Name: Een nieuwe methode voor Kwalitatieve Multi-schaal analyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcel Koloniën met behulp van confocale en Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Leer een methode voor kwalitatieve multi-schaalanalyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcelkolonies met confocale en elektronenmicroscopie. Dit protocol helpt microbiologen biofilmvorming op hyfen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de Franse Nationale Onderzoeksagentschap via het Laboratorium van Uitmuntendheid ARBRE (ANR-11-LABX-0002-01), het Plant-Microbe Interfaces Wetenschappelijk Focusgebied in het Genomische Wetenschapsprogramma, en het Office of Biological and Environmental Research in het DOE Office of Science. Oak Ridge National Laboratory wordt beheerd door UT-Battelle, LLC, voor het United States Department of Energy onder contract DE-AC05-00OR22725.

1. Bereiding van bacteriële en fungale culturen <ol><li> Bereiding van schimmelcultures <ol><li> Bereid cellofaan membranen met dezelfde diameter als de petrischalen en kook ze in EDTA (1 g / l in gedeïoniseerd water) gedurende 30 min. Spoel de platen met gedemineraliseerd water en autoclaaf ze twee keer. </li><li> Bereid een schimmel voorkweek door enten schimmel agar stekkers op de juiste agarmedium bedekt met EDTA voorbehandelde cellofaan membraan. Incubeer in bij de optimale groeitemperatuur van de kolonies ongeveer 1 cm in diameter te verkrijgen. <ol><li> Voor L. bicolor S238N, incuberen bij 25 ° C gedurende 5 dagen op Pachlewski P5 agarmedium, uit 0,5 g diNH4 tartraat, 1 g KH 2 PO4, 0,5 g MgSO .7H 4 2 O, 5 g D + Maltose , 20 g glucose D +, 1 ml 10% thiamine-HCl, 1 ml 1/10 verdunde oplossing micronutriënten (6 g / l ijzersulfaat; 0,27 g / l molybdeen trioxyde; 8,45 g / l boorzuur; 5 g / L manganese sulfaat; 5 g / l cuprisulfaat; 2,27 g / l zinksulfaat) aangevuld tot 1 L met gedeïoniseerd water; en 20 g agar; pH 5,5. </li></ol></li><li> Van de schimmel voorkweek Inoculeer een nieuwe agarplaat bedekt met de EDTA voorbehandelde cellofaan membraan dat een koolstofarme agarmedium de radiale expansie van de kolonies te promoten. <ol><li> Om de petrischaal te enten, zachtjes krassen op de externe omgeving (waar de cellen hebben dezelfde fysiologische toestand) van een schimmel kolonie uit de pre-culture met een scalpel en breng de schimmeldraden om de nieuwe agar plaat. </li><li> Incubeer bij de optimale groeitemperatuur totdat de nieuwe kolonies ongeveer 1 cm in diameter. Voor L. bicolor S238N, incubeer ze op 25 ° C gedurende 5 dagen op P20 agarmedium (0,25 g Dinh 4 tartraat, 0,5 g KH 2PO 4, 0,25 g MgSO 4 2 .7H O, 1 g glucose D + , 0,5 ml 10% thiamine-HCl, 0,5 ml 1/10 verdunde oplossing micronutriënten (zie 1.1.2.1), aangevuld tot 1 L met gedeïoniseerd water; en 20 g agar; pH 5,5). Let op: Als gevolg van de pre-cultuur op de cellofaan, zal de tweede cultuur niet agar media bevatten in de centrale pluggen. De agarproppen moet worden verwijderd voor verdere analyse van de biofilms, aangezien deze pluggen voeren agar en voedingsstoffen die systematische fouten in de analyse kan maken. Deze stap betreft alleen schimmelsoorten die worden gehouden en gekweekt op agarplaten, en het is niet noodzakelijk schimmels die zijn voortgeplant uit sporen of bevroren voorraden. </li></ol></li></ol></li><li> Bereiding van bacteriële culturen <ol><li> Een steriele lus te verzamelen 2-3 afzonderlijke bacteriële kolonies van een kweek van de geschikte agar medium te inoculeren en 25 ml vloeibare Luria-Bertani (LB) medium (of een ander geschikt medium, afhankelijk van de gebruikte stam). Voor P. fluorescens BBc6, uitbroeden van een kweek gedurende de nacht bij 28 ° C onder voorzichtig schudden (~ 150 rpm). Opmerking: Het gebruik van een stamgelabeld met fluorescerend eiwit zoals GFP, de voorkeur, omdat dit vermijdt het uitvoeren van een dubbele kleuring (schimmels en bacteriën) voorafgaande aan microscopische waarneming. De timing, de roersnelheid en de temperatuur van de incubatie afhankelijk van de gebruikte stam, het doel is om een ​​cultuur verkrijgen late exponentiële groei. </li></ol></li></ol> 2. Bereiding van N in vitro Biofilm Bacteria de schimmelkolonie <ol><li> Centrifugeer de bacteriekweek bij 5000 xg gedurende 3 minuten en suspendeer de pellet in 25 ml steriele 0,1 M kaliumfosfaatbuffer (25 g / l KH 2PO 4 en 2,78 g / LK 2 HPO 4, pH 5,8). Herhaal deze stap eenmaal pas de uiteindelijke bacteriële concentratie 10 9 cellen / ml met dezelfde buffer. </li><li> Vul een 6-well microplaat met 5 ml van de bacteriesuspensie (of steriele 0,1 M kaliumfosfaatbuffer voor de negatieve controle). </li><li> Snijd het cellofaan membraan van de fungal cultuur met een steriel scheermesje vierkantjes cellofaan te verkrijgen met een schimmel kolonie op elk membraan. Haal het cellofaan pleinen met schimmeldraden van de vaste medium met behulp van een tang en breng het plein van cellofaan met schimmeldraden om een ​​put van de microplaat met de bacteriële suspensie. </li><li> Schud de microplaat, terwijl de schimmel kolonies nog steeds aan het cellofaan zijn bevestigd; Vervolgens, verwijder het cellofaan vellen, waarbij de schimmel kolonies in de plaat. </li><li> Incubeer de microplaat zacht schudden (~ 60 opm) bij een temperatuur aangepast aan de onderzochte micro-organismen. Opmerking: De incubatietijd afhankelijk van de snelheid van vestiging van de biofilm en de fase te analyseren. Voor P. fluorescens BBc6 / L. bicolor, incuberen bij 20 ° C gedurende 30 min om beginnende biofilms komen en tot 16 uur om volwassen biofilms. </li></ol> 3. laser scanning confocale microscopie Analyse van de biofilm Formation <ol><li> monstervoorbereiding <ol><li> Om planktonische bacteriën en bacteriën elektrostatisch aan de hyfen en spoel vervolgens de schimmel door deze naar een nieuwe 6-well microplaat gevuld met 5 ml van een sterke zoutoplossing (NaCl, 17 g / l) 17; schud gedurende 1 min. </li><li> Breng de schimmel een nieuwe 6-well microplaat met 5 ml steriele 0,1 M kaliumfosfaatbuffer, schud gedurende 2 minuten, en breng de schimmel verse kaliumfosfaatbuffer. </li><li> Snijd het deel van de schimmelkolonie af te beelden met een scalpel houd hem in de kaliumfosfaatbuffer, zodat het verkregen gedeelte bevat ongeveer de helft van de schimmelkolonie. </li><li> Om het monster vlek, overbrengen naar een petrischaal gevuld met steriel water met een geschikte fluorescerende kleurstof (afhankelijk van het doel van de analyse) en incubeer in het donker. <ol><li> Schimmelwoekering netwerk visualiseren, gebruikt bijvoorbeeld Congo Red (0,1% uiteindelijke concentration, 5 min incubatie), tarwekiemen agglutin (WGA) lectine geconjugeerd met Alexa Fluor 633 (10 ug / ml eindconcentratie, 10 min incubatie) of FUNC1 (10 uM eindconcentratie, 10 min incubatie). </li><li> Als een niet-fluorescerend-gemerkte bacterie, tegenkleuring de bacteriële cellen met een DNA-specifieke fluorescente probe onder de talrijke cel-permeant DNA kleurstoffen handel verkrijgbaar. Gebruik bijvoorbeeld DAPI (0,25 ug / ml uiteindelijke concentratie, 10 min incubatie). </li><li> Om de matrix eiwitten te visualiseren, gebruik maken van een eiwit vlek 21. </li></ol></li><li> Na het kleuren Spoel het monster door deze naar een petrischaal deksel met 10 ml steriele 0,1 M kaliumfosfaat en schud gedurende 1 min. </li><li> Half onderdompelen een dia in de petrischaal deksel en subtiel breng de snede boven de dia te zweven. Dan, langzaam verwijderen van de dia uit de buffer oplossing, waardoor het monster om voorzichtig te vestigen op de dia. <li> Tot slot, voeg 10 ul van anti-fading montage medium om het monster en bedek het met een glazen dekglaasje. Opmerking: Als de dia wordt bereid, de microscopische analyse worden zo snel mogelijk uitgevoerd (binnen ten hoogste 30 min) tot wijziging van de biofilm niet stevig. </li></ol></li><li> Confocale microscopische analyse <ol><li> Onderzoek de objectglaasjes onder een confocale laser microscoop met 10x of 40X objectief gekoppeld beeldverwerkingssoftware. Opmerking: Hier, een multi-beam scanning confocale microscoop met 405, 488 en 561 nm excitatie lasers, een GaAsP PMT-detector en 10x NA 0,3 en 40x NA 1,2 doeleinden gebruikt. <ol><li> Voeren beeldvorming met parameters aangepast aan het type van de gevraagde data en de tijd bedwingt. Met laser excitatie / emissie golflengten volgens de vlek gebruikt en recommendati de fabrikantons. Gebruik een combinatie van de tegel scan en de Z-stack functies om globale 3D-weergave van de schimmel kolonie en de biofilms te verkrijgen. Opmerking: De afbeelding in figuur 3 werden verkregen met de volgende parameters: 8-bit / pixel, gemiddelde = 2, pixelverblijftijd = 1,58 usec, tegels scannen van 5x5 beelden met online stiksel (10% dekking drempel = 0,7); Z-stap = 2 urn. </li></ol></li><li> Voor 3D-data visualisatie, een van de vele gratis of commerciële software (deze bieden veel mogelijkheden voor 3D-rendering). <ol><li> Als u bijvoorbeeld Z-stack gegevens als 2D maximale intensiteit projecties weer te geven, af te trekken van de bright-field-kanaal, de helderheid en het contrast aan te passen, en kanalen samen te voegen om een ​​samengesteld beeld te creëren. Indien die aanwezig zijn, te elimineren plakken zonder signaal aan de Z-stack uiteinden. Voer vervolgens een 2D maximale intensiteit projectie en zetten het resultaat in RGB kleuren. Gebruik de functie &quot;Z project&quot; in de ImageJ software 22 om de beelden te verkrijgen phier woordigd door 2D maximale intensiteit projecties. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Electron Microscopy Analyse <ol><li> Bereid de monsters zoals beschreven voor LSCM, behalve in stap 3.1.2, de biofilms dragen aan steriel water plaats kaliumfosfaatbuffer na het spoelen stappen. Dit voorkomt de vorming van zoutkristallen in de dehydratatiestap, die SEM beeldvorming zou verstoren. </li><li> Breng de biofilms om een ​​monster houder en verwijder overtollig water; staan ​​alleen een klein vlies van water om het monster te dekken. </li><li> Breng het monster op de kamer van een variabele druk scanning elektronenmicroscoop (VP-SEM); bevriezen tot -50 ° C op een Peltier koelstap; en laat het langzaam vriesdrogen, direct in het SEM kamer met 100 Pa van variabele druk ingesteld op 15 uur. </li><li> Na voltooiing van de vriesdrogen, ophalen van de monster en het in een hoog-vacuum film afzettingssysteem. Coat het monster met 2 nm van geplatim (kwarts meting) onder argon plasma (2,5 x 10 -2 mbar, 35 mA). </li><li> Let op de gecoate monster met een SEM uitgerust met een veld emissie pistool (FEG) met de hoge resolutie &quot;in lens&quot; detector en een elektronisch hoge spanning van 1 kV. </li></ol>

<ol><li>Frey-Klett, P., Burlinson, P., Deveau, A., Barret, M., Tarkka, M., Sarniguet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial-Fungal+Interactions%3A+Hyphens+between+Agricultural%2C+Clinical%2C+Environmental%2C+and+Food+Microbiologists%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacterial-Fungal Interactions: Hyphens between Agricultural, Clinical, Environmental, and Food Microbiologists.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 75 (4), 583-609 (2011).</li>
<li>Scherlach, K., Graupner, K., Hertweck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+bacteria-fungi+interactions%3A+effects+on+environment%2C+food%2C+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular bacteria-fungi interactions: effects on environment, food, and medicine.</a> Annu. Rev. Microbiol. 67, 375-397 (2013).</li>
<li>Schroeckh, V., Scherlach, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intimate+bacterial-fungal+interaction+triggers+biosynthesis+of+archetypal+polyketides+in+Aspergillus+nidulans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Intimate bacterial-fungal interaction triggers biosynthesis of archetypal polyketides in Aspergillus nidulans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (34), 14558-14563 (2009).</li>
<li>Hogan, D. A., Wargo, M. J., Beck, N. Bacterial Biofilms on Fungal Surfaces. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHogan%2C+DA+%22Biofilm+mode+of+life%3A+mechanisms+and+adaptations%22">Biofilm mode of life: mechanisms and adaptations</a>. 13, 235-245 (2007).</li>
<li>Hogan, D. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+-+Candida+interactions%3A+an+ecological+role+for+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas - Candida interactions: an ecological role for virulence factors.</a> Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).</li>
<li>Jayasinghearachchi, H. S., Seneviratne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+mushrooms+fix+atmospheric+nitrogen%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Can mushrooms fix atmospheric nitrogen?</a> J. Biosci. 29 (3), 293-296 (2004).</li>
<li>Seneviratne, G., Zavahir, J. S., Weerasekara, W. M. M. S., Bandara, M. L. M. A. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s11274-007-9539-8">Fungal-bacterial biofilms their development for novel biotechnological applications.</a> World J Microbiol Biotechnol. , 739-743 (2008).</li>
<li>Herath, H. M. L. I., Upamali, A., Vithanage, M., Seneviratne, G. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/02757540.2013.861828">Developed fungal - bacterial biofilms as a novel tool for bioremoval of hexavelant chromium from wastewater.</a> Chem. Ecol. 00 (0), 1-10 (2014).</li>
<li>Macedo, A. J., Kuhlicke, U., Neu, T. R., Timmis, K. N., Abraham, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+stages+of+a+biofilm+community+developing+at+the+liquid-liquid+interface+between+polychlorinated+biphenyls+and+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Three stages of a biofilm community developing at the liquid-liquid interface between polychlorinated biphenyls and water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (11), 7301-7309 (2005).</li>
<li>Da Silva, W. J., Seneviratne, J., Samaranayake, L. P., Del Bel Cury, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactivity+and+architecture+of+Candida+albicans+biofilms+developed+on+poly%28methyl+methacrylate%29+resin+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+-+Part+B+Appl.+Biomater%22%5BJournal%5D)">Bioactivity and architecture of Candida albicans biofilms developed on poly(methyl methacrylate) resin surface.</a> J. Biomed. Mater. Res. - Part B Appl. Biomater. 94 (1), 149-156 (2010).</li>
<li>Flemming, H., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nrmicro/journal/v8/n9/abs/nrmicro2415.html">The biofilm matrix.</a> Nat. Publ. Gr. 8 (9), 623-633 (2010).</li>
<li>Cerca, N., Gomes, F., Pereira, S., Teixeira, P., Oliveira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+scanning+microscopy+analysis+of+S.+epidermidis+biofilms+exposed+to+farnesol%2C+vancomycin+and+rifampicin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">Confocal laser scanning microscopy analysis of S. epidermidis biofilms exposed to farnesol, vancomycin and rifampicin.</a> BMC Res. Notes. 5, 244(2012).</li>
<li>Lepanto, P., Lecumberry, F., Rossello, J., Kierbel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+confocal+microscopy+image+analysis+method+to+measure+adhesion+and+internalization+of+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+structures+into+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">A confocal microscopy image analysis method to measure adhesion and internalization of Pseudomonas aeruginosa multicellular structures into epithelial cells.</a> Mol. Cell. Probes. 28 (1), 1-5 (2014).</li>
<li>Mueller, L. N., de Brouwer, J. F. C., Almeida, J. S., Stal, L. J., Xavier, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+marine+phototrophic+biofilm+by+confocal+laser+scanning+microscopy+using+the+new+image+quantification+software+PHLIP%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ecol%22%5BJournal%5D)">Analysis of a marine phototrophic biofilm by confocal laser scanning microscopy using the new image quantification software PHLIP.</a> BMC Ecol. 6, (2006).</li>
<li>Murray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+imaging+thick+specimens%3A+Confocal+microscopy%2C+deconvolution%2C+and+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Methods for imaging thick specimens: Confocal microscopy, deconvolution, and structured illumination.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 6 (12), 1399-1437 (2011).</li>
<li>Toljander, J. F., Artursson, V., Paul, L. R., Jansson, J. K., Finlay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+different+soil+bacteria+to+arbuscular+mycorrhizal+fungal+extraradical+hyphae+is+determined+by+hyphal+vitality+and+fungal+species%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Attachment of different soil bacteria to arbuscular mycorrhizal fungal extraradical hyphae is determined by hyphal vitality and fungal species.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 254, 34-40 (2006).</li>
<li>Brandl, M. T., Carter, M. Q., Parker, C. T., Chapman, M. R., Huynh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+Biofilm+Formation+on+Aspergillus+niger+Involves+Cellulose+-+Chitin+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Salmonella Biofilm Formation on Aspergillus niger Involves Cellulose - Chitin Interactions.</a> PLoS One. 6 (10), (2011).</li>
<li>Balbontín, R., Vlamakis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutualistic+interaction+between+Salmonella+enterica+and+Aspergillus+niger+and+its+effects+on+Zea+mays+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Biotechnol.+Publ%22%5BJournal%5D)">Mutualistic interaction between Salmonella enterica and Aspergillus niger and its effects on Zea mays colonization.</a> Microb. Biotechnol. Publ. , (2014).</li>
<li>Frey-Klett, P., Garbaye, J., Tarkka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mycorrhiza+helper+bacteria+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The mycorrhiza helper bacteria revisited.</a> New Phytol. 176 (1), 22-36 (2007).</li>
<li>Deveau, A., Brulé, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+fungal+trehalose+and+bacterial+thiamine+in+the+improved+survival+and+growth+of+the+ectomycorrhizal+fungus+Laccaria+bicolor+S238N+and+the+helper+bacterium+Pseudomonas+fluorescens+BBc6R8%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Role of fungal trehalose and bacterial thiamine in the improved survival and growth of the ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor S238N and the helper bacterium Pseudomonas fluorescens BBc6R8.</a> Environ. Microbiol. Rep. 2 (4), 560-568 (2010).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+Techniques+for+In+Situ+Analysis+of+the+Biofilm+Matrix+%28Structure%2C+Composition%2C+Dynamics%29+by+Means+of+Laser+Scanning+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Advanced Techniques for In Situ Analysis of the Biofilm Matrix (Structure, Composition, Dynamics) by Means of Laser Scanning Microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 1147, 43-64 (2014).</li>
<li>Rasband, W. S. imagej. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://imagej.nih.gov/ij">http://imagej.nih.gov/ij</a> (2016).</li>
<li>Berggren, K. N., Schulenberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+formulation+of+SYPRO+Ruby+protein+gel+stain%3A+Comparison+with+the+original+formulation+and+with+a+ruthenium+II+tris+%28bathophenanthroline+disulfonate%29+formulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">An improved formulation of SYPRO Ruby protein gel stain: Comparison with the original formulation and with a ruthenium II tris (bathophenanthroline disulfonate) formulation.</a> Proteomics. 2 (5), 486-498 (2002).</li>
<li>Pantanella, F., Valenti, P., Natalizi, T., Passeri, D., Berlutti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+techniques+to+study+microbial+biofilm+on+abiotic+surfaces%3A+pros+and+cons+of+the+main+techniques+currently+in+use%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+di+Ig%22%5BJournal%5D)">Analytical techniques to study microbial biofilm on abiotic surfaces: pros and cons of the main techniques currently in use.</a> Ann. di Ig. 25 (1), 31-42 (2013).</li>
<li>Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), (2011).</li>
<li>Azevedo, N. F., Lopes, S. P., Keevil, C. W., Pereira, M. O., Vieira, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+to+%26%2334%3Bgo+large%26%2334%3B+on+biofilm+research%3A+Advantages+of+an+omics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Time to &#34;go large&#34; on biofilm research: Advantages of an omics approach.</a> Biotechnol. Lett. 31 (4), 477-485 (2009).</li>
<li>Koerdt, A., Orell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+fingerprinting+of+Sulfolobus+species+in+biofilm%3A+A+transcriptomic+and+proteomic+approach+combined+with+spectroscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Macromolecular fingerprinting of Sulfolobus species in biofilm: A transcriptomic and proteomic approach combined with spectroscopic analysis.</a> J. Proteome Res. 10 (9), 4105-4119 (2011).</li>
<li>Morgenroth, E., Milferstedt, K. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s11157-009-9163-1">Biofilm engineering: Linking biofilm development at different length and time scales.</a> Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 8 (3), 203-208 (2009).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+techniques%2C+sensors%2C+and+approaches+for+imaging+biofilms+at+different+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales.</a> Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).</li>
<li>Xi, C., Marks, D., Schlachter, S., Luo, W., Boppart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+three-dimensional+imaging+of+biofilm+development+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">High-resolution three-dimensional imaging of biofilm development using optical coherence tomography.</a> J. Biomed. Opt. 11 (3), 34001(2006).</li>
<li>Janjaroen, D., Ling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+ionic+strength+and+biofilm+roughness+on+adhesion+kinetics+of+Escherichia+coli+onto+groundwater+biofilm+grown+on+PVC+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Roles of ionic strength and biofilm roughness on adhesion kinetics of Escherichia coli onto groundwater biofilm grown on PVC surfaces.</a> Water Res. 47 (7), 2531-2542 (2013).</li>
<li>Derlon, N., Koch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+metazoa+governs+biofilm+structure+formation+and+enhances+permeate+flux+during+Gravity-Driven+Membrane+%28GDM%29+filtration%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Activity of metazoa governs biofilm structure formation and enhances permeate flux during Gravity-Driven Membrane (GDM) filtration.</a> Water Res. 47 (6), 2085-2095 (2013).</li>
<li>Karcz, J., Bernas, T., Nowak, A., Talik, E., Woznica, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+lyophilization+to+prepare+the+nitrifying+bacterial+biofilm+for+imaging+with+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Application of lyophilization to prepare the nitrifying bacterial biofilm for imaging with scanning electron microscopy.</a> Scanning. 34 (1), 26-36 (2012).</li>
<li>Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microplate+spectrofluorometric+assay+for+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ind.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms.</a> J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34 (1), 1-4 (2007).</li>
<li>Berne, C., Ducret, A., Hardy, G. G., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesins+Involved+in+Attachment+to+Abiotic+Surfaces+by+Gram-Negative+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Spectr%22%5BJournal%5D)">Adhesins Involved in Attachment to Abiotic Surfaces by Gram-Negative Bacteria.</a> Microbiol. Spectr. 3 (4), 1-45 (2015).</li>
<li>Schlafer, S., Garcia, J. E., Greve, M., Raarup, M. K., Nyvad, B., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+with+C-SNARF-4%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li>
<li>Daddi Oubekka, S., Briandet, R., Fontaine-Aupart, M. P., Steenkeste, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+time-resolved+fluorescence+microscopy+to+assess+antibiotic+diffusion-reaction+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Correlative time-resolved fluorescence microscopy to assess antibiotic diffusion-reaction in biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 56 (6), 3349-3358 (2012).</li>
<li>Almeida, C., Azevedo, N. F., Santos, S., Keevil, C. W., Vieira, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discriminating+multi-species+populations+in+biofilms+with+peptide+nucleic+acid+fluorescence+in+situ+hybridization+%28PNA+FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Discriminating multi-species populations in biofilms with peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization (PNA FISH).</a> PLoS One. 6 (3), (2011).</li>
<li>Malic, S., Hill, K. E., Hayes, A., Percival, S. L., Thomas, D. W., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+specific+bacteria+in+wound+biofilms+using+peptide+nucleic+acid+fluorescent+in+situ+hybridization+%28PNA+FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH).</a> Microbiology. 155 (8), 2603-2611 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Bacteriële biofilms worden opgehaald in veel omgevingen en zijn onderzocht sinds de jaren 1950, leidt tot de ontwikkeling van een aantal werkwijzen om ze 24 te analyseren. Klassieke methoden te kwantificeren en te controleren biofilms onder meer micro-titer assays en, het meest gebruikte methode, crystal violet (CV) kleuring. Deze methoden zijn snel, goedkoop en gemakkelijk te hanteren en 25 zijn bijzonder nuttig aan totale biofilm biomassa kwantificeren of levensvatbaarheid en kwantificatie matrix assays. Op een andere kant, &quot;omics&quot; werkwijzen zijn eveneens nuttig bij biofilm studies, waardoor kwantitatieve en functionele analyse van biofilms 26, 27. Ondanks de voordelen van micro-titer plaat en &#39;omics&#39; methoden, kan een aantal essentiële kenmerken van biofilms niet worden vastgelegd met deze technieken, belemmeren een volledig begrip van dit proces. Dergelijke functies zijn onder meer matrixstructuurs, bacteriële kolonie architecturen cel / cel-interacties, en kolonisatiepatronen die sleutelgegevens voor het begrijpen van zowel de werking van biofilms en de dynamiek van hun vorming zijn. Ondanks het vermogen van microscopie deze functies vangen, microscopie analyse van bacteriële biofilms op filamenteuze schimmels nog schaars. Dit komt vooral door de groei van draadvormige schimmels, die vaak vormt kolonies dikke, complexe, driedimensionale netwerken. Vorming van bacteriële biofilms op schimmels is gebruikelijk in diverse omgevingen en wordt sterk betrokken bij diverse gebieden 4 (bijvoorbeeld, geneeskunde, landbouw en milieu.); derhalve is het essentieel om nieuwe methoden voor het onderzoek te vergemakkelijken. Hiervoor combineerden we een methode om zeer dunne schimmelkolonies microscopische beeldvorming van de bacteriële biofilms genereren. Daarnaast stelden we een set van microscopie tools waarmee kwalitatief te analyseren die biofilms. Het succes van de werkwijze berust ophet vermogen om zeer dunne hyfen kolonies produceren en passende kleurstoffen toegepast. Deze punten worden hieronder besproken. Wegens de complexe structuur van de biofilms, het begrijpen van hun functie vereist een meerschalige benadering 28, 29. Distributie patronen van de biofilms, bacteriële kolonie architectuur, en de matrix-structuur en samenstelling worden geanalyseerd op verschillende schalen (dwz, meso-schaal en de micro-schaal). Bovendien nanoschaal resolutie biedt toegang tot de cel / cel fysieke interactie en de nano-structuur van de matrix. Aldus ontwikkelde methode kan gemakkelijk een meerschalige analyse van de bacteriële biofilms gevormd op de schimmelkolonie. In de meeste studies LSCM analyses van biofilms zijn beperkt tot de micro-schaal de mesoschaal gewoonlijk uitgevoerd door optische coherentie tomografie 30, 31, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 32. De hier gepresenteerde methode maakt het mogelijk zowel micro- en meso-schaal analyses door LSCM. Het toont de bruikbaarheid van combinatie van beide analyses in hetzelfde gebied van het monster en zelfs op dezelfde afbeelding met nieuwe generatie confocale microscopen met hoge resolutie (Figuur 3). Dus, kwesties in verband met verzamelde gegevens verzameld op verschillende schalen met verschillende methoden hier worden vermeden. Deze combinatie van analyse gaf gelijktijdig toegang tot de biofilm verdeling over de schimmelkolonie de bacteriële kolonie architectuur langs de ontwikkelende biofilm en de matrixstructuur. De mesoschaal analyse toonde een heterogene verdeling van de bacteriële biofilms op de schimmelkolonies (figuren 2 en 3). Deze observatie zou niet mogelijk zijn met protocollen die slechts beeldvorming van een klein gedeelte van de schimmelkolonie, die niet noodzakelijkerwijs representatief voor het gehele kolonie mogelijk. Dus, terwijlvaak verwaarloosd, het meso-schaal analyse kan waardevolle informatie over biofilm distributie patronen geven. Tenslotte kan de ontwikkelde methode worden gebruikt om monsters met verschillende microscopische technieken, waaronder scanning elektronenmicroscopie geanalyseerd. Hier, SEM werd gebruikt om de nano-schaal te bereiken en om de bacteriële ruimtelijke organisatie in de biofilm verkrijgen. Het presteerde zeer goed met de dunne schimmel kolonies, terwijl de SEM alleen toegestaan ​​beeldvorming aan het oppervlak. In tegenstelling tot LSCM, SEM echter vereist steekproef uitdroging en, meestal, bekleden met een geleidend metaal. Dit droogproces kan biologische structuren veranderen als het niet goed is uitgevoerd en kan optimalisatie nodig. Hier, steekproef uitdroging langzame vriesdrogen werd gebruikt 33. Niettemin toepassing zowel LSCM SEM en de monsters zullen de prestaties van correlatieve microscopie op dezelfde plaats van het monster mogelijk. Ondanks de voordelenhierboven beschreven, bestaan ​​enkele beperkingen. Ten eerste kan het niet voor alle soorten schimmels. Inderdaad is deze kweken methode ontwikkeld om schimmels verspreiden radiaal op het oppervlak van de vaste media. Deze methode niet geschikt voor het vormen van schimmels voornamelijk lucht hyfen (bijvoorbeeld Fusarium sp.) Of micro-aerobe schimmels verspreiden hoofdzakelijk binnen agar. Bovendien kunnen schimmels verval cellofaan ook problematisch zijn (bijv., Trichoderma sp.). Ten tweede is het belangrijk op te merken dat de kleuring strategie is een kritisch punt en de keuze van de vlek moeten zorgvuldig worden gemaakt, omdat de vlek de biofilm niet mag verstoren. Zo hebben we geconstateerd dat Calcofluor White veroorzaakt gedeeltelijke biofilm verstoring (gegevens niet getoond), waarschijnlijk vanwege de hoge pH van deze kleurstof. Ook sommige kleurstoffen verkregen heterogene kleuring (bijv., Congo rood), terwijl andere geproduceerde homogene kleuring (bv., Celwand kleuring met lectine WGA), waardoor een heterogene beeldkwaliteit.Bovendien is het belangrijk te weten dat sommige kleurstoffen niet helemaal specifiek kunnen zijn. Bijvoorbeeld, WGA vlekken niet alleen schimmel celwanden, als N-acetylneuraminezuur in gram-positieve bacteriële celwanden en adhesinen geproduceerd door Gram-positieve en -negatieve bacteriën tijdens biofilmvorming 34, 35. Daarom worden bij fluorescerend eiwit hebben bacteriën en / of schimmels wordt aanbevolen om meerdere vlekken voorkomen. Als meerdere kleurstoffen worden gebruikt, moeten deze niet chemisch interfereren en hun emissiespectra overlappen niet. Mesoschaal analyses vereisen een groot scangebied, en daarom kan LSCM tijdrovende (40 min tot 1 uur, afhankelijk van het monster dikte) en knelpunt de analyse van een groot aantal monsters. Desalniettemin kunnen aanpassingen worden aangebracht, afhankelijk van het type gegevens vereist. Het is mogelijk acquisitietijd en het verkleinen van het veranderen van de beeldkwaliteit. Bijvoorbeeld, hoge resolutieis niet nodig om de biofilm algemene verdeling analyseren. Ten slotte moet een aantal beperkingen te worden overwogen bij de keuze om Z- stack gegevens als 2D of 3D projecties weer te geven. Tweedimensionale projecties zijn een goede manier om gegevens samen te vatten, maar diepgaande informatie verloren gaat, en overlappende structuren worden verborgen. Aan de andere kant, 3D-projecties laat de visualisatie vanuit verschillende standpunten, maar ze maken vaak slecht in het geval van ruimtelijke complexiteit. Concluderend, hebben wij een werkwijze voor de karakterisering van bacteriële biofilms op hyfen op structureel niveau gerapporteerd. De methodologie kan worden uitgebreid tot andere toepassingen. Inderdaad, maakt deze werkwijze het uitvoeren van functionele of chemische karakterisering van bacteriële biofilms vormen op schimmeldraden. Vanwege de grote verscheidenheid aan fluorescerende reporter bestaande systemen kunnen LSCM analyse worden gebruikt voor meerdere doeleinden 29. Bijvoorbeeld, de fluorescentie microscopy kan worden gebruikt om de pH gradiënt 36 of molecuul diffusie in biofilms 37 volgen. Daarnaast is de methode maakt het mogelijk voor de gemeenschap analyse multispecies biofilms. Bijvoorbeeld, fluorescentie in situ hybridisatie gericht op specifieke bacteriële groepen is bijzonder nuttig om specifieke bacteriële verdeling bestuderen meerdere soorten biofilms 38, 39. Ten slotte talrijke fluorescente kleurstoffen kunnen worden gebruikt om de matrix van de samenstelling biofilms 21 karakteriseren. Hier werden eiwitten gevist met Sypro, die een groot aantal eiwitten, waaronder matrixeiwitten vlekken (figuur 4), maar ook andere kleurstoffen mogelijk maken de visualisatie van andere belangrijke matrix componenten, zoals exopolysacchariden of extracellulaire DNA. Interessant zouden al deze analyses worden uitgevoerd op mesoschaal met de beschreven werkwijze. Omdat LSCM kunnen worden uitgevoerd op levende samples,Het is ook mogelijk om time-lapse imaging realiseren met bijvoorbeeld coverwell kamers, bijzonder geschikt voor dunne schimmelkolonies. Deze optie is met name interessant, omdat biofilmvorming is een complex, dynamisch proces. Tenslotte een kwantitatieve doel, de gerapporteerde werkwijze kan de nauwkeurigheid van automatische kwantitatieve analyse verbeteren door kwantificering mogelijk mesoschaal beelden. Dit kan biofilm heterogeniteit en statistische kwesties 29 overwinnen.

Schimmels en bacteriën hebben veel mogelijkheden om te communiceren met elkaar, omdat ze samenwonen in de meeste terrestrische omgevingen. Door hun diversiteit en hun alomtegenwoordigheid, deze interacties zijn belangrijk in vele biologische gebieden, met inbegrip van de biotechnologie, de landbouw, de verwerking van levensmiddelen en medicijnen 1, 2. Moleculaire interacties vereisen een zekere mate van nabijheid van uitwisselingen tussen de partners mogelijk, en in sommige gevallen, een fysische associatie van de partners is noodzakelijk voor een functionele interactie 3. Een gemeenschappelijke fysische associatie tussen bacteriën en schimmels is de vorming van bacteriële biofilms op schimmels oppervlakken 4. Deze directe contact tussen bacteriecellen en schimmeldraden maakt intieme interacties die betrokken zijn bij verschillende biologische processen. Bijvoorbeeld, in de geneeskunde, de studie van biofilmvorming van Pseudomonas aeruginosa op in de gelegenheidtunistic schimmel pathogeen Candida albicans kan inzicht in het verband tussen de vorming en de virulentie 5 biofilm te bieden. In de landbouw, studies suggereren dat de plantengroei-bevorderende rhizobacteriën en biocontrolebacteriën hebben een verhoogde efficiëntie bij het in verband met een schimmel in een gemengde biofilm. Zo hebben Bradyrhizobium elkanii verbeterd N 2 -fixing activiteit wanneer geassocieerd met Pleurotus ostreatus in een gemengde biofilm 6. Ten slotte bioremediatie, bacteriële schimmel- gemengde biofilms zijn gebruikt voor de sanering van verontreinigde plaatsen 7, 8. LSCM is bijzonder geschikt om biofilms te bestuderen aangezien het voor een drie-dimensionale waarneming van levende gehydrateerd biofilms met minimale voorbehandelingen, waardoor biofilm structuur en organisatie handhaven. Zo biofilm analyse door LSCM is zeer informatief, vooral voor detHermelijn het tijdsverloop van de vorming van biofilm en de detectie van karakteristieke fases 9, 10, van de hechting stap naar de ontwikkeling van een volwassen biofilm. Het is ook bijzonder geschikt voor de biofilmstructuur en matrix 11, 12 visualiseren of de biofilm maat 13, 14 kwantificeren. Hoewel deze methode is geschikt om biofilms te bestuderen op abiotische of dunne biotische oppervlakken, het bestuderen van bacteriële biofilm op een schimmel draadvormige kolonie is nog steeds erg uitdagend. Inderdaad, de meeste filamenteuze schimmels bouwen dikke, complexe, driedimensionale netwerken in kweek. Zelfs als dikke objecten kunnen worden afgebeeld door confocale microscopie, de verzwakking van de laser penetratie en de fluorescentie-emissie verminderen vaak de kwaliteit van de uiteindelijke beelden gedurende een diepte van 50 urn 15. Omdat bovendien schimmelkolonies niet star, iHet is moeilijk om de micro-organismen verwerken zonder het verstoren biofilms. Door de dikte van de monsters, worden de weinige microscopische analyses van bacteriële biofilms op schimmeldraden meestal alleen uitgevoerd op een klein deel van de schimmelkolonie derhalve met slechts enkele hyfen 16, 17, 18. Dit alles beperkt ons vermogen om biofilm verdeling beschrijven de schimmelkolonie en dus biases brengen in de analyse bij de heterogene verdeling van de biofilm in de schimmelkolonie. Om dergelijke moeilijkheden te overwinnen, beschrijven we een werkwijze voor de groei en de analyse van bacteriële biofilm op schimmeldraden. Deze methode werd gebruikt voor de biofilmvorming bestuderen Pseudomonas fluorescens BBc6 de hyfen van de ectomycorrhiza basidiomyceet Laccaria bicolor S238N. Deze twee bos-bodem micro-organismen werden eerder beschreven gemengd te vormenbiofilm-achtige structuren 19, 20. Deze werkwijze kan gemakkelijk verder worden aangepast aan andere filamenteuze schimmels / bacteriële systemen. De hier gepresenteerde methode is gebaseerd op de combinatie van een schimmel kweekmethode, waardoor de groei van zeer dunne schimmelkolonies met LSCM en SEM beelden. Daardoor konden we micro- (um bereik) te verkrijgen en meso- (enkele mm) schaal uitzicht op de interactie tussen de twee micro-organismen, waardoor de kwalitatieve karakterisering van de biofilm. We toonden ook aan dat de monsters kunnen worden waargenomen met SEM, waardoor structurele analyse van de biofilm op nano-schaal niveau (nm).

<table><tbody><tr><td>6 well Falcon Tissue Culture Plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-33</td><td>Gebruikt in 2.2 &amp; 3.1</td></tr><tr><td>Congo Red</td><td>Fisher Scientific</td><td>C580-25</td><td>Gebruikt in 3.1.4.1</td></tr><tr><td>FUN 1 Cell Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F7030</td><td>Gebruikt in 3.1.4.1</td></tr><tr><td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W21404</td><td>Gebruikt in 3.1.4.1</td></tr><tr><td>DAPI solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62248</td><td>Gebruikt in 3.1.4.2</td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td>Gebruikt in 3.1.4.3</td></tr><tr><td>FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix protein Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F10318</td><td>Gebruikt in 3.1.4.4</td></tr><tr><td>Fluoromount-G Slide Mounting Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>OB100-01</td><td>Gebruikt in 3.1.7</td></tr><tr><td>LSM780 Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Gebruikt in 3.2.1</td></tr><tr><td>ZEN 2.1 lite black software&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Gebruikt in 3.2.1</td></tr><tr><td>High Vacuum Coater Leica EM ACE600</td><td>Leica</td><td></td><td>Gebruikt in 4</td></tr><tr><td>GeminiSEM-FEG</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Gebruikt in 4</td></tr></tbody></table>

een nieuwe methode voor kwalitatieve multi-schaal analyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcel koloniën met behulp van confocale en electron microscopy

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacteriële biofilms vormen vaak op schimmels oppervlakken en kunnen betrokken zijn bij talrijke bacteriële schimmel interactie processen, zoals metabolische samenwerking, competitie of predatie. De studie van biofilms is belangrijk in vele biologische gebieden, met inbegrip van milieu-wetenschap, de productie van levensmiddelen en medicijnen. Echter slechts weinig studies gericht op dergelijke bacteriële biofilms, mede door de moeilijkheid onderzoek ervan. De meeste van de methoden voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyses biofilm in de literatuur beschreven zijn alleen geschikt voor het vormen van biofilms op abiotische oppervlakken of homogene en dunne biotische oppervlakken, zoals een monolaag van epitheelcellen. Terwijl laser scanning confocale microscopie (LSCM) vaak gebruikt voor het analyseren in situ en in vivo biofilms, deze technologie zeer moeilijk wordt wanneer toegepast om bacteriële biofilms op schimmeldraden, door de dikte en de drie dimensies van de hyphale networks. Tot op heden is, ontwikkelden we een protocol combineert microscopie met een werkwijze om de ophoping van schimmeldraden lagen in schimmelkolonies beperken. Bij deze methode konden we de ontwikkeling van bacteriële biofilms op schimmeldraden op verschillende schalen gebruikt zowel LSCM en scanning elektronenmicroscopie (SEM) onderzocht. Dit rapport beschrijft het protocol, met inbegrip van micro-organisme culturen, bacteriële biofilmvorming voorwaarden, biofilm kleuring en LSCM en SEM visualisaties.

De algemene schematische procedure van fungale cultuur biofilm bereidingswijze is aangegeven in figuur 1. De kweekmethode liet ons toe om schimmel kolonies 20 tot 50 urn dik met een paar lagen van schimmeldraden, waardoor micro- en meso-schaal analyses van gehydrateerde levende biofilm met behulp van LSCM verkrijgen. De toepassing van de methode is toegestaan de overname van beelden van hoge kwaliteit van P. fluorescens BBc6 biofilms op L. bicolor schimmeldraden langs de vorming van de biofilm (figuren 2-4). De mesoschaal analyse van de biofilms toonde de heterogene verdeling van de biofilm P. fluorescens BBc6 de hyfen van L. bicolor S238N (figuren 2 en 3). Meso-schaal analyse ook toegestaan voor het volgen van de vorming van biofilm in de tijd (Figuur3) vanaf de eerste stappen, waarin slechts sommige bacteriën werden vastgemaakt aan hyfen (figuur 3a), de vorming van een dikke, volwassen biofilm (figuur 3b). De hoge resolutie van de mesoschaal beelden konden we micro-schaal analyse uit te voeren op dezelfde beelden om de kolonie architecturen (Figuur 3c - d) te verkrijgen. De micro-schaal analyse in combinatie met de specifieke etikettering stelde ons in staat om een ​​stap verder te gaan in de biofilm karakterisering. Hier, SYPRO Ruby 23, die de meeste klassen labels eiwitten, werd toegepast op de monsters (Figuur 4) en geeft de aanwezigheid van eiwitten in de matrix. Tenslotte verdere details van de biofilmstructuur werden verkregen door SEM beelden van hetzelfde monster na dehydratatie en bekleding (Figuur 5). SEM beeldvorming verschafttoegang tot de nanoschaal niveau, waardoor de toegang tot de matrixstructuur geven. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig1.jpg" /> Figuur 1: Algemeen schema procedure van schimmel cultuur en biofilm voorbereiding. Deze figuur beschrijft de belangrijkste stappen van de werkwijze van micro-organismen kweken analyses proeven. Meer details worden gegeven in het protocol. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig2.jpg" /> Figuur 2: BBc6 biofilm verdeling op de schimmelkolonie. Het monster werd in beeld gebracht na 18 h interactie op 10X vergroting. Het beeld werd verkregen via 2D maximale intensiteit projectie van 3D confocale microscopie beelden. De grijze raster op het Figure toont het mozaïek posities. L. bicolor hyfen worden gekleurd met Congo Red (rood) en bacteriën zijn GFP-tag (groen). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig3.jpg" /> Figuur 3: Vroege en late stadia van BBc6 biofilm formatie op L. bicolor schimmeldraden. Dit beeld werd verkregen via 2D maximale intensiteit projectie van 3D confocale microscopie beelden. Beeldvorming werd uitgevoerd bij 40x vergroting. (A) biofilms verdeling na 2 uur van interactie. (B) Biofilm verdeling na 14 uur van interactie. (C) Uitbreiding van de witte rechthoek in (a). (D) De uitbreiding van de witte rechthoek in (b). Schimmeldraden zijn gekleurd met Congo rood (rood) en bacteriën GFP-tagged (groen). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig4.jpg" /> Figuur 4: Matrix kleuring van BBc6 biofilm op L. bicolor schimmeldraden. (A) biofilms na 16 h interactie. (B) de uitbreiding van de witte rechthoek in (a). Beeldvorming werd uitgevoerd bij 40x vergroting, en deze beelden werden verkregen via 2D maximale intensiteit projectie van 3D confocale microscopie beelden. Bacteriën zijn GFP-tag (groen), is schimmel gekleurd met fun1 (donkergroen), en de eiwitten worden gekleurd met S. Ruby (rood). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Figuur 5: SEM beeldvorming van BBc6 biofilms op L. bicolor schimmeldraden. SEM Beeldvorming werd uitgevoerd bij 2360X, EHT: 1kV. Voor de beeldvorming, het monster langzaam gevriesdroogd in de SEM kamer en bekleed met platinum. Groene pijlen wijzen naar bacteriële biofilms en gele pijlen wijzen naar schimmeldraden. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode te groeien en kwalitatief analyseren bacteriële biofilms op schimmeldraden door confocale en elektronenmicroscopie.

Een nieuwe methode voor Kwalitatieve Multi-schaal analyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcel Koloniën met behulp van confocale en Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Het algemene doel van dit protocol is om microscopie te gebruiken om de vorming van bacteriële biofilms op filamenteuze hyfen te analyseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van microbiologie, zoals hoe bacteriële biofilms op hyfen worden gevormd, hoe specifiek ze zijn en waar ze uit bestaan. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de onderzoeking van bacteriële biofilmvorming op schimmelhyfen op meerdere schalen mogelijk maakt, van de nanometer tot de centimeterbereiken.De procedure zal worden gedemonstreerd door Cora Miquel Guennoc uit mijn laboratorium en Christophe Rose, de elektronenmicroscooptechnicus van INRA PTEF Platform. Om te beginnen, bereid cellofaanmembranen met dezelfde diameter als de petrischalen voor, en plaats ze vervolgens 30 minuten in kokend EDTA. Gebruik gedeïoniseerd water om de vellen te spoelen en steriliseer ze vervolgens twee keer.Om schimmelpre-culturen voor te bereiden, incubeer de schimmel op agarmedium, bedekt met een voorbehandeld EDTA-cellofaanmembraan. Incubeer de culturen bij optimale temperatuur om kolonies van ongeveer een centimeter in diameter te verkrijgen. Van de pre-cultuur, incubeer een petrischaal met geschikt agarmedium, bedekt met het EDTA-cellofaanmembraan door met een scalpel voorzichtig het buitenste gebied van een pre-cultuurkolonie te krabben en vervolgens de hyfen over te brengen naar de agarplaat.Incubeer de platen bij optimale temperatuur tot de kolonies ongeveer een centimeter in diameter zijn. Om bacterieculturen zoals P.fluorescens BBc6 te bereiden, gebruik een steriele lus om twee tot drie individuele bacteriekolonies van agarmedium te verzamelen en inoculeer 25 milliliter LB. Incubeer de cultuur bij optimale temperatuur overnacht. Nadat de bacteriën overnacht zijn gekweekt, centrifugeer de cultuur gedurende drie minuten bij 5.000 keer g.En suspendeer het pellet in 25 milliliter steriele 0,1 molaire kaliumfosfaatbuffer. Na herhaald centrifugeren, gebruik dezelfde buffer om de uiteindelijke bacterieconcentratie aan te passen tot 10 tot de negende cellen per milliliter. Vul een zes-putjes microplaat met vijf milliliter van de bacteriesuspensie.Gebruik een steriele scheermes om het cellofaanmembraan van de schimmelcultuur in vierkanten te snijden, met een enkele kolonie op elk membraan. Vervolgens, verwijder met pincetten voorzichtig cellofaanvierkanten die hyfen bevatten uit het vaste medium en breng ze over naar afzonderlijke putjes van de bacteriesuspensie. Schud voorzichtig de microplaat totdat de schimmelkolonies loskomen van het cellofaan.Verwijder vervolgens de cellofaanbladen en laat de schimmelkolonies in de plaat achter. Incubeer de microplaat met zachte agitatie bij 20 graden Celsius gedurende een tijd die afhankelijk is van de gebruikte stammen en het te analyseren stadium. Voor P.fluorescens BBc6 RA L.bicolor, incubeer de culturen gedurende 30 minuten om vroeg-stadium biofilms te krijgen, en gedurende maximaal 16 uur voor volwassen biofilms.Om planktonische bacteriën en bacteriën die elektrostatisch aan de hyfen zijn gehecht, te verwijderen, spoel de schimmel door deze over te brengen naar een nieuwe zes-putjes microplaat gevuld met sterke zout oplossing. Schud de plaat gedurende een minuut voorzichtig. Breng de schimmel over naar een nieuwe zes-putjes microplaat met vijf milliliter steriele 0,1 molaire kaliumfosfaatbuffer.Schud de plaat gedurende twee minuten voorzichtig en breng vervolgens de schimmel over naar verse buffer. Terwijl de schimmelkolonie in buffer wordt gehouden, gebruik een scalpel om de kolonie ongeveer doormidden te snijden. Breng de helft van de te kleuren kolonie over naar een petrischaal met één milliliter sterieel water, aangevuld met een geschikte fluorescente kleurstof om het schimmelnetwerk te visualiseren, zoals tarwekiemkwas geconjugeerd met Alexa Fluor 633.Incubeer vervolgens het monster in het donker. Na het kleuren, spoel het monster door het over te brengen naar een petrischaal deksel met 10 milliliter steriele 0,1 molaire kaliumfosfaatbuffer en schud gedurende één minuut voorzichtig. Dompel een dia half onder in de petrischaal en plaats het gesneden deel voorzichtig zodat het boven de dia drijft.Til vervolgens langzaam de dia uit de bufferoplossing, zodat het monster voorzichtig op de dia kan bezinken. Het meest delicate aspect is het positioneren van het monster op de dia. Om beschrijving van de biofilm te voorkomen, moeten het monster en de dia worden ondergedompeld tijdens het positioneren van het monster, en het monster mag niet meer worden bewogen voordat het wordt afgebeeld.Voeg ten slotte 10 microliter anti-blek montagemedium toe aan het monster en bedek het met een glazen dekglas. Bekijk de dia's onder een confocale lasermicroscoop met een 10x of 40x objectief. Gebruik een combinatie van tegelscan en Z-stack functies om globale, 3D-weergaven van de schimmelkolonie en de biofilms te verkrijgen.Voor elektronenmicroscopie, na het spoelen van de schimmel in sterke zout oplossing zoals eerder, breng de schimmel over naar sterieel water in plaats van buffer om de vorming van zoutkristallen tijdens de dehydratatie stap te voorkomen. Breng de biofilms over naar een monsterhouder en verwijder overtollig water. Breng vervolgens de monsters over naar de kamer van een variabele druk rasterelektronenmicroscoop.Op een Peltier-koeltafel, bevries het monster tot min vijftig graden Celsius, waardoor het langzaam kan uitdrogen direct in de SEM-kamer, met 100 Pascal variabele druk ingesteld voor 15 uur. Haal het monster eruit en breng het over naar een hoog vacuüm, filmdepositiesysteem. Bekleed vervolgens het monster met twee nanometer platina onder argonplasma.Bekijk het beklede monster met een rasterelektronenmicroscoop, met een veld emissie kanon met behulp van de hoge resolutie in-lens detector, en een elektronische hoge spanning van één kilovolt. Deze meso-schaal analyse van biofilms toont de heterogene verdeling van de biofilm van P.fluorescens BBc6 in groen op de hyfen van L.bicolor S238N, getoond in rood. De analyse maakte ook het volgen van de biofilmvorming in de tijd mogelijk, van de vroege stappen waarin alleen sommige GFP-gelabelde bacteriën aan de hy

a-new-method-for-qualitative-multi-scale-analysis-bacterial-biofilms

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We presenteren een protocol voor structurele en analyse van de samenstelling van natuurlijke orale biofilm van orthodontische apparatuur...

Orale Biofilm Analyse van de Palatal Expanders door middel van fluorescentie in-situ hybridisatie en confocale laser scanning microscopie

Wij bieden een eenvoudig, semi-kwantitatieve methode om biofilm vorming te...

Een semi-kwantitatieve benadering van biofilmvorming Met behulp van Gerimpelde Colony ontwikkeling te beoordelen

Source: Bucher, T., et. al., Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. J. Vis. Exp.(2016)This video demonstrates the preparation of mature bacterial biofilm colonies for high-resolution imaging. It covers fixation, dehydration, mounting, and metal coating steps to preserve and visualize biofilm morphology.

Preparation of Bacterial Biofilm Colonies for Morphological Analysis

Source: Miquel Guennoc, C., et al. New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the preparation of a fungal culture on treated cellophane membranes to support colony formation and radial growth. It then shows the cultivation and preparation of soil bacterial cells for interaction assays. Finally, it illustrates how bacterial cells adhere to the fungal colony...

Establishing a Fungal-Bacterial Co-culture for Biofilm Formation

This video describes a method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae using microscopy. Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and involve numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation.

A Method for Sample Preparation to Visualize Biofilm Forming Bacteria on Fungal Hyphae

Een protocol voor de gelijktijdige kwantificering en vergelijking van drie cellulaire en extracellulaire componenten binnen biofilms wordt gepresenteerd. De methodologie omvat het gebruik van confocale laserscanningmicroscopie, software voor biofilmstructuuranalyse en -visualisatie, en statistische analysesoftware.

Concurrent Kwantificering van Cellulaire en extracellulaire componenten van biofilms

Biofilms hebben complexe interacties met hun omgeving. Om biofiel-omgevingsinteracties grondig te onderzoeken, presenteren we hier een reeks methoden om een heterogene chemische omgeving te creëren voor biofilmontwikkeling, om lokale stroomsnelheid te kwantificeren en om massatransport in en rond biofilmkolonies te analyseren.

Methoden voor het karakteriseren van de co-ontwikkeling van biofilm en Habitat Heterogeniteit

We beschrijven fixatie, paraffine insluiten en dunne vectorafbeeldingsbestanden technieken voor microbiële kolonie biofilms. In bereid monsters, kunnen biofilm substructuur en verslaggever expressiepatronen worden gevisualiseerd door microscopie.

Paraffine insluiten en dunne afdelen van microbiële kolonie Biofilms voor microscopische analyse

We beschrijven de vergadering, operatie, en schoonmaken van een apparaat van de stroom ontworpen om schimmel biofilm beeldvorming in real-time terwijl onder stroom. Wij bieden ook en bespreken van kwantitatieve algoritmen worden gebruikt op de verworven beelden.

Real-time Imaging en kwantificering van schimmel Biofilm ontwikkeling met behulp van een bewerking in twee fasen recirculatie-stroomsysteem

Het protocol beschrijft de teelt van cross-kingdom biofilms bestaande uit Candida albicans en Streptococcus mutans en presenteert een confocale microscopie-gebaseerde methode voor het monitoren van extracellulaire pH in deze biofilms.

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms met behulp van ConfocalMicroscopie

Dit protocol levert een modulaire BSL-2 workflow die kristal-violet biomassa-assays, time-lapse fase-contrast kinetiek, confocale 3D/matrix mapping, SEM-ultrastructuur en een in vivo hamsterinfectiemodule combineert om de functionele rol van Leptospira biofilm te cultiveren, kwantificeren, karakteriseren en onderzoeken, waardoor gestandaardiseerde evaluatie van mutanten en anti-biofilminterventies in laboratoria mogelijk is.

Een modulaire workflow voor kwantitatieve, structurele en functionele analyse van leptospira-biofilms

Leer een methode voor kwalitatieve multi-schaalanalyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcelkolonies met confocale en elektronenmicroscopie. Dit protocol helpt microbiologen biofilmvorming op hyfen te bestuderen.

Een nieuwe methode voor Kwalitatieve Multi-schaal analyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcel Koloniën met behulp van confocale en Electron Microscopy (Video) | JoVE Journal

Een nieuwe methode voor Kwalitatieve Multi-schaal analyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcel Koloniën met behulp van confocale en Electron Microscopy

Meer video's verkennen