Moleculaire Diffusion in de plasmamembraan van Primary lymfocyten gemeten met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie

Het algemene doel van dit protocol is om de diffusiesnelheid van een gelabeld eiwit in membranen van primaire immuuncellen te meten met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie. Deze methode kan helpen bij het identificeren van belangrijke vragen in de immunologie en celbiologie, zoals het identificeren van natuurlijke killercellen met een actievere membraanreceptordynamiek. Het grote voordeel van deze techniek is dat het wordt gebruikt met levende cellen, dus het geeft nauwkeurig weer hoe moleculen zich in de natuurlijke staat verplaatsen.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot immunotherapie van kanker als verschillende eigenschappen van natuurlijke killercellen, zoals moleculaire diffusie, worden gekoppeld aan hun functie, kan de efficiëntie beter worden voorspeld. Hoewel deze methode inzicht kan geven in moleculaire beweging in immuuncellen, kan deze ook worden toegepast op andere primaire cellen en cellijnen in elk vakgebied. Open de software in expertmodus, met de optie Scan New Images geselecteerd.

Selecteer de 40X water objectieflens op de confocale laserscanningmicroscoop. Onder het tabblad Acquire, druk op de knoppen Config en Scan om het Configuration Control en het Scan Control te openen. Onder het tab ConfoCor, druk op Measure om het Measurement window te openen.

Maak vervolgens een map om de FCS-metingen op te slaan. Start een nieuwe afbeeldingendatabase door New te klikken onder het tabblad File. Zet de halogeenlamp aan.

Gebruik de Laser knop om de relevante lasers in te schakelen voor het exciteren van de fluoroforen. Specificeer vervolgens de instellingen voor het vastleggen van afbeeldingen in het Configuration Control-venster. Dit omvat de excitatielaser, excitatie- en emissiefilters, lichtbaan en detectoren in gebruik.

Ga op dezelfde manier naar het Measurement window en pas de FCS-instellingen aan onder het tabblad System Configuration. Activeer de detectiekanalen voor de FCS-opnamen door Ch 1 voor het groene kanaal en Ch 2 voor het rode kanaal te selecteren. Terwijl de laser stabiliseert, wat tot 30 minuten kan duren, pas de pinhole aan.

Plaats eerst een druppel van 50 microliter kleurstof centraal in één put van een achtputten kamerdeklaagjesslide gecoat met poly-L-lysine. De aangrenzende putten worden gebruikt om celmetingen te doen, omdat de kalibratie afhankelijk is van de slide. Doe een druppel gedistilleerd water op de 40X water objectieflens en plaats de slide.

Druk vervolgens op Vis om de zichtbare lichtbron te selecteren en focus op de centrale positie van de fluorofore druppel. Selecteer in het Measurement window van de software het tabblad Acquisition en onder Positions, schakel de huidige positie. Keer vervolgens terug naar het tabblad System Configuration in hetzelfde venster en stel een hoge of verzadigde kracht in voor de groene laser.

Om de stabiliteit van het signaal te testen, druk op Start om een nieuw venster te openen met de Time trace en Auto correlatiecurve. Controleer of het fluorescente signaal hoog, stabiel is en of de y-as fluctuatie in het kilohertzbereik laat zien. Lagere waarden kunnen te wijten zijn aan onnauwkeurig focussen of kleurstoffenverval.

Selecteer vervolgens in het Measurement window de knop O Adjust. Selecteer vervolgens het juiste detectiekanaal en druk op Auto Adjust X. Als de bovengrens van de resulterende curve ontbreekt of niet gecentreerd is, markeer de optie Coarse en druk opnieuw op Auto Adjust X. Nadat de X-richting is aangepast, doe hetzelfde voor de Y-richting door op Auto Adjust Y te drukken. Schakel Coarse uit en wissel af tussen het aanpassen van X en Y door op Auto Adjust te drukken totdat beide duidelijke maxima en stabiele waarden hebben.

Als de cellen zijn gelabeld door twee verschillende fluoroforen, voeg dan een druppel oplossing van rood fluorofore toe aan een aangrenzende kamer. Kalibreer vervolgens het tweede kanaal. Stel de rode laser op een hoge kracht en herhaal de stabiliteitskalibratieprocedure.

Vervolgens meten we de doorlaattijd van vrij diffunderende fluoroforen door de focus heen. En we gebruiken de fase om vervolgens het gebied van de celmembraan te berekenen dat zich binnen de focus bevindt. Om te beginnen, focus op een druppel oplossing door voorzichtig de aanpassingsprocedure uit te voeren.

Ga vervolgens naar het tabblad Acquisition in het Measurement window en stel de acquisitietijd in op 30 seconden met drie herhalingen. Stel de laserkracht bijna verzadigd in en druk op Start om een meting te starten. Noteer de tellen per molecuul of CPM nadat de meting voltooid is.

Neem vervolgens nieuwe metingen door iteratieve reducties van de laserkracht te maken. Omvat deze krachtbereik de verwachte kracht van de komende celmetingen. Controleer vervolgens of de CPM-waarden lineair schalen met de laserkracht.

Op voorwaarde dat de rest van de schaal lineair is, is verzadiging bij de hoogste kracht acceptabel. De eerste keer dat een nieuw geconjugeerd fluorescerend antilichaam wordt gebruikt, voer een FCS-meting uit van vrij diffunderende antilichamen om de verwachte CPM te kwantificeren. En het is belangrijk om putten gecoat met PEG Poly-L-Lysine te gebruiken voor vrije antilichamen.

Voor deze procedure bekleed een kamerdeklaagjesslide met 200 microliter Poly-L-Lysine gegraft op polyethyleenglycol. Laat de oplossing een uur bij kamertemperatuur hechten. De stockoplossing kan tot twee weken in de koelkast worden bewaard.

En de poedervoorraad moet in de vriezer worden bewaard. Verwijder later de vloeistof en laat de kamer aan de lucht drogen. Verdun bij de microscoop het antilichaam in PBS tot tussen de een en 10 microgram per milliliter.

Ga verder met het meten van de doorlaattijd van vrije antilichamen zoals beschreven in het vorige gedeelte voor vrije fluoroforen. Om een meting in een cel te doen, voeg 125 microliter cellen in PBS plus 1%FCS van de antilichaam-gelabelde celsuspensie toe. En 150 microliters transparant Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 in een lege put in de PLL-gecoate glazen slide.

Laat de cellen in het donker incuberen bij de meettemperatuur gedurende minimaal 20 minuten voordat u verder gaat, zodat de cellen zich kunnen hechten en in evenwicht komen. Begin met beeldvorming met snelle XY-scans om de laagst mogelijke laserkracht te vinden die nodig is om de cellen te bekijken. Centreer vervolgens het beeld