Hybride-Cut: een verbeterde Sectioning Methode voor Recalcitrante plantenweefsel Samples

Het algemene doel van de hybride snijmethode voor weefselsectie is om de integriteit van gesneden moeilijk bewerkbare plantweefsels te verbeteren, die met taaie vezels en silicakristallen, om geschikte weefselmonsters te creëren voor anatomische en biologische studies. Planten die een hoog gehalte aan kristallen en silica bevatten, kunnen ernstige paraffinscheuring en problemen bij het snijden ondervinden. Deze methode verbetert de weefselintegriteit aanzienlijk.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het snijden bij ultralage temperaturen in de cryostat de paraffineblok verhardt, waardoor het probleem van kristalschuiving aanzienlijk wordt verminderd. De toepassing van deze techniek kan worden uitgebreid tot in situ hybridisatie, FISH en interne evaluatie, onder andere. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de stappen om ervoor te zorgen dat de paraffineblok stevig aan een podium is bevestigd, uitdagend kunnen zijn.

Om te beginnen, selecteer rijpe phalaenopsisorchideeplanten in het vijfblad-stadium. Verwijder de bladeren voorzichtig door ze langs de middennerf te scheuren. Gebruik een scherp mes om voorzichtig de okselknoppen te verwijderen van de basis van het derde of vierde blad op het monopodiale systeem.

Plaats de monsters onmiddellijk in een glazen scintillatieglas met 15 milliliters ijskoud PFA-fixatief. Breng een vacuüm aan op de monsters in het fixatief bij vier graden Celsius gedurende 15 tot 20 minuten. Kleine bubbels worden vrijgegeven uit de monsters.

Herhaal deze stap totdat de meeste monsters zinken na het vrijgeven van het vacuüm. Houd ten slotte het vacuüm een nacht vast en laat het de volgende dag langzaam vrij. Dompel de gefixeerde monsters vervolgens in 15 milliliters PBS en plaats ze 15 minuten op ijs.

Dehydrateer de monsters in 15 milliliters ethanol in een reeks van toenemende concentraties. 30%50%70%85%95%en ten slotte 100%Infiltreer de monsters met 15 milliliters van een twee-op-één volume-op-volume ethanol en xyleenvervangermengsel bij kamertemperatuur. Ga door met het infiltreren door de monsters achtereenvolgens in 15 milliliters van elk van de volgende te plaatsen.

Een een-op-één volume-op-volume mengsel van ethanol en xyleenvervanger, een een-op-twee volume-op-volume mengsel van ethanol en xyleenvervanger, en ten slotte zuivere xyleenvervanger. Bewaar vervolgens de weefsels in een oven bij 60 graden Celsius. Infiltreer de monsters met 15 milliliters xyleenvervanger en paraffinemengsel bij 60 graden Celsius.

Ten slotte infiltreer paraffine in 15 millimeters van zuivere paraffine twee keer gedurende 12 uur bij 60 graden Celsius. Herhaal deze stap de volgende dag. Om met inbedden te beginnen, verwarm eerst de metalen mallen tot 62 graden Celsius en giet vervolgens ongeveer 13 milliliters gesmolten was in de malvoet.

Breng met verwarmde pincetten een weefselmonster over in de mal en oriënteer het in de gewenste positie. Verplaats de mal voorzichtig naar de koelplaat en laat het staan totdat de was is gestold. Gebruik vervolgens een scheermes om de paraffinemonsterblok in een geschikt formaat te knippen met een trapeziumvormig oppervlak aan de bovenkant.

Voeg 800 microliters optisch snijtemperatuurcompound, of OCT, toe aan het centrum van de cryostat-trap. Plaats de paraffineblok op de trap en oriënteer snel het weefselblok naar de gewenste positie. Breng het paraffineblok en de trap over naar een crystaatkamer.

Bevriest het OCT snel gedurende 10 minuten bij min 42 graden Celsius. Koel vervolgens de crystaatadapter en kamertemperatuur af tot respectievelijk min 20 graden Celsius en min 16 graden Celsius. Bevestig het blok en de trap aan de crystaatadapter.

Snijd nu de weefsels in diktes van 10 micrometer. Gebruik pincetten om de weefselsecties op te halen en plaats ze zodat ze drijven op 800 microliters DEPC-behandeld water op een poly-l-lysine gecoate glijbaan. Breng de glijbanen over naar een hotplate ingesteld op 42 graden Celsius.

Laat de secties vlakken en gebruik filterpapier om eventueel water van de randen op te nemen. Laat het monster op de hotplate staan bij 42 graden Celsius overnacht om het weefsel aan de glijbaan te laten hechten. Om de monsters te deparaffiniseren, plaats eerst de gemonteerde weefselglijbanen in een kleurraak.

Voeg 150 milliliters xyleen toe aan een kleurraak en dompel de rek van glijbanen gedurende vijf minuten onder. Hydrateer vervolgens de monsters door ze in afnemende ethanolconcentraties te plaatsen, 150 milliliters elk gedurende drie minuten tegelijk bij kamertemperatuur. Dompel tenslotte de specimens in twee keer gedistilleerd water gedurende drie minuten.

Kleur de monsters door de glijbanen in 150 milliliters hematoxylinen oplossing gedurende 1,5 minuten te plaatsen. Spoel gedurende enkele seconden in 150 milliliters twee keer gedistilleerd water met een tot twee druppels N zoutzuur, en spoel vervolgens de glijbanen kort met twee keer gedistilleerd water. Dehydrateer de monsters nogmaals met behulp van een reeks van 150 milliliters toenemende ethanolconcentraties gedurende drie minuten bij kamertemperatuur.

Dompel de specimens in 150 milliliters xyleen gedurende vijf minuten. Monteer tenslotte de monsters door voorzichtig 600 microliters xyleen-gebaseerde montagemiddel op elke glijbaan toe te voegen en vervolgens een dekglas over het specimen te plaatsen. Met behulp van deze methode werden weefselsecties van phalaenopsisorchideeën gegenereerd, inclusief de typisch moeilijk te snijden okselknop, die hoge niveaus van kristallen bevat.

Gedetalleerde structuren werden behouden, waardoor visualisatie van eiwitlichamen mogelijk was. De hybride snede produceerde ook duidelijke secties voor visualisatie van de shoot apicale meristem van het ontkiemde zaad. Deze afbeeldingen tonen de voorbereiding van transversale bladsecties van rijst- en tarweplanten met behulp van de traditionele paraffine versus hybride snijtechnieken.

Deze gewassen bevatten typisch hoge niveaus van silica