Monitoring ruimtelijke segregatie in Surface Kolonisatie microbiële populaties

Het algemene doel van deze procedure is om de ruimtelijke verdeling van microbiële stammen te observeren tijdens zwermen, glijden of biofilmvorming met behulp van fluorescentiemicroscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van sociale microbiologie, zoals hoe ruimtelijke segregatie microbiële interactie beïnvloedt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de fitheid en ruimtelijke verdeling van microbiële stammen eenvoudig kunnen worden beoordeeld met behulp van microscopische technieken en subsegment-beeldanalyse.

Theresa Holscher, een promovendus uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Voeg op de dag voor het experiment drie milliliter LB-medium toe aan een kweekbuisje en inoculeer het vanuit een vriesvoorraad van B.subtilis. Herhaal deze inoculatie met een afzonderlijk buisje voor elke stam van belang.

Plaats de buisjes in een horizontale schudincubator op 37 graden Celsius voor een nacht. Om platen voor zwerm- en glijexperimenten voor te bereiden, giet 20 milliliter getemperd LB-medium in een polystyreen petrischaal van 90 millimeter. Sluit de schaal onmiddellijk en plaats deze aan één kant van de steriele kap om minimaal een uur te laten afkoelen.

Bereid vervolgens platen voor kolonie-biofilmexperimenten voor door 25 milliliter agar twee keer SG-medium in een 90 millimeter petrischaal te gieten. Sluit de platen onmiddellijk en laat ze afkoelen in stapels van maximaal vier platen gedurende minimaal een uur. Om te beginnen, plaats de LB-agar zwerm- en glijplaten in een laminar flow-kap en verwijder de deksels.

Laat de platen 20 minuten drogen. De vochtigheid van de platen in deze experimenten is cruciaal. Terwijl overtollig vocht bacteriën laat zwemmen, voorkomt langdurig drogen zwermen en glijden.

Ook de structuur van de kolonie-biofilm hangt af van de droogheid van het medium. Bepaal met behulp van een spectrofotometer de optische dichtheden van overnacht gestart kweekjes bij 600 nanometer. Meng in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter gelijkmatig verdeelde hoeveelheden van de groen en rood fluorescerende eiwitproducerende stammen voor een totaal van 200 microliter.

Vortex de buis gedurende drie seconden. Spuit met behulp van een micropipet twee microliter van het gemengde kweekje op het midden van een voorgedroogde 90 millimeter LB-agarplaat in de laminar flow-kap. Laat de plaat 10 minuten drogen.

Vervolgens incubeer de platen bij 37 graden Celsius in een rechtopstaande positie om te voorkomen dat condensatie zich verzamelt op het oppervlak van de agar. Plaats eerst de twee keer SG-agar platen in een laminar flow-kap gedurende 15 minuten om te drogen. Voeg vervolgens 100 microliter van elk de groen en rood fluorescerende eiwitproducerende biofilmstam, B.subtilis 168 starter kweekjes, toe aan een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter.

Vortex de buis gedurende drie seconden. Bereid buisjes voor met 100 microliter LB-medium en creëer met behulp van het gemengde kweekje een 10-voudige verdunningsreeks van inoculaten. Spuit met behulp van een micropipet twee microliter van het niet-verdunde gemengde kweekje op de twee keer SG-agarplaat.

Herhaal dit met inoculaten voor de 10 tot de één, 10 tot de twee, 10 tot de drie en 10 tot de vier verdunning, met gelijke afstanden tussen de punten om zes tot negen kolonies op een enkele schaal te laten groeien. Incubeer de platen rechtop bij 30 graden Celsius gedurende één tot drie dagen. Plaats de platen om te beginnen op het beeldplatform van een fluorescentiedetecterende microscoop.

Voor glij- en zwermexperimenten, plaats de oorsprong van inoculatie, het midden van de petrischaal, naar de hoek van het zichtbare veld om de radiale uitbreiding van de kolonie te kunnen meten. Stel de vergroting in op de hoogste resolutie die de beeldvorming van het grootst mogelijke gebied van de 90 millimeter plaat mogelijk maakt. Pas de belichtingstijd toepast afhankelijk van de sterkte van het fluorescente signaal.

Voor biofilmanalyse, plaats een interessante kolonie in het midden van het gezichtsveld. Stel de vergroting in op de hoogste resolutie die het mogelijk maakt om de hele kolonie te bekijken. De kolonies zijn nu klaar voor meting en analyse.

Analyseer ten slotte de gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol. Deze figuur toont de groei van een typische twee-stam gezamenlijk geïnoculeerde Bacillus subtilis kolonie. Zwermen, een flagellaire-afhankelijke collectieve oppervlaktebeweging, resulteert in een sterk gemengde populatie.

In deze time-lapse video werd het oorspronkelijke inoculant in het midden van de plaatverspreiding geplaatst. Dunne laag zwermen is duidelijk waar te nemen en naarmate de kolonie zich ontwikkelt, lijken de twee rode en groene fluorescerende stammen gemengd en overlappend. Daarentegen tonen beelden van glijgedrag gedefinieerde sectoren van groei die overeenkomen met de verschillend gelabelde fluorescerende stammen.

Deze video toont de groei van een glijende gezamenlijk geïnoculeerde kolonie waarbij de stammen functionele flagellen missen. Deze kolonies zijn nog steeds in staat zich te verspreiden met behulp van een combinatie van uitgescheiden exo-polysaccharide, hydrofobine en surfactine. De resulterende kolonies vertonen een duidelijk ruimtelijk groei-assortiment in vergelijking met de zwermende stam.

Biofilm producerende kolonies beginnen celdichtheden hebben een grote invloed op het ruimtelijke assortiment van de resulterende kolonies. Kolonies gestart met een hoge celdichtheid van de gemengde populaties, vertoonden een kleine of geen ruimtelijke sorteerder. In tegenstelling, wanneer de celdichtheid bij het begin laag was, konden duidelijke groene en rode fluorescerende sectoren worden gedetecteerd.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de relatieve abundanties van fluorescent gelabelde stammen in microbiële kolonies kunt bepalen, ruimtelijke segregatie kunt onderzoeken en de invloed van de dichtheid van de grondstellingscellen kunt bestuderen.