Name: Zika Virus Besmettelijke celcultuur en de In Vitro Profylactisch effect van interferonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Leer een zoönotische celcultuurmethode voor Zika-virus om virusreplicatie te bestuderen en vaccinontwikkeling te ondersteunen. Dit protocol met Vero-cellen maakt grootschalige productie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Dr. Aaron Brault en Dr. Brandy Russell van de Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA bedanken voor het verstrekken van de Zika-virusstam PRVABC59. We danken Nicholas Ten van Yale University voor het copy-redigeren van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award aan V.A.

Opmerking: Een schematisch overzicht van de workflow wordt weergegeven in figuur 1. 1. Cellen <ol><li> Gebruik Vero cellen voor Zika virusproductie en analyse van de virale replicatiecyclus. </li><li> Bereid volledige groei medium dat 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, penicilline (100 eenheden / ml), streptomycine (100 eenheden / ml) en 10 mM HEPES. </li><li> Cultuur Vero cellen met het gespecificeerde volledige groeimedium bij 37 ° C met 5% CO2. </li></ol> 2. Zika Virus Production <ol><li> Oogst de Vero cellen bij 80% celdichtheid behulp 0,25% trypsine in T-75 kolf en tel de cellen. <ol><li> Zuig het medium van de T-75 kolf en spoel de cellen met 2 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Voeg 2 ml van 0,25% trypsine en incubeer de kolf bij 37 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg 8 ml serum bevattend groeimedium trypsine te inactiveren. Pipet op en neer om suspend cellen en breng de cellen om een ​​15 ml buis. </li><li> Verwijder 10 pi cellen en meng met gelijke hoeveelheid 0,4% trypan blauw. Plaats de voorbereide mix naar de cel telkamer glijbaan en het verkrijgen van levensvatbare cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller. </li></ol></li><li> Seed totaal 7.000.000 cellen in een 30 ml volume in een T-160 kolf. </li><li> De volgende dag, bereidt een geschikte multipliciteit van infectie (MOI 0,01 tot 0,1) van Zika virus inoculum in 10 ml serumvrij kweekmedium per fles. </li><li> Verwijder het verbruikte medium van de T-160 kolf en voeg de vers bereide virale inoculum (10 ml). </li><li> Incubeer de geïnoculeerde kolven van 37 ° C met 5% CO2 gedurende 4-6 uur. Verdeel de entstof door voorzichtig kantelen van de kolven zijwaarts op elk uur. </li><li> Na voltooiing van de incubatie, vervang het inoculum met warm-serum gesupplementeerd groeimedia (30 ml) voor elke fles. Dan blijven de viruskweek voor de volgende 96 uur. </li><li> Controleer de progressie van inFection door het observeren van het optreden van virale plaques op de cel monolaag met een fasecontrastmicroscoop en beeld (figuur 2) naar behoefte bij 40X en 200X vergroting nemen. </li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig2.jpg" /> Figuur 2:. Plaques gevormd door Zika virus op een monolaag van Vero-cellen Helderveld beelden van verschillende vergrotingen tonen Zika virale plaques bij 48 hpi. Let op de aanwezigheid van afgeronde cel foci op de monolaag. (Schaal bar = 50 pm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="8"><li> Oogst celcultuur supernatanten op 96 hr tijdstip en centrifugeer het supernatant bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om celresten te verwijderen. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig zonder te storen gepelleteerd puin en overdracht to 15 ml buizen. Ultracentrifugatie bij 24.000 xg kunnen worden uitgevoerd om de virale deeltjes (optioneel) concentreren. </li><li> Bewaar de virale kweeksupernatanten in meerdere porties bij -80 ° C. </li></ol> 3. Het meten van Zika virustiter door Plaque Assay <ol><li> Zaad naïeve Vero cellen op 1 x 10 5 cellen per putje in 2 ml volume met een 12-wells plaat. </li><li> De volgende dag bereiden 10-voudige seriële verdunningen van viraal kweeksupernatanten vanuit het T-160 kolf behulp serumvrij medium. Verwijder de gebruikte media uit elk putje en voeg 400 ul van bereide entstof op Vero-cellen in drievoud. </li><li> Incubeer de geïnoculeerde kolven 37 ° C met 5% CO2 gedurende 4-6 uur. Verdeel de entstof door voorzichtig kantelen van de plaat zijdelings bij ieder uur. </li><li> Aan het eind van de incubatie, het inoculum vervangen met serum aangevuld medium (2 ml per putje). </li><li> Na 48 uur na inenting, tel de virale brandpunten met behulp van een fase contrast microscoop. Bereken de virale titer plaque vormende eenheden (PFU) per ml. Zie Figuur 3 voor plaque assay. </li><li> Fix en vlekken op de cellen in 4% formaldehyde en 0,1% kristalviolet oplossing bereid in 20% ethanol voor een duidelijke visualisatie van plaques. </li></ol> 4. Zika virale genoom replicatie Assay <ol><li> Zaad naïeve Vero cellen op 1 x 10 5 cellen per putje in 2 ml volumina onder toepassing van een 12-wells plaat. De volgende dag bereiden virale inocula (MOI van 0,01 en 0,1, 400 ui / putje) met lage en hoge titer gebruik serumvrij medium in drievoud. Voor pseudo-infectie, gebruik serum vrije media (400 ul / putje) alleen. </li><li> Herhaal de stappen 3,2-3,4. </li><li> Voor deze 48 en 96 uur tijdstippen, laat de monsters voor RNA en immunocytochemie (ICC). <ol><li> Oogst RNA monsters, verwijder de kaart en voeg 400 ul lysis oplossing rechtstreeks aan elk putje en verzamel de lysaten. </li><li> Voor ICC, verwijder de media en then vast de cellen door toevoeging van 1 ml methanol aan elk putje en incubeer de plaat bij 4 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Van het cellysaat, isoleer het totale RNA met een RNA-isolatie-kit volgens de instructies van de fabrikant. Kwantificeren RNA met behulp van een spectrofotometer. </li></ol></li><li> Voer een tweestaps reverse transcriptie kwantitatieve PCR (RT-qPCR) aan de ZIKV genoominhoud van geoogste RNA te bepalen. <ol><li> Om reverse transcriberen het RNA, eerst een 13 pi reactie mix bestaat uit 5 ug van geïsoleerde RNA, 1 ui dNTPs (10 mm), en 1 pl willekeurige hexameer (250 ng) in een 0,2 ml buis. Incubeer de buis bij 65 ° C gedurende 5 minuten en plaats het op ijs gedurende één minuut. Voeg vervolgens 1 pl reverse transcriptase, 4 pl 5x streng synthese buffer, 1 pl 0,1 M dithiothreitol, en 1 pl RNase remmer aan het reactiemengsel. Incubeer de buis gedurende nog 5 min bij 25 ° C, gevolgd door 60 min bij 50 ° C en inactivat de reactie door verwarmen tot 70 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Voer qPCR gebruikt 1 pl van de resulterende cDNA met 12,5 ui 2x groene kleurstof super mengsel dat DNA polymerase en 1 pl 10 mM individuele primers specifiek voor Zika virus [Zika virus pan-genotype primers (voor: 5&#39;- AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 &#39; ; Rev: 5&#39;-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 &#39;), Zika virus Aziatische genotype PRVABC59 stam primers (5&#39;-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3&#39;; Rev: 5&#39;-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 &#39;)], of hepatitis C virus (JFH RTQ F: 5 &#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3&#39;), of cellulaire huishoud-gen GAPDH (voor: 5&#39;- CCACCTTTGACGCTGGG-3 &#39;; Rev: 5&#39;-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3&#39;) in een 25 pl reactievolume. </li><li> Voer PCR met de run toestand 95 ° C gedurende 15 sec en 60 ° C gedurende 30 seconden (40 cycli) in een real-time PCR systeem. </li><li> Gebruik GAPDH expressieniveau basis van cyclus drempelwaarde (Ct) waarde voor de Z normaliserenika virale genoom meting. Bereken de delta Ct (ACt) waarde van Zika genoom vergeleken met die van GAPDH en het verkrijgen van de 2 ACt waarde. Bereken vervolgens de veelvoudverandering door de verhouding van genormaliseerde Zika inhoud genoom tussen geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen op aangegeven tijdstippen. Zie Figuur 4 voor ZIKV genoomreplicatie resultaten. </li></ol></li><li> Voer ICC via de methanol gefixeerde cellen. <ol><li> Was de vaste cellen drie keer met 1x PBS en geblokkeerd met ICC blokkeerbuffer (3% geit serum, 3% BSA, 0,1% Triton-X-100 in PBS). </li><li> Met monoklonaal anti-dsRNA J2 antilichaam (1 ug / ml) bij een verdunning van 1: 100 in blokkerende buffer en incubeer overnacht bij 4 ° C. </li><li> Was de cellen met 1x PBS en secundair antilichaam geit anti-muis IgG-594 (1 ug / ml) toe aan een 1: 1000 verdunning in blokkeerbuffer en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen met 1x PBS en vlek voor kernen met behulp van Hoechst kleurstof enobserveert de cellen met een fluorescentiemicroscoop bij 100x vergroting (figuur 4). </li></ol></li></ol> 5. Screening Cytokine Bibliotheek tegen Zika Virus Infection <ol><li> Zaad naïeve Vero cellen op 1 x 10 5 cellen per putje onder toepassing van een 12-wells plaat. Zodra de cellen zijn bevestigd (6 uur na het zaaien), voeg elk cytokine bij aangegeven concentraties in biologische duplicaten (2 ml volume / putje). Inclusief voertuig (PBS) alleen controle. </li><li> Om 12 uur na de behandeling uit te voeren Zika virale infectie (MOI van 0,1 in 400 ul per putje). Onder meer negatieve controle wells zonder infectie (mock). </li><li> Bij 4 uur na infectie, vervang het virale inoculum met cytokine behandelde media (2 ml). Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende nog 44 uur. </li><li> Op 48 uur na infectie, virale plaques tellen met behulp van een fasecontrastmicroscoop en het verwerven van representatieve beelden van geïnfecteerde cellen 40x vergroting (figuur 5). </li></ol>

<ol><li>Brasil, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women+in+Rio+de+Janeiro+-+Preliminary+Report%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report.</a> N Engl J Med. , 1-11 (2016).</li>
<li>Lucey, D. R., Gostin, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emerging+Zika+Pandemic%3A+Enhancing+Preparedness%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness.</a> JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).</li>
<li>Mlakar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Associated+with+Microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Associated with Microcephaly.</a> N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).</li>
<li>Schuler-Faccini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+Association+Between+Zika+Virus+Infection+and+Microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Morb+Mortal+Wkly+Rep%22%5BJournal%5D)">Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly.</a> MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), Brazil. 59-62 (2015).</li>
<li>Foy, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probable+non-vector-borne+transmission+of+Zika+virus%2C+Colorado%2C+USA%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA.</a> Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).</li>
<li>Kuno, G., Chang, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+sequencing+and+genomic+characterization+of+Bagaza%2C+Kedougou%2C+and+Zika+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses.</a> Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).</li>
<li>Dick, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus.+II.+Pathogenicity+and+physical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+R+Soc+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).</li>
<li>Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+R+Soc+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).</li>
<li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome--case+report%2C+French+Polynesia%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveill%22%5BJournal%5D)">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia.</a> Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).</li>
<li>Baronti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+coding+sequence+of+zika+virus+from+a+French+polynesia+outbreak+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announc%22%5BJournal%5D)">Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013.</a> Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).</li>
<li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+serologic+properties+of+Zika+virus+associated+with+an+epidemic%2C+Yap+State%2C+Micronesia%2C+2007%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007.</a> Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).</li>
<li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+of+Zika+virus+in+Western+Hemisphere%2C+2015+%5BLetter%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter].</a> Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).</li>
<li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).</li>
<li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infects+Human+Cortical+Neural+Progenitors+and+Attenuates+Their+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth.</a> Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).</li>
<li>Hamel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+Zika+Virus+Infection+in+Human+Skin+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells.</a> J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).</li>
<li>Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+detection+of+Zika+virus+and+evaluation+with+field-caught+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes.</a> Virol J. 10, 311(2013).</li>
<li>Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+enhancer+and+critical+cis-acting+RNA+elements+in+the+protein-encoding+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome.</a> J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).</li>
<li>Hiratsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+interferon-alpha+during+pregnancy%3A+effects+on+fetus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Perinat+Med%22%5BJournal%5D)">Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus.</a> J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).</li>
<li>Ozaslan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+therapy+for+acute+hepatitis+C+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy.</a> Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier wordt een gestroomlijnde protocol voor het kweken Zika virus in vitro gepresenteerd. Kritische stappen met inbegrip van, het identificeren van optimale eindpunten voor de uitbreiding van het virus cultuur, het meten titer, en kwantificeren van genoom replicatie werden verstrekt. Zika virus is een menselijk pathogeen, dus, terwijl de behandeling van infectieuze middelen, bioveiligheid procedures moeten strikt worden opgevolgd. Een aap niercellijn, Vero, werd gebruikt voor het aantonen van verschillende viro...

Zika Virus (ZIKV) is een belangrijke menselijke pathogeen geassocieerd met microcefalie en slechte zwangerschapsuitkomsten 1,4. ZIKV behoort tot de verzameling van medisch relevante flavivirussen die neurologische gebreken zoals Dengue, West Nile, en St. Louis encefalitis virussen kunnen veroorzaken. De belangrijkste wijze van virale transmissie van de mug vector Aedes aegypti, en bovendien heeft seksuele overdracht ook gemeld 5,6. ZIKV is uitgegroeid tot een grote wereldwijde gezondheidsprobleem als gevolg van de uitbreiding van de geografische spreiding van de mosquito vector en de sterke correlatie met aangeboren afwijkingen. ZIKV werd voor het eerst geïsoleerd in 1947 uit een sentinel rhesus aap in de Zika bos, Oeganda en de eerste menselijke geval werd gemeld in 1952 7,8. Personen die besmet raken met ZIKV aanwezig met milde symptomen zoals koorts, huiduitslag, hoofdpijn, conjunctivitis, en spier / gewrichtspijn geworden. Geïnfecteerde zwangere vrouwen kunnen ZIKV doorgeven aan de zich ontwikkelende foetus 1. ZIKV infectie is ook gekoppeld aan Guillain-Barre syndroom, een perifere zenuw auto-immune stoornis 9 demyelinisatie. De Zika virale genoom bestaat uit een positieve sense, enkelstrengs RNA-molecuul dat ongeveer 10,8 kilobasen in lengte. De structuur van het genoom is georganiseerd als 5&#39;NCR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-2K-NS5-3&#39;NCR, met niet-coderende regio (NCR) flankeren een eiwit coderend gebied 6. Een enkele polyproteïne (3419 aa) vertaald dat co- en post-translationeel gesplitst in 10 kleinere peptiden. Zowel de 5&#39;NCR en 3&#39;NCR RNA stam-lus structuren spelen een cruciale rol bij de aanvang van de virale genoom vertaling en replicatie. De structurele elementen van het genoom bestaan ​​uit de capside, membraan en envelopeiwitten. De niet-structurele eiwitten zijn essentieel voor genoomreplicatie. Op dit moment zijn Zika virusstammen gegroepeerd in drie genotypes: West-Afrikaanse, Oost-Afrikaanse en Aziatische 6,10-13. Het is voorgesteld dat de Oost-Afrikaanse afkomst verspreid naar West Afrika en Azië, waar later verder ontwikkeld 12. De Aziatische genotype is verantwoordelijk voor de huidige uitbraken in de Amerika&#39;s. Zika virus kan worden gekweekt in zowel mug en zoogdiercellen. Primaire dermale fibroblasten, ongerijpte dendritische cellen, corticale neurale progenitorcellen en Vero-cellen zijn gevoelig voor virale infectie Zika 10,14,15. Zowel type I als type II interferonen is aangetoond dat groei ZIKV in huidfibroblasten 15 beperken. De doelstellingen van deze studie zijn om een ​​stapsgewijze gedetailleerde protocol voor de productie en het testen van de Aziatische genotype ZIKA virusstam PRVABC59 in een zoogdiercel kweeksysteem en om het nut van deze besmettelijke kweeksysteem als geneesmiddelenontwikkeling platform demonstreren. Deze bron heeft de potentie om veel baat de Zika virale en neurologisch onderzoek gemeenschap om i verder te ontrafelents mechanismen van virale pathogenese en ontwikkeling van virale virulentie.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&rsquo;s modified Eagle&rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Sigma Life Science</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red&nbsp;&nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-054-C1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Countess &ndash; Automated Cell Counter</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Countess-cell counting&nbsp; chamber slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2&nbsp;</td><td>English &amp; Scientific Consulting Kft.</td><td>10010200</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td><td>Life Technologies</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fischer</td><td>4471088</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Vero Cell Line&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>Zika viral strain PRVABC59</td><td>Centers for Disease Control and Prevention (CDC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 alpha&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>200-01A&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TNF-alpha</td><td>Peprotech</td><td>300-01A&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Interferon alpha A&nbsp;&nbsp;</td><td>R &amp; D Systems</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>Interferon beta</td><td>Peprotech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>Interferon gamma</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415R</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI</td><td>Nikon</td><td>Visit Nikon for Request</td><td></td></tr></tbody></table>

zika virus besmettelijke celcultuur en de<em&gt; in vitro</em&gt; profylactisch effect van interferonen

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is een opkomende pathogeen die is gekoppeld aan foetale ontwikkelingsstoornissen afwijkingen zoals microcefalie, oogafwijkingen en verminderde groei. ZIKV is een RNA-virus van de familie Flaviviridae. ZIKV wordt voornamelijk overgedragen door muggen, maar kan ook worden verspreid door de moeder van de foetus verticale transmissie en seksueel contact. Tot op heden zijn er geen betrouwbare behandeling of vaccin keuzemogelijkheden bij besmet met het virus te beschermen. De ontwikkeling van een reproduceerbare effectieve Zika infectieus virus celkweeksysteem is cruciaal voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van ZIKV replicatie en geneesmiddel en vaccinontwikkeling. In dit opzicht is een protocol beschrijft een zoogdierlijke cellen gebaseerde in vitro Zika viruskweek voor virusproductie en groei analyse hier vermeld. Details betreffende de vorming van plaques door Zika virus op een cel monolaag en plaque-test voor het meten van virale titer worden gepresenteerd. Virale genoom replicatie kinetieken dubbelstrengs RNA genoom replicatory tussenproducten worden bepaald. Deze cultuur werd gebruikt om platform scherm tegen een bibliotheek van een kleine set van cytokinen resulteerde in identificatie van interferon-α (IFN-α), IFN-β en IFN-γ als krachtige remmers van virale groei Zika. Kortom, een in vitro infectieuze Zika viruskweek en div virologische assays worden aangetoond in deze studie, die in potentie de onderzoeksgemeenschap veel baat verder ophelderen van de mechanismen van virale pathogenese en de ontwikkeling van virale virulentie heeft. Antivirale IFN-alpha kan verder worden geëvalueerd als een profylactisch, na blootstelling profylactische en behandelingsoptie voor Zika virusinfecties in zeer riskante bevolking, met inbegrip van geïnfecteerde zwangere vrouwen.

Een Zika virusstam (PRVABC59; GenBank KU501215) van de Aziatische genotype werd gebruikt in deze studie 12. Vero cellen bij 80% confluentie werden gebruikt voor het onderzoeken van de novo Zika virusinfectie. Virale productie en daaropvolgende virologische karakterisering werd een vroege passage (P3) Zika virus toegepast. De virale plaques werden waargenomen op de tweede dag van de infectie. Zika virale nakomelingen afgegeven uit de aanvankelijk geïnfecteerde cel vers...

Zika Virus (ZIKV), een opkomend pathogeen, wordt in verband gebracht met foetale ontwikkelingsstoornissen en microcefalie. De oprichting van een effectief infectieus celkweeksysteem is cruciaal voor studies naar ZIKV-replicatie evenals voor de ontwikkeling van vaccins en geneesmiddelen. In deze studie worden verschillende virologische tests met betrekking tot ZIKV geïllustreerd en besproken.

Zika Virus Besmettelijke celcultuur en de<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylactisch effect van interferonen

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Het algemene doel van deze studie is het opzetten van een in vitro infectieuze kweekmethode voor het Zikavirus op basis van zoogdiercellen om de replicatie van het Zikavirus te bestuderen, evenals het gebruik van dit in vitro platform voor de ontwikkeling van geneesmiddelen. Dit gedetailleerde stapsgewijze protocol voor het infectieuze celkweeksyteem van het Zikavirus kan helpen bij het ontrafelen van het mechanisme achter de door het Zikavirus gemedieerde ziektepathogenese en de evolutie van de virale virulentie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het grootschalige productie van het Zikavirus mogelijk maakt voor de ontwikkeling van medicijnen en vaccins.Begin met het oogsten van Vero-cellen bij een celldichtheid van 80% in een T75-kweekfles door het medium uit de fles te aspireren en de cellen te spoelen met twee milliliter fosfaatgebufferde zoutoplossing. Voeg twee milliliter 0,25% trypsine toe en incubeer de fles bij 37 °C gedurende vijf minuten. Voeg na de incubatie acht milliliter groeimedium met serum toe om de trypsine te inactiveren. Draag de cellen vervolgens over naar een buis van 15 milliliter. Neem daarna 10 µL cellen af en meng deze met een gelijke hoeveelheid 0,4% trypanblauw. Breng het voorbereide mengsel aan op de telkamerdia en bepaal het aantal levensvatbare cellen met een automatische celteller. Zaai in totaal zeven miljoen cellen in een T160-fles in een volume van 30 milliliter. Bereid de volgende dag een passend inoculum van het zikavirus met de juiste multipliciteit van infectie in 10 milliliter serumvrij kweekmedium per fles.Veilige omgang met het virus is essentieel om de verspreiding van de infectie te voorkomen.Verwijder het gebruikte medium uit de T160-fles en voeg vervolgens de volledige 10 milliliters vers bereid viraal inoculum toe. Incubeer de geïnoculeerde flessen bij 37 degrees Celsius met 5%CO2 gedurende vier tot zes uur. Verspreid het inoculum door de fles elk uur tijdens de incubatie voorzichtig zijwaarts te kantelen. Vervang na voltooiing van de incubatie het inoculum door 30 milliliters warm, met serum aangevuld groeimedium. Zet vervolgens de virale cultuur voort voor de volgende 96 uur. Verifieer na vier dagen de voortgang van de infectie door met een fasecontrastmicroscoop het verschijnen van virale plaques op de cellaag te observeren. Maak indien nodig afbeeldingen bij een vergroting van 40x en 200x.Oogst de supernatanten van de celcultuur op het tijdstip van 96 uur en centrifugeer de supernatant bij 300 ×g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius om celresten te verwijderen. Verwijder na centrifugatie voorzichtig de supernatanten zonder het gepelletteerde debris te verstoren en breng deze over in buisjes van 15 milliliters.Bewaar de supernatanten van de virale cultuur in meerdere aliquoten bij -80 °C.Om het virus te titeren, worden eerst naïeve Vero-cellen in een 12-wells plaat gezaaid met een dichtheid van 1 × 10⁵ cellen per well, in een volume van 2 mL. De volgende dag worden tienvoudige seriële verdunningen gemaakt van de viral culture supernatants, die met serumvrij medium uit de T160-fles zijn verzameld.Zorg bij het bereiden van seriële verdunningen van viraal cultuursupernatans voor titerbepalingen dat het virus veilig wordt gehanteerd om infectie te voorkomen.Verwijder vervolgens het verbruikte medium uit elke put van de 12-wellplaat met Vero-cellen en voeg 400 µL van het verdunde inoculum in triplo toe aan de Vero-cellen. Incubeer de geïnoculeerde platen gedurende vier tot zes uur in de weefselkweekincubator.Vervang aan het einde van de incubatie het inoculum door twee milliliters medium aangevuld met serum per well. Tel 48 uur na inoculatie de virale foci bij de juiste verdunningen met behulp van een fasecontrastmicroscoop. Bereken de virale titer als plaque-vormende eenheden per milliliter.Na het inoculeren van Vero-cellen in een 12-well plaat met hoge en lage titers van het Zikavirus, en een incubatie van 48 en 96 uur, wordt de genoomreplicatie beoordeeld via kwantitatieve PCR voor de expressie van het Zikavirusgenoom, en via immunocytochemie voor dubbelstrengs RNA.Voor immunocytochemie verwijdert u het medium uit de wells van de 12-well plaat en voegt u één milliliter methanol toe aan elke well. Laat de cellen fixeren bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Was vervolgens de gefixeerde cellen drie keer met 1x PBS. Voeg daarna blokkeringsbuffer toe en incubeer dit gedurende één uur bij kamertemperatuur. Verdun de muis monoklonale anti-dubbelstrengs RNA-antilichaam J2 1:100 in blokkeringsbuffer, voeg dit toe aan de cellen en incubeer de cellen in deze oplossing overnacht bij vier graden Celsius. Verdun de volgende dag het geiten anti-muis IgG-594 secundaire antilichaam 1:1.000 in blokkeringsbuffer; voeg dit na het wassen van de cellen met 1x PBS toe aan de cellen en incubeer deze gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was de cellen vervolgens met 1x PBS, kleur de celkernen met Hoechst-kleurstof en observeer de cellen met een fluorescentiemicroscoop bij een 100x vergroting.Zes uur na het uitplaten van naïeve Vero-cellen in een plaat met 12 putjes, zoals voorheen, worden de gewenste cytokinen in de aangegeven concentraties in biologische duplicaten toegevoegd. 12 uur na de behandeling wordt infectie met het Zika-virus uitgevoerd, waarbij putjes zonder infectie als negatieve controles dienen. Vier uur na de infectie wordt het virale inoculum vervangen door medium dat met cytokinen is behandeld, waarna de cellen nog 44 uur lang worden geïncubeerd bij 37 °C. 48 uur na de infectie worden de virale plaques geteld met behulp van een fasecontrastmicroscoop en worden representatieve afbeeldingen van geïnfecteerde cellen gemaakt bij een 40x vergroting.Deze grafiek toont het genomische gehalte van het Zika-virus gemeten via RT-qPCR. Zowel de Pan-genotype- als de PRVABC-59-stamprimers vertoonden een gelijke sensitiviteit en specificiteit. Zoals verwacht amplificeerden de hepatitis-C-virusprimers geen enkel product.Hier worden de groeikinetieken van het Zika-virus op de aangegeven tijdstippen getoond in cellen geïnfecteerd met lage en hoge titers, vergeleken met die van de niet-geïnfecteerde mock-controle. Resultaten van de immunocytochemische assay laten zien dat de geïnfecteerde cellen 48 uur na infectie in een paar clusters voorkomen, terwijl na 96 uur na infectie de meeste cellen geïnfecteerd zijn. Deze grafiek toont de modulatie van de Zika-virale groei door verschillende cytokinen, vergeleken met die van de vehicle-controle.Deze fasecontrastbeelden tonen met het Zikavirus geïnfecteerde cellen met of zonder cytokinebehandeling. Virale plaques gevormd door geïnfecteerde cellen zijn zichtbaar als foci. Let op dat de met interferon behandelde putjes geen virale plaques vertonen.Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals domeinmapping met hoge resolutie van het Zika-virus voor de lokalisatie van virale eiwitten en replicatie in muggen- en menselijke cellen, om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de verduidelijking van het mechanisme van ziektepathogenese en de evolutie van virale virulentie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het in vitro Zika-virus infectieuze cultuursysteem op basis van zoogdiercellen kunt opzetten om de replicatie van het Zika-virus te bestuderen, evenals het gebruik van het in vitro platform voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en vaccins.

zika-virus-infectious-cell-culture-system-vitro-prophylactic-effect

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates an assay to measure antibody-dependent enhancement (ADE) of Dengue virus infection using Zika Virus Convalescent Serum. The assay uses Dengue reporter viral particles (RVPs) encoding a green fluorescent protein. Serum antibodies against the Zika Virus cross-react with RVPs to form a complex. The bound antibodies enhance RVP uptake by cells expressing the Fc receptor, which is detected using flow cytometry.

An In Vitro Assay to Examine the Antibody-Dependent Enhancement of Viral Infection

The video demonstrates an in vitro assay for screening interferons with antiviral activity against the Zika virus, a human pathogen. Within the host cell, the Zika virus undergoes multiplication upon internalization, infecting neighboring cells and creating distinct zones or viral plaques. Type I interferon, acting as an antiviral agent, hinders virus multiplication, thereby preventing the formation of viral plaques in the host cell monolayer.

An In Vitro Assay for Screening Interferons as Potent Inhibitors of Zika Virus Growth

This video demonstrates a procedure to infect human fetal neural stem cells with Zika virus. The infected cells can be used for further studies.

Zika Virus Infection of Fetal Neural Stem Cells

Dit protocol beschrijft het herstel van infectief Zika-virus uit een infectieuze cDNA-kloon met twee plasmiden.

Redding en karakterisering van het recombinante virus van een nieuwe infectieuze kloon van de Zika Virus

Hier beschrijven we een methode voor de vaststelling van een model voor Zika virus-geïnduceerde microcefalie in muis. Dit protocol bevat methoden voor embryonale, Neonatale en volwassene-fase intracerebrale inoculatie van de Zika-virus.

Tot vaststelling van Muismodellen voor Zika-Virus-geïnduceerde neurologische aandoeningen met behulp van intracerebrale injectie strategieën: embryonale, Neonatale en volwassen

In dit artikel een overzicht van de methoden die worden gebruikt om uit te breiden van de foetale hersenen neurale stamcellen in cultuur, evenals hoe om hen te onderscheiden in verschillende neuronale subtypen en astrocyten, met de nadruk op het gebruik van neurale stamcellen te bestuderen Zika virusinfectie.

Zika Virus infectie van gekweekte menselijke foetale hersenen neurale stamcellen immunocytochemische p.a.

Een protocol bij het evalueren van antigeen-specifieke T-cel-reacties in de organen van de immunoprivileged van het Ifnar1- / - lymfkliertest model voor de Zika-virus (ZIKV)-infectie wordt beschreven. Deze methode is cruciaal voor het onderzoeken van de cellulaire mechanismen voor de bescherming en immunopathogenese van ZIKV vaccins en is ook waardevol voor de evaluatie van hun doeltreffendheid.

Evaluatie van Zika Virus-specifieke T-cel reacties in Immunoprivileged organen van besmette Ifnar1- / - muizen

Beschrijven we een methode om te evalueren van het effect van reeds bestaande immuniteit tegen dengue virus op de Zika-virus-infectie met behulp van menselijk serum, primaire menselijke cellen en kwantificering van de infectie door kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie.

Kwantificering van antilichaam-afhankelijke versterking van het Zika-Virus in primaire menselijke cellen

Het doel van het protocol is om de technieken aan te tonen die worden gebruikt om virale ziekten te onderzoeken door het Zikavirus te isoleren en te kwantificeren, van meerdere organen in een muis na infectie.

Isolatie en kwantificering van het Zikavirus van meerdere organen in een muis

In dit werk beschrijven we de protocollen die worden gebruikt in op replicon gebaseerde en virale enzymgebaseerde testen om te screenen op remmers van Zika-virusreplicatie in een screeningsformaat met hoge doorvoer.

Antivirale testen met hoge doorvoer om te screenen op remmers van Zika-virusreplicatie

Hier demonstreren we het gebruik van celgebaseerde elektrische impedantie (CEI) als een zeer eenvoudige en eenvoudige methode om Zika-virusinfectie en -replicatie in menselijke cellen in realtime te bestuderen. Bovendien is de CEI-test nuttig voor de evaluatie van antivirale verbindingen.

Celgebaseerd elektrisch impedantieplatform om Zika-virusremmers in realtime te evalueren

Leer een zoönotische celcultuurmethode voor Zika-virus om virusreplicatie te bestuderen en vaccinontwikkeling te ondersteunen. Dit protocol met Vero-cellen maakt grootschalige productie mogelijk.

Zika Virus Besmettelijke celcultuur en de

Meer video's verkennen