Een nieuwe methode voor Kwalitatieve Multi-schaal analyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcel Koloniën met behulp van confocale en Electron Microscopy
25 januari 2017
Dit protocol beschrijft een nieuwe methode te groeien en kwalitatief analyseren bacteriële biofilms op schimmeldraden door confocale en elektronenmicroscopie.
Het algemene doel van dit protocol is om microscopie te gebruiken om de vorming van bacteriële biofilms op filamenteuze hyfen te analyseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van microbiologie, zoals hoe bacteriële biofilms op hyfen worden gevormd, hoe specifiek ze zijn en waar ze uit bestaan. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de onderzoeking van bacteriële biofilmvorming op schimmelhyfen op meerdere schalen mogelijk maakt, van de nanometer tot de centimeterbereiken.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Cora Miquel Guennoc uit mijn laboratorium en Christophe Rose, de elektronenmicroscooptechnicus van INRA PTEF Platform. Om te beginnen, bereid cellofaanmembranen met dezelfde diameter als de petrischalen voor, en plaats ze vervolgens 30 minuten in kokend EDTA. Gebruik gedeïoniseerd water om de vellen te spoelen en steriliseer ze vervolgens twee keer.
Om schimmelpre-culturen voor te bereiden, incubeer de schimmel op agarmedium, bedekt met een voorbehandeld EDTA-cellofaanmembraan. Incubeer de culturen bij optimale temperatuur om kolonies van ongeveer een centimeter in diameter te verkrijgen. Van de pre-cultuur, incubeer een petrischaal met geschikt agarmedium, bedekt met het EDTA-cellofaanmembraan door met een scalpel voorzichtig het buitenste gebied van een pre-cultuurkolonie te krabben en vervolgens de hyfen over te brengen naar de agarplaat.
Incubeer de platen bij optimale temperatuur tot de kolonies ongeveer een centimeter in diameter zijn. Om bacterieculturen zoals P.fluorescens BBc6 te bereiden, gebruik een steriele lus om twee tot drie individuele bacteriekolonies van agarmedium te verzamelen en inoculeer 25 milliliter LB. Incubeer de cultuur bij optimale temperatuur overnacht. Nadat de bacteriën overnacht zijn gekweekt, centrifugeer de cultuur gedurende drie minuten bij 5.000 keer g.
En suspendeer het pellet in 25 milliliter steriele 0,1 molaire kaliumfosfaatbuffer. Na herhaald centrifugeren, gebruik dezelfde buffer om de uiteindelijke bacterieconcentratie aan te passen tot 10 tot de negende cellen per milliliter. Vul een zes-putjes microplaat met vijf milliliter van de bacteriesuspensie.
Gebruik een steriele scheermes om het cellofaanmembraan van de schimmelcultuur in vierkanten te snijden, met een enkele kolonie op elk membraan. Vervolgens, verwijder met pincetten voorzichtig cellofaanvierkanten die hyfen bevatten uit het vaste medium en breng ze over naar afzonderlijke putjes van de bacteriesuspensie. Schud voorzichtig de microplaat totdat de schimmelkolonies loskomen van het cellofaan.
Verwijder vervolgens de cellofaanbladen en laat de schimmelkolonies in de plaat achter. Incubeer de microplaat met zachte agitatie bij 20 graden Celsius gedurende een tijd die afhankelijk is van de gebruikte stammen en het te analyseren stadium. Voor P.fluorescens BBc6 RA L.bicolor, incubeer de culturen gedurende 30 minuten om vroeg-stadium biofilms te krijgen, en gedurende maximaal 16 uur voor volwassen biofilms.
Om planktonische bacteriën en bacteriën die elektrostatisch aan de hyfen zijn gehecht, te verwijderen, spoel de schimmel door deze over te brengen naar een nieuwe zes-putjes microplaat gevuld met sterke zout oplossing. Schud de plaat gedurende een minuut voorzichtig. Breng de schimmel over naar een nieuwe zes-putjes microplaat met vijf milliliter steriele 0,1 molaire kaliumfosfaatbuffer.
Schud de plaat gedurende twee minuten voorzichtig en breng vervolgens de schimmel over naar verse buffer. Terwijl de schimmelkolonie in buffer wordt gehouden, gebruik een scalpel om de kolonie ongeveer doormidden te snijden. Breng de helft van de te kleuren kolonie over naar een petrischaal met één milliliter sterieel water, aangevuld met een geschikte fluorescente kleurstof om het schimmelnetwerk te visualiseren, zoals tarwekiemkwas geconjugeerd met Alexa Fluor 633.
Incubeer vervolgens het monster in het donker. Na het kleuren, spoel het monster door het over te brengen naar een petrischaal deksel met 10 milliliter steriele 0,1 molaire kaliumfosfaatbuffer en schud gedurende één minuut voorzichtig. Dompel een dia half onder in de petrischaal en plaats het gesneden deel voorzichtig zodat het boven de dia drijft.
Til vervolgens langzaam de dia uit de bufferoplossing, zodat het monster voorzichtig op de dia kan bezinken. Het meest delicate aspect is het positioneren van het monster op de dia. Om beschrijving van de biofilm te voorkomen, moeten het monster en de dia worden ondergedompeld tijdens het positioneren van het monster, en het monster mag niet meer worden bewogen voordat het wordt afgebeeld.
Voeg ten slotte 10 microliter anti-blek montagemedium toe aan het monster en bedek het met een glazen dekglas. Bekijk de dia's onder een confocale lasermicroscoop met een 10x of 40x objectief. Gebruik een combinatie van tegelscan en Z-stack functies om globale, 3D-weergaven van de schimmelkolonie en de biofilms te verkrijgen.
Voor elektronenmicroscopie, na het spoelen van de schimmel in sterke zout oplossing zoals eerder, breng de schimmel over naar sterieel water in plaats van buffer om de vorming van zoutkristallen tijdens de dehydratatie stap te voorkomen. Breng de biofilms over naar een monsterhouder en verwijder overtollig water. Breng vervolgens de monsters over naar de kamer van een variabele druk rasterelektronenmicroscoop.
Op een Peltier-koeltafel, bevries het monster tot min vijftig graden Celsius, waardoor het langzaam kan uitdrogen direct in de SEM-kamer, met 100 Pascal variabele druk ingesteld voor 15 uur. Haal het monster eruit en breng het over naar een hoog vacuüm, filmdepositiesysteem. Bekleed vervolgens het monster met twee nanometer platina onder argonplasma.
Bekijk het beklede monster met een rasterelektronenmicroscoop, met een veld emissie kanon met behulp van de hoge resolutie in-lens detector, en een elektronische hoge spanning van één kilovolt. Deze meso-schaal analyse van biofilms toont de heterogene verdeling van de biofilm van P.fluorescens BBc6 in groen op de hyfen van L.bicolor S238N, getoond in rood. De analyse maakte ook het volgen van de biofilmvorming in de tijd mogelijk, van de vroege stappen waarin alleen sommige GFP-gelabelde bacteriën aan de hy
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om bacteriële biofilmen op schimmelhyfen te kweken en te analyseren met behulp van microscopietechnieken. Het doel is om de vorming en kenmerken van deze biofilmen te verduidelijken.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Biofilmonderzoek
- Schimmelbiologie
Achtergrond
- Bacteriële biofilms zijn complexe gemeenschappen die zich op diverse oppervlakken kunnen vormen, waaronder schimmelhyfen.
- Inzicht in biofilmvorming is cruciaal voor het begrijpen van microbiële interacties.
- Deze studie maakt gebruik van zowel confocale als elektronenmicroscopie voor gedetailleerde analyse.
- De methode maakt observatie op meerdere schalen mogelijk, wat het begrip van de biofilmstructuur vergroot.
Doel van de studie
- Om de vorming van bacteriële biofilms op filamenteuze schimmelhyfen te analyseren.
- Om de specificiteit en samenstelling van deze biofilms te onderzoeken.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers in de microbiologie.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van schimmelvoorkleuren op agarmedium.
- Inoculatie van bacteriële culturen en aanpassing van de concentraties.
- Microscopietechnieken, waaronder confocale en elektronenmicroscopie.
- Kleuringsprocedures om schimmelnetwerken en biofilms te visualiseren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle groei van bacteriële biofilms op schimmelhyfen is behaald.
- Microscopie onthulde de heterogene distributie van de biofilms.
- Het volgen van biofilmvorming over tijd werd gedemonstreerd.
- Hoge-resolutiebeelden gaven inzicht in de biofilmstructuur.
Conclusies
- Deze methode maakt een uitgebreide analyse mogelijk van bacteriële biofilms op schimmels.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de microbiële ecologie.
- Het protocol kan door onderzoekers worden gebruikt voor verdere studies op dit gebied.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Multi-schaalanalyse van bacteriële biofilms op filamenteuze schimmelkolonies vult een kritiek gat in het begrip van complexe microbiële interacties die relevant zijn voor biofarmaceutische R&D. Deze methode maakt hoogresolutie, kwantitatieve visualisatie mogelijk van biofilmvorming en -architectuur op biologisch relevante, heterogene substraten, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid bij vroege ontdekking en mechanische risicoreductie. De aanpak verbetert de besluitvorming over het portfolio door robuuste, reproduceerbare gegevens te leveren over microbiële consortia die relevant zijn voor pijplijnen in de milieu-, voedings- en medische biotechnologie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om hypothesen over microbiële interacties te onderzoeken op natuurgetrouwe, driedimensionale schimmelsubstraten.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door ruimtelijke en compositionele kenmerken van biofilmvorming te onthullen.
- Faciliteert functionele validatie van targets voor interventies die processen geassocieerd met biofilm verstoren.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde, meerlaagse biologische systemen voor voor downstream screening-workflows.
- Standaardiseert imaging- en kleuringsprotocollen voor een reproduceerbare, kwantitatieve beoordeling van biofilmen.
- Maakt schaalbare high-content imaging mogelijk voor de evaluatie van verbindingen die gericht zijn op de vorming of disruptie van biofilmen.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Rijgt in vitro biofilmmodellen uit met ziekte-relevante of industrieel relevante microbiële consortia.
- Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van anti-biofilmstrategieën.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang van kandidaten die zich richten op microbiële interacties.
Integratie van pipeline en workflow
Deze microscopiemethode op meerdere schalen is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek voor studies naar microbiële interacties en ondersteunt zowel hypothesegestuurd onderzoek als screeningcampagnes.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetoetsing en verduidelijking van signaalpaden voor biofilmvorming op complexe biotische substraten mogelijk.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve imaging-resultaten voor assay-ontwikkeling en compound-screening.
- Analytics: Biedt resolutie-rijke, multidimensionale read-outs voor comparatieve analyse van de architectuur en compositie van biofilms.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en preklinische modellen door natuurlijke microbiële omgevingen na te bootsen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor diverse microbiële consortia en interventiestudies.
Operationele en Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar microbiële interacties.
- Operationele waarde: Standardiseert multi-schaal imaging-workflows voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en vermindert biologische risico's in een laat stadium bij de ontwikkeling van anti-biofilmmetoden.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van microbiële targets en interventiestrategieën.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in confocale en elektronenmicroscopietechnieken.
- Vereist toegang tot geavanceerde beeldvormingsinstrumentatie en analytische infrastructuur.
- Maakt standaardisatie van monstervoorbereiding en beeldvormingsprotocollen tussen teams noodzakelijk.
- Aanpassingen kunnen nodig zijn voor verschillende schimmel- of bacteriesoorten en modelsystemen.
- Succes is afhankelijk van het verkrijgen van dunne, meerlaagse schimmelkolonies voor optimale beeldvorming.
Biopharma FAQ's
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Preparation of Bacterial Fungal Cultures
2:11
Preparation of In Vitro Biofilm of Bacteria on the Fungal Colony
3:41
Sample Preparation for Confocal Microscopy Analysis of Biofilm Formation
5:35
Confocal and Electron Microscopic Analysis
7:07
Results: Meso- and Micro-scale Analysis of P. fluorescens BBc6 on L. bicolor
8:29
Conclusion
