Extractie van Plant-gebaseerde Capsules voor Micro-inkapseling Applications

Het algemene doel van deze procedure is om een gestroomlijnd proces vast te stellen voor het extraheren van Sporopollenine Exine Capsules, of SEC's, voor toepassingen in micro-inkapseling. Deze methode kan snel schone micro-captures leveren voor toepassingen in de voedingsmiddelen- en gezondheidszorgsector. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de tijd voor het SEC-extractieproces aanzienlijk kan worden verkort om schone, intacte SEC's te produceren.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in het gestroomlijnde extractieproces van SEC en uitgebreide stapsgewijze karakterisering, kan deze ook worden gebruikt voor fundamentele microstructurele en morfologische evaluaties van verschillende biomaterialen op plantbasis. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn aan deze methode moeite hebben met het conventionele extractieproces van 8 tot 10 dagen, waarbij zeer corrosieve zuren bij verhoogde temperaturen worden gebruikt. Om deze procedure te starten, stelt u een reflux-opstelling op in een zuurkast met een glazen condensor, een watercirculatiesysteem en een waterbad.

Aangezien het SEC-extractieproces gebruikmaakt van zeer corrosieve zuren en organische oplosmiddelen, moet het proces worden uitgevoerd met passende persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals een veiligheidsbril, laboratoriumjas, mondmasker en handschoenen met gevarensignalering. Weeg voorzichtig 100 gram L clavatum-sporen af zonder stof te veroorzaken en uit de buurt van elke ontbrandingsbron. Draagt de sporen vervolgens langzaam over naar een PTFE-ronde bodemkolf van één liter met een magnetische roerkolf.

Voeg 500 milliliters aceton toe aan de sporen en schud de kolf voorzichtig om een homogene suspensie te vormen. Plaats de kolf nu in een waterbad dat is ingesteld op 50 degrees Celsius en is verbonden met de refluxcondensor. Verhit de suspensie onder reflux gedurende zes uur met roeren bij 200 RPM.

Nadat de suspensie op kamertemperatuur is afgekoeld, wordt deze onder vacuüm gefiltreerd met filterpapier en worden de ontvette sporen opgevangen in grote glazen petrischalen. Droog de sporen op kamertemperatuur door de petrischalen af te dekken met aluminiumfolie waarin gaatjes zijn gemaakt voor de verdamping van het oplosmiddel. Nadat de gedroogde, ontvette sporen zijn overgebracht naar een PTFE-kolf van één liter, worden 500 milliliter van een 85% fosforzuuroplossing toegevoegd.

Plaats de kolf in een waterbad ingesteld op 70 °C en sluit deze aan op de refluxcondensor. Verhit de suspensie onder reflux gedurende 30 uur onder stirring. Zodra de suspensie is afgekoeld tot kamertemperatuur, wordt deze verdund met 500 milliliters warm gedeïoniseerd water, waarna de SECs worden opgevangen via vacuümfiltratie met filterpapier.

Breng daarna de SEC's over naar een glazen bekerglas van drie liter om een reeks wasbeurten uit te voeren. Voeg in de zuurkast 800 milliliter heet gedeïoniseerd water toe aan de SEC's en roer voorzichtig gedurende 10 minuten. Filtreer vervolgens de suspensie met filterpapier onder vacuüm.

Overbreng de SEC's naar een schoon glazen bekerglas van drie liter. Nadat de vorige stappen vijf keer zijn herhaald, voegt u 600 milliliters hete aceton toe aan de SEC's en roert u dit gedurende 10 minuten voorzichtig. Verzamel de SEC's door vacuümfiltratie en overbreng ze naar een schoon glazen bekerglas van drie liter.

Nadat de vorige stappen met de juiste oplosmiddelen zijn herhaald, worden de schone SEC's overgebracht naar zes grote glazen petrischalen en gedurende 24 uur bij kamertemperatuur in een zuurkast gedroogd om al het water te verwijderen. Droog de SEC's vervolgens in een vacuümoven bij 60 °C en een vacuüm van 1 mbar gedurende 10 uur, of tot een constant gewicht is bereikt. Breng de gedroogde SEC's daarna over naar een polypropyleen fles voor bewaring in een droogkast.

Bereid 1,2 milliliter van een Bovine Serum Albumin, of BSA-oplossing in gedeïoniseerd water, en breng dit over naar een polypropyleen buis van 50 milliliter. Voeg 150 milligram SECs toe aan de BSA-oplossing. Vortex het mengsel gedurende 10 minuten om een homogene oplossing te vormen.

Nadat de buis met filterpapier is afgedekt, wordt deze overgebracht naar een vriesdrogerkolf en vier uur gedroogd onder vacuüm bij één millibar. Zodra de met BSA geladen SEC's droog zijn, worden de agglomeraten met een vijzel en stamper verwijderd. Breng de met BSA geladen SEC's vervolgens over naar een buis van 50 milliliter en voeg twee milliliter gedeïoniseerd water toe om het resterende BSA te verwijderen.

Verzamel de SEC's door centrifugatie bij 4.704 ×g gedurende vijf minuten. Gooi na afloop het supernatant weg. Herhaal het wassen met gedeïoniseerd water.

Bedek daarna de buis met de BSA-geladen SECs met filterpapier. Plaats de SECs vervolgens gedurende één uur in een vriezer. Lyofiliseer de SECs gedurende 24 uur.

Bewaar de SEC's in de vriezer tot verdere karakterisering. Gebruik vijf milligram van de met BSA geladen SEC's in een polypropyleen buis van twee milliliter. Voeg 1,4 milliliter PBS toe en vortex vijf minuten lang.

Sonicate vervolgens de suspensie met een probe op 40% amplitude gedurende drie cycli van tien seconden. Filtreer na afloop de oplossing met een polyethersulfone filter van 0,45 micron. Nadat de voorgaande stappen met de placebo-SEC's zijn uitgevoerd, wordt de absorptie van de met BSA beladen SEC's bij 280 nanometer gemeten, waarbij de placebo als blanco dient.

Kwantificeer ten slotte de hoeveelheid ingekapselde BSA met behulp van een BSA-standaardcurve in PBS. SEM-beelden tonen intacte sporen met een unieke microstructuur, en vóór de bewerking werden organellen op micronschaal in het sporoplasme waargenomen in het dwarsdoorsnedebeeld. Na ontvetten van de sporen en alkalische behandeling werden geen morfologische of structurele veranderingen waargenomen.

SEM-beelden na acidolyse tonen intacte SECs die ontdaan zijn van sporoplasmatisch materiaal. Uit CHN-analyse blijkt dat er bij ontvette en alkalisch behandelde SECs geen substantiële verwijdering van eiwitachtig materiaal heeft plaatsgevonden. Het grootste deel van het eiwitachtige materiaal wordt door acidolyse verwijderd.

DIPA-analyse laat de uniforme grootteverdeling van SEC's zien na acidolyse tot 30 uur. De structurele integriteit van SEC's neemt af bij verlengde acidolyse. SEM- en DIPA-gegevens tonen aan dat acidolyse na de ontvettingsstap intacte SEC's produceerde met een uniforme grootteverdeling.

CLSM-gegevens geven aan dat onbehandelde SEC's autofluorescentie vertonen als gevolg van sporoplasmabestanden in de sporenholte. Na verwerking met enkel acidolyse worden alle sporoplasmatische bestanddelen verwijderd. Na inkapseling van FITC-BSA wordt groene fluorescentie waargenomen binnen de SEC's.

De SEM-beelden tonen intacte microruggen na belading met BSA. Er werden geen substantiële veranderingen waargenomen in diameter, circulariteit en aspectratio na belading van BSA in SEC's. BSA-kwantificatie uit ingekapselde SEC's bevestigt de consistentie van het micro-inkapselingsproces met 0,170 plus of minus 0,01 gram BSA-belading per gram SEC's.

Zodra deze gestroomlijnde SEC-extractieprocedure onder de knie is, kan deze in 48 uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Bij het toepassen van deze procedure voor diverse plantensporen en pollen is het belangrijk om stapsgewijze evaluaties van structurele morfologische en elementaire analyses uit te voeren om intacte en schone capsules te verkrijgen. Na deze procedure kunnen andere extractieprocessen met alkalische enzymen worden uitgevoerd om de haalbaarheid van het geoptimaliseerde proces voor diverse plantaardige capsules te controleren.

Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van micro-inkapseling, geneesmiddelentoediening en tissue engineering om diverse plantaardige SEC's te verkennen als biomaterialen van de volgende generatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u SEC's uit plantensporen en pollenkorrels kunt extraheren en karakteriseren, alsmede hoe u geneesmiddelen en biomacromoleculen in SEC's kunt inkapselen.