. Laat de hars 10 minuten aan de lucht drogen en bewaar deze voor toekomstig gebruik. Na de toevoeging van aminen kan een testklieving worden uitgevoerd om de voortgang van de synthese te controleren.Voeg voor de start van de uiteindelijke splitsing vier milliliter van het cleavage-cocktail toe aan dezelfde gefiltreerde reactiecartridge die voor de synthese is gebruikt en sluit het vat af. Schud gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur. Filtreer vervolgens de cleavage-cocktail met het gefiltreerde reactievat van de hars in een rondbodemkolf.Verdampt de cleavage-cocktail met behulp van een rotatieverdamper. Voeg twee milliliters watervrije diethylether toe om het peptoïde te laten neerslaan. Verwijder de diethylether met een pipet en gooi deze weg.Herhaal vervolgens de precipitatie met diethylether drie keer. Zodra de precipitatie voltooid is, wordt de ruwe peptoïde opgelost in 10 milliliters van de bereide oplossing van acetonitril en aangezuurd water. Breng dit over naar een vooraf gewogen container.Bevries het product vervolgens bij minus 20 graden Celsius en lyofiliseer dit tot een droog poeder, klaar voor zuivering via reverse phase HPLC. Nadat de Leishmania mexicana-parasieten zijn gekweekt en getransformeerd naar het axene amastigotenstadium, wordt de cytotoxiciteitstest gestart door de voorraadoplossingen van de verbindingen voor te bereiden zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg twee microliter van de vijf millimolaire peptoid-voorraadoplossing, de amfotericine B-controle en de DMSO-controle toe aan de bovenste rij van een 96-wells plaat, zoals beschreven in het tekstprotocol.Voeg met een multichannelpipet 48 µL vers medium toe aan de bovenste rij. Voeg 25 µL vers medium toe aan alle overige rijen. Voer vervolgens een seriële verdunning uit door 25 µL van de oplossing uit de bovenste rij te pipetteren, toe te voegen aan de rij eronder en te mengen.Herhaal de verdunningen voor de gehele plaat en gooi de laatste 25 µL die uit de onderste rij worden gepipetteerd weg. Breng vervolgens een parasietcultuur over naar een centrifugebuis van 50 ml. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 447 ×g.Giet het oude medium af en voeg 10 milliliter vers medium toe. Resuspendeer vervolgens met een pipet voorzichtig het pellet parasieten in het nieuwe medium. Tel de parasieten met een verbeterde Neubauer-hemocytometer en verdun de cultuur tot acht miljoen parasieten per milliliter.Nadat de cultuur is verdund, voegt u 25 µL parasieten toe aan elke well. Incubeer de plaat gedurende 60 minuten bij 32 °C. Zodra de incubatie voltooid is, verwijdert u 40 µL van de oplossing uit elke well.Voeg 90 µL vers medium toe aan elke well en incubeer gedurende 24 uur bij 32 °C. Voeg vervolgens 10 µL resazurine-gebaseerde cellevensvatbaarheidsoplossing toe aan elke well. Incubeer gedurende vier uur bij 32 °C.Nadat de incubatie is voltooid, wordt een platenlezer gebruikt om de fluorescentie te meten. Analyseer de gegevens door de gemiddelde achtergrondwaarde te verwijderen en de fluorescentie van de wells na normalisatie ten opzichte van de DMSO-controles te vergelijken. In deze studie worden twee peptoiden gesynthetiseerd met gebruik van telkens 120 milligram rink amide resin.Producten worden gezuiverd via reverse-phase hogedrukvloeistofchromatografie, en fracties die overeenkomen met de doelmassa worden samengevoegd en verkregen als witte poeders. De hoeveelheid verzamelde peptoïden voor beide varianten wordt hier getoond, met opbrengsten van ongeveer 30% voor fracties met een zuiverheid van meer dan 90%. De zuiverheid van het product wordt beoordeeld met behulp van analytische reverse-phase HPLC en gevisualiseerd bij 220 nanometer, de absorptie van de amide-backbone.De peptoïden blijken beide homogeen te zijn. De representatieve resultaten van de cytotoxiciteitsassays tegen L. mexicana worden hier weergegeven. Stamoplossingen van de verbindingen met een concentratie van 5 mM zijn bereid in DMSO van celkweekkwaliteit en in triplicaten ten minste tweemaal getest om robuuste gegevens te garanderen.Het kan worden gezien dat peptoid B effectiever is dan peptoid A in het verlagen van het percentage levensvatbare parasieten, waarbij beide een dosisafhankelijk effect vertonen. Na het bekijken van deze methode zou u een goed begrip moeten hebben van hoe peptoiden die zowel lysine-type als arginine-type monomeren bevatten gesynthetiseerd, gekarakteriseerd en gezuiverd kunnen worden, en hoe deze kunnen worden gebruikt in cytotoxiciteitstests tegen Leishmania mexicana. Onze methode om dubbele kationische functionaliteit aan peptoiden toe te voegen, voegt slechts één extra eenvoudige stap toe aan de algemeen gebruikte submonomeermethode voor peptoïdesynthese.Volgens deze methode kunnen lysine- of arginine-type submonomeren van verschillende lengtes worden toegevoegd om de diversiteit van de bibliotheek te vergroten, bijvoorbeeld met zijketens van twee tot zes koolstofatomen in lengte. Tijdens de peptoidsynthese is het essentieel om eraan te denken de hars tussen de stappen door grondig te wassen om ongewenste additie- of deletieproducten te voorkomen. Deze methode biedt onderzoekers de mogelijkheid om de biologische activiteit van gemengd kationisch-gefunctionaliseerde peptoiden te onderzoeken en deze activiteit te vergelijken met peptoiden die uitsluitend lysine- of arginine-type monomeren bevatten.Ten slotte moet u er rekening mee houden dat de parasieten en verschillende van de in dit protocol gebruikte reagentia extreem gevaarlijk kunnen zijn. Daarom is het belangrijk om altijd adequate persoonlijke beschermingsmiddelen te gebruiken en, waar appropriate, in een zuurkast of een microbiologische veiligheidskast te werken.

an-efficient-method-for-synthesis-peptoids-with-mixed-lysine

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Een eenvoudige en algemene handleiding peptoïde synthese methode waarbij basisuitrusting en de handel verkrijgbare reagentia wordt geschetst, zodat peptoids gemakkelijk worden gesynthetiseerd in de meeste laboratoria. De synthese, zuivering en karakterisatie van een amfifiele peptoïde 36mer wordt beschreven, evenals de zelf-assemblage in zeer geordende nanosheets.

Vaste-fase-Submonomer Synthese van peptoïde polymeren en hun zelf-assemblage in zeer geordende nanosheets

De efficiënte solid-phase peptide synthese van een gefunctionaliseerde bis-peptide trimeer gebruik te maken van een "veiligheidspal" decollete procedure vanaf HMBA hars wordt beschreven.

Vaste fase synthese van een gefunctionaliseerd Bis-Peptide Met behulp van &quot;Veiligheid Catch&quot; Methodologie

This video demonstrates the process of assessing the intracellular distribution of virus-derived peptide-modified antibody conjugates using confocal microscopy. The viral-derived nuclear localization sequence directs antibody-conjugates within the cytoplasm, confirmed through immunostaining and fluorescence measurement.

Evaluating the Intracellular Distribution of Virus-Derived Peptide-Modified Antibody Conjugates

Peptide tertiaire amides (PTA) zijn een superfamilie van peptidomimetica die omvatten maar zijn niet beperkt tot, peptiden, peptoïden en N-gemethyleerd peptiden. Hier beschrijven we een synthetische methode die zowel split-en-zwembad en sub-monomeer strategieën combineert tot een kraal een-verbinding bibliotheek van PTA synthetiseren.

Split-en-zwembad Synthese en karakterisatie van peptide Tertiaire amide Bibliotheek

Peptidarrays gesynthetiseerd door de SPOT-methode kunnen worden gebruikt om de substraatspecificiteit van proteïne lysine methyltransferases (PKMTs) te analyseren en om het substraatspectrum van PKMTs te definiëren om hun biologische rol te begrijpen. Dit protocol beschrijft hoe peptidearrays te synthetiseren, ze te methyleren met PKMTs en de resultaten te analyseren.

Specificiteit analyse van eiwit-lysine methyltransferases Met behulp van SPOT Peptide Arrays

Een eenvoudige en algemene methode voor de synthese van cyclische peptiden met behulp van microgolfbestraling wordt geschetst. Deze procedure maakt de synthese mogelijk van cyclische peptiden met een ruggengraat met verschillende conformatieën, terwijl de zijketens en de farmacofore groepen behouden blijven en daarom, maakt het mogelijk om te screenen op de bioactieve conformatie.

Ontwikkeling van een Backbone cyclisch peptide bibliotheek als potentieel antiparasitaire Therapeutics behulp van microgolfstraling

Hier presenteren de auteurs een eenvoudig en efficiënt protocol om een lineair antigeen epitoop te definiëren met behulp van een gezuiverd monoklonaal antilichaam en peptide scanning door dot-blot hybridisatie. De geïdentificeerde epitoop kan vervolgens worden gebruikt in therapeutische en diagnostische toepassingen.

Peptide Scanning-bijgestaan ​​Identificatie van een monoklonaal antilichaam-erkende Lineair B-celepitoop

Een protocol wordt beschreven voor de handmatige synthese van oligo-peptoids gevolgd door sequentieanalyse door massaspectrometrie.

Synthese en analyse van de Spectrometrie van de massa van Oligo-peptoids

De synthese van peptide polyamine gebaseerde amfifielen (PPA) is een grote uitdaging wegens de aanwezigheid van meerdere amine stikstofatomen, waarvoor oordeelkundig gebruik om groepen te maskeren deze reactieve functionaliteiten te beschermen. In deze paper beschrijven we een facile methode voor de bereiding van deze nieuwe klasse van zelfassemblerende moleculen.

Facile Protocol voor de synthese van het zelf monteren van Peptide Polyamine gebaseerde amfifielen (PPA) en verwante biomaterialen

Een protocol wordt gepresenteerd voor de synthese van informatie-gecodeerde peptoid oligomeren en voor de sequentie-gerichte zelfassemblage van deze peptoids in moleculaire ladders met behulp van amines en aldehyden als dynamische covalente reactant paren en Lewis zure zeldzame aarde metalen triflates als multi-role reagentia.

Synthese van informatiedragende Peptoids en hun reeks-geleide Dynamische Covalent Zelfassemblage

Dit protocol beschrijft een methode voor het produceren en evalueren van de antimicrobiële activiteit en cytotoxiciteit van het kationische peptide Mel4 en het peptide-nabootser RK758. Door chemische synthese, recombinante expressie en gestandaardiseerde functionele assays te integreren, biedt het een gestroomlijnde workflow voor de productie en het testen van peptiden en kleinmolecuul-imitaties.

Productie en testen van antimicrobiële peptiden en hun nabootsers

Leer een efficiënte methode voor de synthese van peptoïden met gemengde lysine- en arginine-type monomeren en hun evaluatie tegen Leishmania mexicana. Dit protocol ondersteunt de ontwikkeling van nieuwe anti-infectiva.

Een efficiënte methode voor de synthese van peptoïden met Gemengde lysine-type / Arginine-type monomeren en evaluatie van hun anti-leishmania Activity (Video) | JoVE Journal

Een efficiënte methode voor de synthese van peptoïden met Gemengde lysine-type / Arginine-type monomeren en evaluatie van hun anti-leishmania Activity

Meer video's verkennen