Name: Moleculaire Diffusion in de plasmamembraan van Primary lymfocyten gemeten met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Leer hoe je moleculaire diffusie meet in plasmamembranen van primaire lymfocyten met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie. Deze techniek biedt inzicht in membraanreceptordynamica voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Vladana Vukojević, Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet voor het onderhoud van de Zeiss Confocor 3 instrument en handige tips met betrekking tot mobiele metingen. Deze studie werd gefinancierd door subsidies van Vetenskapsrådet (subsidie ​​nummer 2012- 1629), Magnus Bergvalls Stiftelse, en vanuit Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.

<ol><li>Goni, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+structure+and+dynamics+of+cell+membranes%3A+an+update+of+the+Singer-Nicolson+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The basic structure and dynamics of cell membranes: an update of the Singer-Nicolson model.</a> Biochim Biophys Acta. 1838, 1467-1476 (2014).</li>
<li>Bagawath-Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+Induce+Faster+Membrane+Diffusion+of+MHC+Class+I+and+the+Ly49A+Receptor+in+a+Subpopulation+of+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytokines Induce Faster Membrane Diffusion of MHC Class I and the Ly49A Receptor in a Subpopulation of Natural Killer Cells.</a> Front Immunol. 7, (2016).</li>
<li>Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+for+the+study+of+membrane+dynamics+and+protein%2Flipid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy for the study of membrane dynamics and protein/lipid interactions.</a> Methods. 46, 116-122 (2008).</li>
<li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588, 3571-3584 (2014).</li>
<li>Mutze, J., Ohrt, T., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/lpor.200910041/abstract">Fluorescence correlation spectroscopy in vivo.</a> Laser Photon Rev. 5, 52-67 (2011).</li>
<li>Lidke, D. S., Wilson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caught+in+the+act%3A+quantifying+protein+behaviour+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caught in the act: quantifying protein behaviour in living cells.</a> Trends Cell Biol. 19, 566-574 (2009).</li>
<li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+progress+in+single+particle+tracking%3A+from+methods+to+biophysical+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Rep+Prog+Phys%22%5BJournal%5D)">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Rep Prog Phys. 78, 124601(2015).</li>
<li>Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+correlation+spectroscopy%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Image correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 336-348 (2015).</li>
<li>Sankaran, J., Shi, X., Ho, L. Y., Stelzer, E. H., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImFCS%3A+a+software+for+imaging+FCS+data+analysis+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">ImFCS: a software for imaging FCS data analysis and visualization.</a> Opt Express. 18, 25468-25481 (2010).</li>
<li>Liu, P., Ahmed, S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+F-techniques%3A+advances+in+receptor+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">The F-techniques: advances in receptor protein studies.</a> Trends Endocrinol Metab. 19, 181-190 (2008).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 709-725 (2014).</li>
<li>Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+novel+variations+of+an+established+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, 151-169 (2007).</li>
<li>Widengren, J., Thyberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FCS+cell+surface+measurements--photophysical+limitations+and+consequences+on+molecular+ensembles+with+heterogenic+mobilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">FCS cell surface measurements--photophysical limitations and consequences on molecular ensembles with heterogenic mobilities.</a> Cytometry A. 68, 101-112 (2005).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172, 9-18 (2006).</li>
<li>Meinhardt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+NK+cell+magnetic+bead+isolation+methods+on+phenotype+and+function+of+murine+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Influence of NK cell magnetic bead isolation methods on phenotype and function of murine NK cells.</a> J Immunol Methods. 378, 1-10 (2012).</li>
<li>Bacia, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+guidelines+for+dual-color+fluorescence+cross-correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy.</a> Nat Protoc. 2, 2842-2856 (2007).</li>
<li>Gendron, P. O., Avaltroni, F., Wilkinson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+coefficients+of+several+rhodamine+derivatives+as+determined+by+pulsed+field+gradient-nuclear+magnetic+resonance+and+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient-nuclear magnetic resonance and fluorescence correlation spectroscopy.</a> J Fluoresc. 18, 1093-1101 (2008).</li>
<li>Petrasek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+measurement+of+diffusion+coefficients+using+scanning+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys J. 94, 1437-1448 (2008).</li>
<li>Stromqvist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+FCCS+procedure+applied+to+Ly49A-MHC+class+I+cis-interaction+studies+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A modified FCCS procedure applied to Ly49A-MHC class I cis-interaction studies in cell membranes.</a> Biophys J. 101, 1257-1269 (2011).</li>
<li>Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/j100036a009">Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution - a Theoretical and Experimental-Study.</a> J Phys Chem. 99, 13368-13379 (1995).</li>
<li>Humpolickova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+diffusion+laws+within+cellular+membranes+by+Z-scan+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys J. 91, L23-L25 (2006).</li>
<li>Guo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+approach+to+the+analysis+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+data+II%3A+application+to+simulated+and+in+vitro+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Bayesian approach to the analysis of fluorescence correlation spectroscopy data II: application to simulated and in vitro data.</a> Anal Chem. 84, 3880-3888 (2012).</li>
<li>Ries, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+suppression+of+sample-related+artifacts+in+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> Opt Express. 18, 11073-11082 (2010).</li>
<li>Chiu, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+kinetics+of+the+androgen+receptor+shown+by+multimodal+Image+Correlation+Spectroscopy+%28mICS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intracellular kinetics of the androgen receptor shown by multimodal Image Correlation Spectroscopy (mICS).</a> Sci Rep. 6, 22435(2016).</li>
<li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Sci Rep. 6, 27290(2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol FCS kan worden gebruikt voor de beoordeling van de moleculaire dynamica van oppervlaktemoleculen op alle soorten immuuncellen (muizen, mensen of andere soorten). FCS maatregelen tijdruimtelijke moleculaire dynamica omlaag naar single-molecule resolutie in levende cellen. De moleculaire dichtheid, evenals de diffusiesnelheid en clustering dynamiek van de eiwitten van belang, kan worden gewonnen uit de autocorrelatie krommen. De fluorescerende labeling is van cruciaal belang voor ...

Veel immuuncellen functies afhankelijk moleculaire diffusie en interacties binnen membranen. Biologische membranen zijn complex en vele factoren die belangrijk zijn voor de functie van immune cellen kan de snelheid van translationele diffusie van eiwitten beïnvloeden binnen celmembranen 1 kan zijn. We hebben onlangs aangetoond dat natuurlijke killer (NK) cellen, lymfocyten behoren tot het aangeboren immuunsysteem vertonen differentiële diffusie van twee onderzochte eiwitten op de celmembraan afhankelijk van de toestand van NK-celactivering 2. Fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) is een techniek die in staat kwantificeren moleculaire diffusiesnelheid in biologische membranen. Rapporteert de gemiddelde diffusiesnelheid van fluorescent gelabelde moleculen in een vast volume, meestal de focus van een confocale microscoop. Het is gebaseerd op de meting van de fluctuaties in fluorescentie die optreden bij moleculaire beweging ineen systeem in stabiele toestand. FCS is op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van de diffusie van fluorescerende kleurstoffen en proteïnen, zowel in oplossing als in lipide membranen. Andere uitvoerparameters die de diffusiesnelheid kan ook indirect worden bestudeerd op deze manier (bijvoorbeeld conformationele veranderingen in eiwitten of interacties van moleculen over celmembranen) 3, 4. FCS onderscheidt zich in vergelijking met andere technieken vanwege de hoge gevoeligheid, waardoor de mogelijkheid van één molecuul detectie. Het werkt goed voor moleculaire concentraties in het nanomolair tot millimolair bereik, die typisch is voor endogene expressieniveaus van de meeste eiwitten 5. Bovendien kan FCS een benadering van het absolute aantal eiwitten in de bestudeerde volume te geven, terwijl de meeste andere technieken alleen relatieve informatie over eiwit expressie levels geven. Andere methoden om moleculaire diffusie tarieven te meten binnen membranen omvatten fluocerend herstel na fotobleken (FRAP), enkel deeltje tracking (SPT), meervoudige pinhole FCS en beeldcorrelatie methoden. FRAP en beeldcorrelatie methoden zijn ensemble technieken, die over het algemeen geen informatie over het absolute aantal moleculen 10 te geven. Vergeleken met SPT, de doorvoer van FCS hoger met betrekking tot karakterisering van de gemiddelde bevolking. De analyse is ook minder veeleisend aangezien de gemiddelde diffusiesnelheid van de aanwezigheid in het laserfocus moleculen wordt gemeten in plaats van de snelheid van enkele moleculen. Ook, tenzij gespecialiseerde microscopen zijn verkrijgbaar 11, SPT kan geen informatie over de concentratie te geven, omdat standaard SPT etikettering zeer laag mogelijk te maken voor de identificatie van enkele moleculen moet zijn. Anderzijds, FCS vereist de moleculen onder studie mobiel. Het zal gewoon niet vermeende immobiele fracties of moleculen bewegen heel langzaam op te sporen. De diffusiesnelheid van moleculen dieverblijf op de focus langer dan ongeveer een tiende van de overname tijd zal niet correct worden weergegeven in FCS metingen 3, 12. Daarom diffusiecoëfficiënten opgenomen door FCS meestal sneller dan diffusiesnelheden gerapporteerd door technieken zoals FRAP en SPT, waarbij de nagenoeg in immobiele en zeer traag fracties rekening mee gehouden worden. SPT zal ook een meer gedetailleerde beschrijving van de variabiliteit van de diffusie-tarieven binnen de moleculaire bevolking dan FCS wil. FCS kwantificeert de fluctuatie van fluorescentie-intensiteit in de tijd binnen de opgewonden volume. Bij membraan metingen, vertaalt het verlichte oppervlak van het membraan. In deze paper, maken we gebruik van het feit dat dergelijke fluctuaties worden veroorzaakt door moleculen vertonen Brownse diffusie en zijn dus bewegen in en uit de excitatie volume. Er zijn ook verschillende andere mogelijke bronnen voor de schommelingenties in het fluorescentiesignaal, zoals knipperen of de aanwezigheid van een triplet toestand in de fluoroforen, milieueffecten binding-ontbinding van ligand, of beweging van het gehele celmembraan. Deze vermeende foutbronnen rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van een FCS experiment om de resultaten 12, 13 te interpreteren. Typisch, laterale diffusie tarieven in biologische membranen zijn laag als gevolg van verdringing en interacties, zowel tussen membraaneiwitten en tussen eiwitten en het cytoskelet. Historisch gezien is de toepassing van FCS in membranen is dus belemmerd door het gebrek aan foto-stabiele fluoroforen, die nodig zijn om het bleken tijdens de verlengde looptijden door het excitatie brandpunt 14 te voorkomen. Echter, vandaag, zijn er tal van mogelijkheden voor geschikte foto-stabiele kleurstoffen. Significante verbeteringen in detectoren en andere hardware ook toestaan ​​dat de detectie van fluorescerende proteins en kleurstoffen van lagere helderheid. Hier, een basisprotocol voor de toepassing van FCS met knaagdiermodellen primaire lymfocyten, waarbij het eiwit van belang wordt gemerkt met een fluorescent gelabeld antilichaam, beschreven. Een benadering van de autocorrelatie krommen teneinde de diffusiecoëfficiënt en de moleculaire dichtheid extraheren passen wordt ook getoond. Het protocol is gericht op het wordt gemakkelijk gevolgd door immunologen zonder eerdere ervaring van technieken om de verspreiding van moleculen te bestuderen. Er is echter een basiskennis van confocale microscopie verwacht (om deze basiskennis te krijgen, zie referentie 15). Dit protocol kan betrekkelijk gemakkelijk worden aangepast aan andere suspensiecellen, beide cellijnen en primaire cellen. Voor gevorderde gebruikers FCS, meer verfijnde analyse methoden bestaan, waarvan sommige worden beschreven in de bespreking.

<table><tbody><tr><td>MACS NK Cell Isolation Kit mouse II</td><td>Miltenyi Biotec NordenAB</td><td>130-096-892</td><td>Negatieve selectie van NK-cellen</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>F7524</td><td>Verhit in geïnactiveerde</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>-</td><td>-</td><td>Zelf gemaakt&nbsp;</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medium 1640</td><td>PAA The Cell Culture Company&nbsp;</td><td>E15-848</td><td>Transparant medium</td></tr><tr><td>Antibody clone 2.4G2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>553140</td><td>Voor het blokkeren van Fc-receptoren.</td></tr><tr><td>Anti-Ly49A antilichaam&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Monoklonaal antilichaam gemaakt in huis en geconjugeerd in huis aan Alexa fluor 647</td></tr><tr><td>Clone JR9.318</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-H-2Dd antilichaam&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>558915</td><td>Geconjugeerd in huis aan MFP488</td></tr><tr><td>Clone 34.5.8S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP488</td><td>Mobiotech</td><td>MFP-A2181</td><td>Fluorescente kleurstof voor antilichaam conjugatie.</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Verdund in gedistilleerd water (1.10)</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine (20 kDa) gegraft met polyethyleenglycol (2 kDa)</td><td>SuSoS AG</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)</td><td>Verdund in PBS (pH 7.4) tot 0,5 mg/ml.</td></tr><tr><td>Rhodamine 110 chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>432202</td><td>Bekende diffusiecoefficient: 3,3 &times; 10&minus;10 m2/sec 19</td></tr><tr><td>Alexa fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A20006</td><td>Bekende diffusiecoefficient: 4,4 &times; 10&minus;10 m2/sec 20</td></tr><tr><td>Confocale microscoop&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>Software: Confocor 3</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software: Matlab met curve fitting toolbox</td><td>Matlab</td><td>Versie R2013b</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Thermo-scientific&nbsp;</td><td>155411</td><td>8 putjes, 1,0 borosilicaatbodem</td></tr></tbody></table>

moleculaire diffusion in de plasmamembraan van primary lymfocyten gemeten met behulp van fluorescentie correlatie spectroscopie

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) is een krachtige techniek voor het bestuderen van diffusie van moleculen in biologische membranen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. FCS kan de moleculaire concentratie en diffusiecoëfficiënt van fluorescent gelabelde moleculen te kwantificeren in het celmembraan. Deze techniek heeft het vermogen om de moleculaire diffusie eigenschappen van moleculen in het plasmamembraan van immuuncellen in normaal staand (dus zonder processen die het resultaat tijdens het werkelijke meettijd). FCS is geschikt voor het bestuderen van de diffusie van eiwitten die tot expressie op niveaus kenmerkend voor de meeste endogene eiwitten. Hier, wordt een eenvoudige en robuuste methode om de diffusiesnelheid van celmembraaneiwitten op primaire lymfocyten bepalen aangetoond. Een effectieve manier om metingen aan antilichaam-gekleurde levende cellen en veel voorkomende waarnemingen na de overname uitvoeren, worden beschreven. De recente ontwikkelingenin de ontwikkeling van stabiele foto-fluorescerende kleurstoffen kunnen worden gebruikt door het conjugeren van het antilichamen van belang kleurstoffen die niet uitgebreid hebben bleken tijdens de metingen bestemmen. Bovendien maakt dit de detectie van langzaam diffunderende entiteiten die een gemeenschappelijk kenmerk eiwitten aanwezig in celmembranen. De analyse procedure om de concentratie en verspreiding parameters moleculaire extraheren uit de gegenereerde autocorrelatie bochten is gemarkeerd. Samengevat wordt een basisprotocol FCS metingen ontvangen; Het zal door immunologen met verstand van confocale microscopie doch zonder andere ervaring van technieken voor het meten van de dynamische parameters, zoals moleculaire diffusiesnelheid.

Een typisch resultaat wordt een autocorrelatie curve met een looptijd in het traject van 10 msec tot 400 msec voor membraaneiwitten genereren. Het aantal moleculen kan variëren van 0,5 tot ongeveer 200 urn per 2 voor endogeen tot expressie gebrachte eiwitten. Controleer zorgvuldig of de CPM is niet lager dan verwacht. Dit kan betekenen dat er een invloed van het achtergrondsignaal. Als een vuistregel dient de CPM signaal op cellen die wordt geaccepteerd voor analyse niet minde...

Een methode om eiwitdiffusie in membranen van primaire immuuncellen te meten met behulp van fluorescentie correlatiespectroscopie (FCS) wordt beschreven. In dit artikel wordt het gebruik van antilichamen voor fluorescentielabeling geïllustreerd.

Moleculaire Diffusion in de plasmamembraan van Primary lymfocyten gemeten met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Het algemene doel van dit protocol is om de diffusiesnelheid van een gelabeld eiwit in membranen van primaire immuuncellen te meten met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie. Deze methode kan helpen bij het identificeren van belangrijke vragen in de immunologie en celbiologie, zoals het identificeren van natuurlijke killercellen met een actievere membraanreceptordynamiek. Het grote voordeel van deze techniek is dat het wordt gebruikt met levende cellen, dus het geeft nauwkeurig weer hoe moleculen zich in de natuurlijke staat verplaatsen.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot immunotherapie van kanker als verschillende eigenschappen van natuurlijke killercellen, zoals moleculaire diffusie, worden gekoppeld aan hun functie, kan de efficiëntie beter worden voorspeld. Hoewel deze methode inzicht kan geven in moleculaire beweging in immuuncellen, kan deze ook worden toegepast op andere primaire cellen en cellijnen in elk vakgebied. Open de software in expertmodus, met de optie Scan New Images geselecteerd.Selecteer de 40X water objectieflens op de confocale laserscanningmicroscoop. Onder het tabblad Acquire, druk op de knoppen Config en Scan om het Configuration Control en het Scan Control te openen. Onder het tab ConfoCor, druk op Measure om het Measurement window te openen.Maak vervolgens een map om de FCS-metingen op te slaan. Start een nieuwe afbeeldingendatabase door New te klikken onder het tabblad File. Zet de halogeenlamp aan.Gebruik de Laser knop om de relevante lasers in te schakelen voor het exciteren van de fluoroforen. Specificeer vervolgens de instellingen voor het vastleggen van afbeeldingen in het Configuration Control-venster. Dit omvat de excitatielaser, excitatie- en emissiefilters, lichtbaan en detectoren in gebruik.Ga op dezelfde manier naar het Measurement window en pas de FCS-instellingen aan onder het tabblad System Configuration. Activeer de detectiekanalen voor de FCS-opnamen door Ch 1 voor het groene kanaal en Ch 2 voor het rode kanaal te selecteren. Terwijl de laser stabiliseert, wat tot 30 minuten kan duren, pas de pinhole aan.Plaats eerst een druppel van 50 microliter kleurstof centraal in één put van een achtputten kamerdeklaagjesslide gecoat met poly-L-lysine. De aangrenzende putten worden gebruikt om celmetingen te doen, omdat de kalibratie afhankelijk is van de slide. Doe een druppel gedistilleerd water op de 40X water objectieflens en plaats de slide.Druk vervolgens op Vis om de zichtbare lichtbron te selecteren en focus op de centrale positie van de fluorofore druppel. Selecteer in het Measurement window van de software het tabblad Acquisition en onder Positions, schakel de huidige positie. Keer vervolgens terug naar het tabblad System Configuration in hetzelfde venster en stel een hoge of verzadigde kracht in voor de groene laser.Om de stabiliteit van het signaal te testen, druk op Start om een nieuw venster te openen met de Time trace en Auto correlatiecurve. Controleer of het fluorescente signaal hoog, stabiel is en of de y-as fluctuatie in het kilohertzbereik laat zien. Lagere waarden kunnen te wijten zijn aan onnauwkeurig focussen of kleurstoffenverval.Selecteer vervolgens in het Measurement window de knop O Adjust. Selecteer vervolgens het juiste detectiekanaal en druk op Auto Adjust X. Als de bovengrens van de resulterende curve ontbreekt of niet gecentreerd is, markeer de optie Coarse en druk opnieuw op Auto Adjust X. Nadat de X-richting is aangepast, doe hetzelfde voor de Y-richting door op Auto Adjust Y te drukken. Schakel Coarse uit en wissel af tussen het aanpassen van X en Y door op Auto Adjust te drukken totdat beide duidelijke maxima en stabiele waarden hebben.Als de cellen zijn gelabeld door twee verschillende fluoroforen, voeg dan een druppel oplossing van rood fluorofore toe aan een aangrenzende kamer. Kalibreer vervolgens het tweede kanaal. Stel de rode laser op een hoge kracht en herhaal de stabiliteitskalibratieprocedure.Vervolgens meten we de doorlaattijd van vrij diffunderende fluoroforen door de focus heen. En we gebruiken de fase om vervolgens het gebied van de celmembraan te berekenen dat zich binnen de focus bevindt. Om te beginnen, focus op een druppel oplossing door voorzichtig de aanpassingsprocedure uit te voeren.Ga vervolgens naar het tabblad Acquisition in het Measurement window en stel de acquisitietijd in op 30 seconden met drie herhalingen. Stel de laserkracht bijna verzadigd in en druk op Start om een meting te starten. Noteer de tellen per molecuul of CPM nadat de meting voltooid is.Neem vervolgens nieuwe metingen door iteratieve reducties van de laserkracht te maken. Omvat deze krachtbereik de verwachte kracht van de komende celmetingen. Controleer vervolgens of de CPM-waarden lineair schalen met de laserkracht.Op voorwaarde dat de rest van de schaal lineair is, is verzadiging bij de hoogste kracht acceptabel. De eerste keer dat een nieuw geconjugeerd fluorescerend antilichaam wordt gebruikt, voer een FCS-meting uit van vrij diffunderende antilichamen om de verwachte CPM te kwantificeren. En het is belangrijk om putten gecoat met PEG Poly-L-Lysine te gebruiken voor vrije antilichamen.Voor deze procedure bekleed een kamerdeklaagjesslide met 200 microliter Poly-L-Lysine gegraft op polyethyleenglycol. Laat de oplossing een uur bij kamertemperatuur hechten. De stockoplossing kan tot twee weken in de koelkast worden bewaard.En de poedervoorraad moet in de vriezer worden bewaard. Verwijder later de vloeistof en laat de kamer aan de lucht drogen. Verdun bij de microscoop het antilichaam in PBS tot tussen de een en 10 microgram per milliliter.Ga verder met het meten van de doorlaattijd van vrije antilichamen zoals beschreven in het vorige gedeelte voor vrije fluoroforen. Om een meting in een cel te doen, voeg 125 microliter cellen in PBS plus 1%FCS van de antilichaam-gelabelde celsuspensie toe. En 150 microliters transparant Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 in een lege put in de PLL-gecoate glazen slide.Laat de cellen in het donker incuberen bij de meettemperatuur gedurende minimaal 20 minuten voordat u verder gaat, zodat de cellen zich kunnen hechten en in evenwicht komen. Begin met beeldvorming met snelle XY-scans om de laagst mogelijke laserkracht te vinden die nodig is om de cellen te bekijken. Centreer vervolgens het beeld

molecular-diffusion-plasma-membranes-primary-lymphocytes-measured

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een techniek om de lipid raft verdeling van fluorescerende eiwitten in de plasmamembraan van levende cellen sonde wordt beschreven. Het maakt gebruik van de verschillen in verspreiding tijden van eiwitten die gelegen zijn binnen of buiten van lipide rafts. Overname kan dynamisch worden uitgevoerd in controle omstandigheden of na drugsverslaving.

Bepaling van de lipid raft van afscherming van fluorescent-gelabelde probes in levende cellen met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie (FCS)

This video demonstrates the use of fluorescence fluctuation spectroscopy to detect the interaction among cell surface proteins at cell-cell contacts. By expressing the transmembrane adhesion receptor of interest labeled with a fluorescent protein and mixing two different cell populations harboring two spectrally separated fluorescent labels, the trans-interaction between the receptors of two neighboring cells with different-colored fluorescence is assessed via cross-correlation in the...

Fluorescence Fluctuation Spectroscopy to Study Protein Interaction at Cell Contacts

Dit artikel geeft een stap voor stap handleiding om de fluctuatie analysetechniek k-Ruimte Beeld Correlatie Spectroscopie (KIG's) voor het meten van diffusiecoëfficiënten van fluorescent gelabelde plasmamembraan eiwitten in levende cellen van zoogdieren.

Gemakkelijk Meting van diffusiecoëfficiënten van EGFP-gelabeld plasmamembraaneiwitten gebruik van K-Space Beeld Correlatie Spectroscopie

Ruimtelijke verdeling en temporele dynamica van plasmamembraaneiwitten en lipiden is een populair onderwerp in de biologie. Hier wordt dit probleem aangepakt door een ruimte-tijdelijke beeldfluctuatieanalyse die conceptueel dezelfde fysische grootheden levert als enkeldeeltjevolgen, maar gebruik maakt van kleine moleculaire labels en standaard microscoopopstellingen.

Van Fast Fluorescentie Imaging om moleculaire diffusie wet op de Live-celmembranen in een Commercial Microscoop

We presenteren een nieuwe techniek om de laterale diffusie van een oppervlakteactieve soort op het vloeistof-vloeistof grensvlak te meten door een druppel monolaag samen te voegen met een platte monolaag.

Fluorescentie herstel na het samenvoegen van een druppel op de twee-dimensionale Verspreiding van een Phospholipid monolaag Meet

Dit protocol beschrijft een fluorescentie schommelingen spectroscopie gebaseerde aanpak om te onderzoeken van interacties tussen eiwitten bemiddelen cel interacties, d.w.z. eiwitten gelokaliseerd in cel kruispunten, rechtstreeks in levende cellen. Wij bieden gedetailleerde richtsnoeren op kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analysemethoden, inclusief correcties mogelijk artefact bronnen.

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

Hier presenteren we een protocol voor één deeltje beeldanalyse waarmee kwantitatieve evaluatie van diffusie coëfficiënten, soorten van beweging en cluster grootte van enkele deeltjes ontdekt door fluorescentie microscopie bijhouden.

Beeldverwerking Protocol voor de analyse van de verspreiding en de clustergrootte van membraan receptoren door fluorescentie microscopie

Dit artikel is bedoeld om een protocol te presenteren over het bouwen van een spotvariatie Fluorescentie Correlatie Spectroscopie (svFCS) microscoop om moleculaire diffusie te meten op het plasmamembraan van levende cellen.

Spotvariatie fluorescentie correlatiespectroscopie voor analyse van moleculaire diffusie op het plasmamembraan van levende cellen

We presenteren een experimenteel protocol en data-analyseworkflow om live cell dual-color fluorescentie cross correlation spectroscopie (FCCS) uit te voeren in combinatie met Förster Resonance Energy transfer (FRET) om membraanreceptordynamica in levende cellen te bestuderen met behulp van moderne fluorescentielabeltechnieken.

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

Cel-gemedieerde lymphocytotoxicity (CML) testen kunnen worden gebruikt voor het autoreactieve reacties en onderzoek naar mechanismen van celdood in vitro test. Echter, met behulp van live-cell confocale microscopische beeldvorming technieken met fluorescente kleurstoffen, het type en de kinetiek van celdood en gebruik gemaakt van de paden worden bestudeerd in meer detail.

Methoden om Beta Cell Death gemedieerd beoordelen door cytotoxische T lymfocyten

Leer hoe je moleculaire diffusie meet in plasmamembranen van primaire lymfocyten met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie. Deze techniek biedt inzicht in membraanreceptordynamica voor immunologisch onderzoek.

Moleculaire Diffusion in de plasmamembraan van Primary lymfocyten gemeten met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie

Meer video's verkennen