Monitoring ruimtelijke segregatie in Surface Kolonisatie microbiële populaties

Het algemene doel van deze procedure is om de ruimtelijke distributie van microbiële stammen tijdens zwermen, glijden of biofilmvorming waar te nemen met behulp van fluorescentiemicroscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de sociale microbiologie, zoals de manier waarop ruimtelijke segregatie de microbiële interactie beïnvloedt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de fitness en ruimtelijke distributie van microbiële stammen eenvoudig kunnen worden beoordeeld met microscopische technieken en subsegmentbeeldanalyse.

Theresa Holscher, een PhD-onderzoeker uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Voeg de dag vóór het experiment 3 mL LB-medium toe aan een kweekbuis en inoculeer deze met een vriesvoorraad van B.subtilis. Herhaal deze inoculatie met een aparte buis voor elke relevante stam.

Plaats de buisjes overnacht in een horizontale schudincubator bij 37 °C. Om platen voor swarming- en sliding-experimenten voor te bereiden, giet 20 mL getempereerd LB-medium in een polystyreen Petri-schaal van 90 mm. Sluit de schaal onmiddellijk en plaats deze aan de zijkant van de steriele zuurkast om minimaal één uur af te koelen.

Bereid vervolgens platen voor colony biofilm-experimenten door 25 milliliters agar twee keer SG-medium in een 90 millimeter Petri-schaal te gieten. Sluit de platen onmiddellijk en laat ze minstens één uur afkoelen in stapels van maximaal vier. Plaats ter start de LB-agar swarming- en sliding-platen in een laminaire flowkast en verwijder de deksels.

Laat de platen 20 minuten drogen. De vochtigheid van de platen is in deze experimenten van cruciaal belang. Terwijl overmatige vochtigheid ervoor zorgt dat bacteriën kunnen zwemmen, voorkomt langdurig drogen zwermen (swarming) en glijden (sliding).

Op dezelfde manier is de structuur van de koloniebiofilm afhankelijk van de droogte van het medium. Bepaal met een spectrofotometer de optische dichtheden van overnight-startculturen bij 600 nanometer. Meng in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter dichtheidsgenormaliseerde hoeveelheden van de stammen die groen en rood fluorescent eiwit produceren voor een totaal volume van 200 microliters.

Vortex de buis gedurende drie seconden. Breng met een micropipet twee µL van de gemengde cultuur aan in het centrum van een vooraf gedroogde LB agarplaat van 90 mm in de laminaire flowkast. Laat de plaat 10 minuten drogen.

Incubeer tenslotte de platen bij 37 °C in een rechtopstaande positie om te voorkomen dat er condensatie op het agar-oppervlak verzamelt. Plaats eerst de 2x SG agarplaten gedurende 15 minuten in een laminaire flowkast om te drogen. Voeg vervolgens telkens 100 µL van de B.subtilis 168 startculturen, de biofilmstammen die respectievelijk groen en rood fluorescent eiwit produceren, toe aan een 1,5 mL microcentrifugebuis.

Vortex de buis gedurende drie seconden. Bereid buizen voor met 100 µL LB-medium en maak met de gemengde cultuur een 10-voudige verdunningsreeks van inoculaten. Breng met een micropipet twee µL van de onverdunde gemengde cultuur aan op de twee keer SG-agarplaat.

Herhaal dit met inoculaten voor de verdunningen 10¹ , 10² , 10³ en 10⁴ , waarbij de spots op gelijke afstand van elkaar worden geplaatst zodat er zes tot negen kolonies op één enkele plaat kunnen groeien. Incubeer de platen rechtop bij 30 °C gedurende één tot drie dagen. Plaats de platen vervolgens op het beeldplatform van een fluorescentiemicroscoop om te beginnen.

Stel voor experimenten met glijden en zwermen de inoculatieplaats, het midden van de Petrischaal, in op de hoek van het zichtveld om de radiale kolonie-expansie te kunnen meten. Pas de vergroting aan naar de hoogste resolutie waarmee het grootste mogelijke gebied van de 90 millimeter plaat kan worden afgebeeld. Pas de belichtingstijd naar behoren aan, afhankelijk van de sterkte van het fluorescentiesignaal.

Positioneer voor de biofilmanalyse een kolonie van belang in het midden van het gezichtsveld. Stel de vergroting in op de hoogste resolutie waarbij de volledige kolonie zichtbaar blijft. De kolonies zijn nu gereed voor meting en analyse.

Analyseer ten slotte de gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol. Deze figuur toont de groei van een typische co-geïnoculeerde colony van twee Bacillus subtilis-stammen. Swarming, een flagel-afhankelijke collectieve beweging over een oppervlak, resulteert in een sterk gemengde populatie.

In deze time-lapse video is het initiële inoculum in het centrum van de plaatuitstrijk geplaatst. Dunlaags zwermen is duidelijk waarneembaar en naarmate de kolonie zich ontwikkelt, lijken de twee rood en groen fluorescerende stammen gemengd en overlappend. Omgekeerd tonen beelden van glijdend gedrag duidelijk afgebakende groeisectoren die overeenkomen met de verschillend gelabelde fluorescerende stammen.

Deze video laat de groei zien van een glijdende, co-geïnoculeerde kolonie waarin de stammen geen functionerende flagellen hebben. Deze koloniën zijn nog steeds in staat zich te verspreiden door middel van een combinatie van uitgescheiden exo-polysacharide, hydrophobine en surfactine. De resulterende koloniën vertonen een duidelijk andere ruimtelijke groeiverdeling in vergelijking met de zwermende stam.

De startceldichtheden van biofilmproducerende kolonies beïnvloedden de ruimtelijke sortering van de resulterende kolonies sterk. Kolonies die werden geïnitieerd met een hoge celdichtheid van de gemengde populaties, vertoonden geringe of geen ruimtelijke sortering. In contrast hiermee konden duidelijke groene en rode fluorescerende sectoren worden gedetecteerd wanneer de celdichtheid bij initiatie laag was.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de relatieve abundanties van fluorescentie-gelabelde stammen in microbiële kolonies bepaalt, ruimtelijke segregatie onderzoekt en de invloed van de dichtheid van stichtercellen bestudeert.