Zika Virus Besmettelijke celcultuur en de

Het algemene doel van deze studie is het opzetten van een in vitro infectieuze kweekmethode voor het Zikavirus op basis van zoogdiercellen om de replicatie van het Zikavirus te bestuderen, evenals het gebruik van dit in vitro platform voor de ontwikkeling van geneesmiddelen. Dit gedetailleerde stapsgewijze protocol voor het infectieuze celkweeksyteem van het Zikavirus kan helpen bij het ontrafelen van het mechanisme achter de door het Zikavirus gemedieerde ziektepathogenese en de evolutie van de virale virulentie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het grootschalige productie van het Zikavirus mogelijk maakt voor de ontwikkeling van medicijnen en vaccins.

Begin met het oogsten van Vero-cellen bij een celldichtheid van 80% in een T75-kweekfles door het medium uit de fles te aspireren en de cellen te spoelen met twee milliliter fosfaatgebufferde zoutoplossing. Voeg twee milliliter 0,25% trypsine toe en incubeer de fles bij 37 °C gedurende vijf minuten. Voeg na de incubatie acht milliliter groeimedium met serum toe om de trypsine te inactiveren. Draag de cellen vervolgens over naar een buis van 15 milliliter. Neem daarna 10 µL cellen af en meng deze met een gelijke hoeveelheid 0,4% trypanblauw. Breng het voorbereide mengsel aan op de telkamerdia en bepaal het aantal levensvatbare cellen met een automatische celteller. Zaai in totaal zeven miljoen cellen in een T160-fles in een volume van 30 milliliter. Bereid de volgende dag een passend inoculum van het zikavirus met de juiste multipliciteit van infectie in 10 milliliter serumvrij kweekmedium per fles.

Veilige omgang met het virus is essentieel om de verspreiding van de infectie te voorkomen.

Verwijder het gebruikte medium uit de T160-fles en voeg vervolgens de volledige 10 milliliters vers bereid viraal inoculum toe. Incubeer de geïnoculeerde flessen bij 37 degrees Celsius met 5%CO2 gedurende vier tot zes uur. Verspreid het inoculum door de fles elk uur tijdens de incubatie voorzichtig zijwaarts te kantelen. Vervang na voltooiing van de incubatie het inoculum door 30 milliliters warm, met serum aangevuld groeimedium. Zet vervolgens de virale cultuur voort voor de volgende 96 uur. Verifieer na vier dagen de voortgang van de infectie door met een fasecontrastmicroscoop het verschijnen van virale plaques op de cellaag te observeren. Maak indien nodig afbeeldingen bij een vergroting van 40x en 200x.

Oogst de supernatanten van de celcultuur op het tijdstip van 96 uur en centrifugeer de supernatant bij 300 ×g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius om celresten te verwijderen. Verwijder na centrifugatie voorzichtig de supernatanten zonder het gepelletteerde debris te verstoren en breng deze over in buisjes van 15 milliliters.

Bewaar de supernatanten van de virale cultuur in meerdere aliquoten bij -80 °C.

Om het virus te titeren, worden eerst naïeve Vero-cellen in een 12-wells plaat gezaaid met een dichtheid van 1 × 10⁵ cellen per well, in een volume van 2 mL. De volgende dag worden tienvoudige seriële verdunningen gemaakt van de viral culture supernatants, die met serumvrij medium uit de T160-fles zijn verzameld.

Zorg bij het bereiden van seriële verdunningen van viraal cultuursupernatans voor titerbepalingen dat het virus veilig wordt gehanteerd om infectie te voorkomen.

Verwijder vervolgens het verbruikte medium uit elke put van de 12-wellplaat met Vero-cellen en voeg 400 µL van het verdunde inoculum in triplo toe aan de Vero-cellen. Incubeer de geïnoculeerde platen gedurende vier tot zes uur in de weefselkweekincubator.

Vervang aan het einde van de incubatie het inoculum door twee milliliters medium aangevuld met serum per well. Tel 48 uur na inoculatie de virale foci bij de juiste verdunningen met behulp van een fasecontrastmicroscoop. Bereken de virale titer als plaque-vormende eenheden per milliliter.

Na het inoculeren van Vero-cellen in een 12-well plaat met hoge en lage titers van het Zikavirus, en een incubatie van 48 en 96 uur, wordt de genoomreplicatie beoordeeld via kwantitatieve PCR voor de expressie van het Zikavirusgenoom, en via immunocytochemie voor dubbelstrengs RNA.

Voor immunocytochemie verwijdert u het medium uit de wells van de 12-well plaat en voegt u één milliliter methanol toe aan elke well. Laat de cellen fixeren bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Was vervolgens de gefixeerde cellen drie keer met 1x PBS. Voeg daarna blokkeringsbuffer toe en incubeer dit gedurende één uur bij kamertemperatuur. Verdun de muis monoklonale anti-dubbelstrengs RNA-antilichaam J2 1:100 in blokkeringsbuffer, voeg dit toe aan de cellen en incubeer de cellen in deze oplossing overnacht bij vier graden Celsius. Verdun de volgende dag het geiten anti-muis IgG-594 secundaire antilichaam 1:1.000 in blokkeringsbuffer; voeg dit na het wassen van de cellen met 1x PBS toe aan de cellen en incubeer deze gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was de cellen vervolgens met 1x PBS, kleur de celkernen met Hoechst-kleurstof en observeer de cellen met een fluorescentiemicroscoop bij een 100x vergroting.

Zes uur na het uitplaten van naïeve Vero-cellen in een plaat met 12 putjes, zoals voorheen, worden de gewenste cytokinen in de aangegeven concentraties in biologische duplicaten toegevoegd. 12 uur na de behandeling wordt infectie met het Zika-virus uitgevoerd, waarbij putjes zonder infectie als negatieve controles dienen. Vier uur na de infectie wordt het virale inoculum vervangen door medium dat met cytokinen is behandeld, waarna de cellen nog 44 uur lang worden geïncubeerd bij 37 °C. 48 uur na de infectie worden de virale plaques geteld met behulp van een fasecontrastmicroscoop en worden representatieve afbeeldingen van geïnfecteerde cellen gemaakt bij een 40x vergroting.

Deze grafiek toont het genomische gehalte van het Zika-virus gemeten via RT-qPCR. Zowel de Pan-genotype- als de PRVABC-59-stamprimers vertoonden een gelijke sensitiviteit en specificiteit. Zoals verwacht amplificeerden de hepatitis-C-virusprimers geen enkel product.

Hier worden de groeikinetieken van het Zika-virus op de aangegeven tijdstippen getoond in cellen geïnfecteerd met lage en hoge titers, vergeleken met die van de niet-geïnfecteerde mock-controle. Resultaten van de immunocytochemische assay laten zien dat de geïnfecteerde cellen 48 uur na infectie in een paar clusters voorkomen, terwijl na 96 uur na infectie de meeste cellen geïnfecteerd zijn. Deze grafiek toont de modulatie van de Zika-virale groei door verschillende cytokinen, vergeleken met die van de vehicle-controle.

Deze fasecontrastbeelden tonen met het Zikavirus geïnfecteerde cellen met of zonder cytokinebehandeling. Virale plaques gevormd door geïnfecteerde cellen zijn zichtbaar als foci. Let op dat de met interferon behandelde putjes geen virale plaques vertonen.

Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals domeinmapping met hoge resolutie van het Zika-virus voor de lokalisatie van virale eiwitten en replicatie in muggen- en menselijke cellen, om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de verduidelijking van het mechanisme van ziektepathogenese en de evolutie van virale virulentie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het in vitro Zika-virus infectieuze cultuursysteem op basis van zoogdiercellen kunt opzetten om de replicatie van het Zika-virus te bestuderen, evenals het gebruik van het in vitro platform voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en vaccins.