Name: Hoge-resolutie optische kaart brengen van de Muis sinusknoop (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-02T11:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Leer optische mapping van de sinusknoop in muizen met hoge resolutie via Langendorff-geperfuseerde harten of geïsoleerde atriumpreparaten. Deze methode ondersteunt onderzoek naar pacemakerafwijkingen en hartritmestoornissen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We worden ondersteund door de start-up van de medische school van de Universiteit van Wisconsin-Madison (A.V.G.).

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de Zorg en gebruik van proefdieren (NIH Pub nr. 80-23). Alle methoden en protocollen die worden gebruikt in deze studies zijn door de Universiteit van Wisconsin Animal Care en gebruik Protocol goedgekeurd naar aanleiding van de Richtlijnen voor de Zorg en gebruik van proefdieren gepubliceerd door de NIH (publicatie nr 85-23, herzien 1996). Alle dieren die worden gebruikt in deze studie kregen humane zorg in overeenstemming met de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren. 1. Hart verwijderen en Langendorff perfusie <ol><li> Vóór hart isolatie, warm Tyrode oplossing tot 37 ° C met een waterbad en een watermantel. </li><li> Verdoven de muis met 5% isofluraan / 95% O2. </li><li> Zorgen voor passende niveau van de anesthesie door het controleren van het verlies van de pijn reflex. </li><li> Voer thoracotomie. Open de kist met behulp van gebogen 5.5 &quot;Mayo schaar en 5.5&quot; Kelly hemostatische voorceps een 1 cm gesneden op de voorkant van de thorax maken. <ol><li> Snel pak het hart uit de borstkas (binnen 30 sec). Gebruik 4 &quot;gebogen Iris tang om het longweefsel grijpen en knip de longen, thymus en hart samen met het hartzakje met behulp van 4,3&quot; Iris schaar. Heb het hart niet direct te grijpen. </li><li> Wassen in geoxygeneerde (95% O2 / 5% CO 2), constante temperatuur (36,8 ± 0,4 ° C) gemodificeerde Tyrodes oplossing. Gebruik de volgende oplossing samenstelling (mM): NaCl 128,2, KCl 4,7, 1,19 NaH 2PO 4, 1,05 MgCl2, CaCl2 1,3, 20,0 NaHCO3 en 11,1 glucose (pH 7,35 ± 0,05). </li></ol></li><li> Terwijl gebaad in dezelfde oplossing, identificeren de long, thymus en vetweefsel. ontleden ze voorzichtig uit het hart. Gebruik gebogen 3 &quot;Vannas-Tübingen schaar en 4,3&quot; # 5 tang. </li><li> identificeren dan de aorta en canule het op een op maat gemaakte 21 G canule. Gebruik twee gebogen 4,3 &quot;# 5B krachtps. </li><li> Na cannulatie gelijktijdig perfuseren (via de canule met een stroomsnelheid van ~ 5 ml / min; dit moet worden aangepast op basis van de aorta druk, zie hieronder) en superfuse (in het bad bij een stroomsnelheid van ~ 50 ml / min) het hart met verwarmde en gefilterd Tyrode oplossing in het gehele experiment. Voorbij de perfusievloeistof via een in-lijn 11 pm nylon filter om verstopping van de coronaire circulatie voorkomen. </li><li> Met een drukomzetter (of manometer) via een 3-weg kraan Luer lock de perfusie lijn, bewaken de aortadruk en onderhouden tussen 60 en 80 mmHg. Stel perfusie snelheid indien nodig om de druk aorta binnen dit bereik te houden. </li></ol> 2. optische kaart brengen van de SAN uit de Langendorff-geperfuseerde Whole Heart <ol><li> Instrumentatie <ol><li> Plaats het hart horizontaal en speld de ventriculaire apex om het met silicium beklede bodem van de tank af met 0,1 mm diameter kunnen pRevent-stream-geïnduceerde beweging tijdens het experiment. 12 </li><li> Steek een kleine (0,012 &quot;ID x 0,005&quot;) silicium buis in de linker ventrikel (LV) via de pulmonaire ader, de linker atria (LA) en de mitralisklep (MV). Bevestig de buis met een zijden hechtdraad (4-0) naar de klinkende bindweefsel. </li><li> Plaats het hart met zijn achterste naar boven (Figuur 1A, linker paneel). </li><li> Speld de rand van de RA appendage (RAA) aan het siliciumatoom bodem van de tank af met 0,1 mm diameter minutien pinnen. Pas de niveau om het achterste oppervlak van de vlakke RA, en begint deze te bevinden brandvlak van de camera. Dit optische metingen van de maximale oppervlakte van het atrium mogelijk. </li><li> Lus superior (SVC) en inferior (IVC) vena cava door een zijden hechtdraad (4-0) uitstrekken en speld het andere uiteinde van de hechtdraad naar de bodem van een silicium beklede kamer (zie figuur 3A). Zorg ervoor dat de hechtingen niet blokkeren deoptische gezichtsveld. </li><li> Plaats de op maat gemaakte stimulatie-elektrode aan de rand van de RAA. Elektroden maken gebruik siliconencoating 0,25 mm diameter zilverdraden met 0,5 mm elektrodeafstand en verstoken van siliconen voor een lengte van 1 mm aan het einde stimulatie. Plaats dan twee ECG 12 mm naald (29-gauge) monopolaire elektroden in de buurt van de basis van de rechter en linker ventrikels. Doe gemalen ECG-elektrode nabij de top van de ventrikels. </li></ol></li><li> kleuring <ol><li> Aangezien zowel fluorescerende kleurstoffen en elektro-mechanische ontkoppelrail blebbistatin zijn lichtgevoelig, voeren alle hieronder in een donkere kamer beschreven procedures. Maak eerst spanningsgevoelige kleurstof RH-237 of di-4-ANNEPS als voorraadoplossing, 1,25 mg / ml in dimethylsulfoxide (2,5 mM), deze hoeveelheid (30 pl elk) en de hoeveelheden opgeslagen bij -20 ° C. </li><li> Verdun 5-10 pi kleurstof voorraadoplossing in 1 ml verwarmd (37 ° C) Tyrode oplossing en vervolgens injecteren in de coronaire perfusie lijngedurende 5-7 min onder toepassing van een in-line Luer injectiepoort. </li><li> Bereid blebbistatin als stockoplossing (2 mg / ml in dimethylsulfoxide, 6,8 mM) vooraf en het op 4 ° C. </li><li> Na 20 minuten stabilisatie, voeg 0,5 ml verwarmd (37 ° C) blebbistatin in het perfusaat en verdun 0,1 ml blebbistatin in 1 ml verwarmd (37 ° C) Tyrode oplossing. vervolgens geïnjecteerd in de coronaire perfusie lijn gedurende 5-7 min onder toepassing van een in-line Luer injectiepoort. </li></ol></li></ol> 3. optische in kaart brengen van de SAN uit de geïsoleerde atriale Voorbereiding <ol><li> Instrumentatie <ol><li> Voor de geïsoleerde atriale bereiden, isoleren en canule het hart zoals hierboven beschreven in stappen 1.1-1.5 voor hele hartsvoorbereiding. </li><li> Ontleden de ventrikels van het voorvlak. Zie figuur 1A, rechter paneel, gesneden # 1 voor details. </li><li> Open de RA door te snijden door de tricuspid valve (TV) langs de TV-SVC as. Zie figuur 1A, rechter paneel, gesneden # 2 voor meer informatie. </li><li> Snijd de mediale onderdeel van het crista terminalis de RAA openen. Zie figuur 1A, rechter paneel, knippen # 3. </li><li> Open de voorste atriale vrije wand door het uitvoeren van een verlaging van de middellijn van het vorige cut # 3 naar de rand van de rechter benedenhoek van de RAA, plat en speld de atriale vrije wand naar de bodem van een silicium beklede kamer. Zie de richting aangegeven door de holle pijl in figuur 1A, gesneden # 4. Behoud van een rand van ventriculair weefsel voor de bereiding pinnen om schade aan de atria voorkomen. </li><li> Voorts zullen open LA door snijden door de MV langs de MV-bovenhoek van de LA appendage (LAA). </li><li> Het LAA, gesneden uit het midden van de geopende LAA door de voorste atriale vrije wand geopend tot nabij een midden rand van het LAA. </li><li> Open de voorste atriale vrije wand along dezelfde richting, dan plat en speld aan de bodem van een Sylgard beklede kamer. </li><li> Gedeeltelijk verwijder de interatriale septum weefsel. Dit verstrooiing van het optische signaal van weefsel dat is niet scherp reduceren. Derhalve zijn zowel de LA en RA en de SAN en atrioventriculaire junctie (AVJ) toegankelijk in dit preparaat (figuur 1B). </li><li> Til het uiteindelijke preparaat ongeveer 0,5 mm van de bodem van het met silicium beklede kamer om superfusie zodat zowel epicardiale en endocardiale oppervlak. </li><li> Superfuse het preparaat met voorverwarmde (37 ° C) Tyrode oplossing bij een constante snelheid van ~ 12 ml / min voor een gerichte stroming vlakbij het SVC en ~ 30 ml / min voor een bad superfusie. </li><li> Plaats de op maat gemaakte stimulatie Ag / AgCl elektrode 2 (0,25 mm) aan de rand van de RAA ontleed. Plaats dan twee ECG 12 mm naald (29G) elektroden (monopolair) in de buurt van de RAA en LAA, respectievelijk. Plaats de grond ECG uitverkorenenreed in de buurt van de AVJ. </li></ol></li><li> kleuring <ol><li> Voer een directe toepassing van het voltage-gevoelige kleurstof (RH-237 of di-4-ANNEPS). Hiervoor verdunde 1-2 ul van de kleurstof voorraadoplossing in 1 mm verwarmde (37 ° C) Tyrode oplossing en rustig uit verdunde kleurstof op het oppervlak van het preparaat met behulp van een pipet 1 mm. </li><li> Alternatief voeren atriale kleuring met spanningsgevoelige kleurstof door een coronaire perfusie van het Langendorff-geperfuseerde hart overeenkomstig aan die boven beschreven voor de gehele hartsvoorbereiding (stappen 2.2.1-2.2.2). <ol><li> Na de coronaire perfusie kleuring, isoleer het atriale preparaat beschreven. Voer extra oppervlak vlekken als dat nodig is om een ​​bevredigend fluorescentie niveau te bereiken. Snelle atriale isolatie niet bleken de kleurstof en heeft geen invloed op de kwaliteit van de kleuring. </li></ol></li><li> Immobiliseren het preparaat met de elektro-mechanische ontkoppelrail, blebbistatin. Verdun 3-5 ul blebbistatin voorraadoplossing in de verwarmde (37 ° C) Tyrode oplossing en rustig uit verdunde blebbistatin op het oppervlak van het preparaat en de omringende oplossing. Aangezien blebbistatin is aangetoond lichtgevoelige 13,14 vermijden lange blootstelling aan licht tijdens de bereiding en te kleuren. </li><li> Voer aanvullende blebbistatin toepassing zoveel als nodig is om krimp te onderdrukken. Gewoonlijk tot 3 extra toepassingen (3-5 gl per elke toepassing) kan worden gebruikt om bewegingsartefacten voldoende te onderdrukken om nauwkeurig reconstrueren SAN en atriale activering. </li><li> Voeg extra 0,5 ml verwarmd blebbistatin in het perfusaat. Tijdens deze procedure onderbreekt de superfusie gedurende 30 seconden om de kleurstof / blebbistatin het atriale weefsel te kleuren. </li></ol></li></ol> 4. Optical Mapping Set Up Opmerking. Een gedetailleerde beschrijving van het optische mapping systeem elders 12 <ol><li> Gebruik een camera met een temporal resolutie van 2000 frames / sec of hoger, en een aantal lenzen condensor ruimtelijke resolutie van 100 um / pixel of hoger bereiken. Dit is nodig om SAN activatie en intranodale vermeerdering reconstrueren. </li><li> Om beweging artefact terug te brengen van de trillende oplossing, vast te stellen een kleine dekking van glas op het oppervlak van de oplossing over het hart / geïsoleerde atriale voorbereiding. </li><li> Gebruik excitatielicht (520 ± 45 nm golflengte) geleverd door een constante stroom, geluidsarme halogeenlamp. Richt de gefilterde lichtstraal op de voorbereiding door het gebruik van een flexibele gevorkte lichtgeleider. </li><li> Filter de uitgestraalde fluorescentie door een lange-doorlaatfilter (&gt; 715 nm). Verzamelen, digitaliseren en opslaan van de verworven tl-signaal op een computer met behulp van software die door de fabrikant van camera. </li></ol> 5. Data Processing OPMERKING: Optische kaartgegevens verzameld en opgeslagen als een reeks matrices van fluorescentie-intensiteit op verschillende tijdstippen. Elke pixel represents een maat fluorescentie-intensiteit vanuit een specifieke locatie op het weefsel preparaat op een bepaald tijdstip. Achtergrondfluorescentie wordt automatisch verwijderd per pixel om een ​​betere visualisatie van fluorescentieveranderingen door membraan spanningswisselingen en ondersteboven te komen met actiepotentialen (AP&#39;s) gemeten met micro-elektrode systemen. Details van de verschillende stappen in de verwerking van optische beeldgegevens, waaronder beeldsegmentatie, ruimtelijke filtering, filtering en basislijnafwijking verwijderen, worden in de gefocusseerde beoordeling. 15 <ol><li> Handmatig of via een speciaal algoritme (bijvoorbeeld een drempelwaardebepaling en grenslijndetectie) 15 aan weefsel grenzen bepalen, maakt een binair masker van 1 (inbegrepen pixels) en 0 (exclusief pixels) en het masker gelden voor elk frame in de reeks. Dit proces zorgt voor een binair beeld dat de gebieden van belang voor verdere verwerking benadrukt. </li><li> Om de signaal-ruisverhouding van de opt verbeterensche gegevens, filteren de signalen binnen de geselecteerde gebieden van belang. Gebruik hiervoor ruimtelijke (dwz middelen van aangrenzende fluorescerende pixels zoals gedefinieerd door een gewenst convolutie bak of kernel bijvoorbeeld 3 x 3 of, voor luidruchtige data, 5 x 5) en / of temporele filtering (bijvoorbeeld, Butterworth, Chebyshev Type 1, Chebyshev Type 2, elliptisch enz.) (figuur 2). Houd rekening met de mogelijkheid van gefilterde geïnduceerde artefacten bij de interpretatie van de gegevens. Voor meer details, zie beoordeling. 15 </li><li> Verwijderen drift van de basislijn optische opnames wanneer nodig (met hoogdoorlaatfiltering of polynoom passend bij het oorspronkelijke signaal) en vervolgens normaliseren elke pixel signaal van 0 (minimum fluorescentie) tot 1 (maximum fluorescentie). </li><li> Selecteer een tijdvenster dat de activeringstijden van alle pixels van één AP vermeerdering omvat. Wijs aan elke pixel de activering tijd als de tijd van de maximale opwaartse slag derivaat (dF / dt max, waarbij F fluorescence intensiteit). Met behulp van alle pixel activering tijden, reconstrueren de isochrone activering kaart. Elke isochron zal dus tonen de pixels geactiveerd tegelijkertijd. </li><li> De AP (APD) distributietoewijzing reconstrueren, voor elke pixel berekenen van de tijdsduur tussen de activeringstijd en de tijd op een bepaald niveau van repolarisatie (bijvoorbeeld bij 80% van repolarisatie, APD 80). Met behulp van alle pixel APD waarden, reconstrueren de APD distributie isochrone kaart. Elke isochron zal dus tonen de pixels met dezelfde APD. </li><li> Om geleidingssnelheid AP vermeerdering berekenen, dient een oppervlak van het preparaat op de activeringstijd gegevens berekend 5,4. Gebruik hiervoor polynoom oppervlak aanbrengen of lokale kernel oppervlak smoothing en dan berekenen lokale geleidingssnelheid vectoren van het verloop van de gemonteerde oppervlak. </li><li> Om de repolarisatie kaart te maken, toe te wijzen elke pixel zijn repolarisatie tijd, gedefinieerd als de maximale tweede afgeleide (d 2 F / dt2) van het optische signaal aan het einde van de OAP of het tijdstip van 90% repolarisatie. </li></ol>

<ol><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li>
<li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+%26+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues.</a> Circ Res. 110 (4), 609-623 (2012).</li>
<li>Fedorov, V. V., Glukhov, A. V., Chang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conduction+barriers+and+pathways+of+the+sino-atrial+pacemaker+complex%3A+their+role+in+normal+rhythm+and+atrial+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Conduction barriers and pathways of the sino-atrial pacemaker complex: their role in normal rhythm and atrial arrhythmias.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2012).</li>
<li>Boyett, M. R., Honjo, H., Kodama, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sinoatrial+node%2C+a+heterogeneous+pacemaker+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">The sinoatrial node, a heterogeneous pacemaker structure.</a> Cardiovasc Res. 47 (4), 658-687 (2000).</li>
<li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinoatrial+Node+Reentry+in+a+Canine+Chronic+Left+Ventricular+Infarct+Model%3A+The+Role+of+Intranodal+Fibrosis+and+Heterogeneity+of+Refractoriness%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Arrhythm+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Sinoatrial Node Reentry in a Canine Chronic Left Ventricular Infarct Model: The Role of Intranodal Fibrosis and Heterogeneity of Refractoriness.</a> Circ Arrhythm Electrophysiol. , (2013).</li>
<li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calsequestrin+2+deletion+causes+sinoatrial+node+dysfunction+and+atrial+arrhythmias+associated+with+altered+sarcoplasmic+reticulum+calcium+cycling+and+degenerative+fibrosis+within+the+mouse+atrial+pacemaker+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex.</a> Eur Heart J. 36 (11), 686-697 (2015).</li>
<li>John, R. M., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinus+Node+and+Atrial+Arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Sinus Node and Atrial Arrhythmias.</a> Circulation. 133 (19), 1892-1900 (2016).</li>
<li>Swaminathan, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+CaMKII+causes+cardiac+sinus+node+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Oxidized CaMKII causes cardiac sinus node dysfunction in mice.</a> J Clin Invest. 121 (8), 3277-3288 (2011).</li>
<li>Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+the+murine+sinus+node%3A+high-resolution+optical+mapping+of+ankyrin-B+heterozygous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299 (2), H482-H491 (2010).</li>
<li>Egom, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+sinoatrial+node+function+and+increased+susceptibility+to+atrial+fibrillation+in+mice+lacking+natriuretic+peptide+receptor+C%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C.</a> J Physiol. 593 (5), 1127-1146 (2015).</li>
<li>Torrente, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li>
<li>Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+action+potentials+and+calcium+transients+in+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart.</a> J Vis Exp. (55), e3275(2011).</li>
<li>Fedorov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li>
<li>Swift, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+blebbistatin+for+cardiac+optical+mapping+and+other+imaging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications.</a> Pflugers Arch. 464 (5), 503-512 (2012).</li>
<li>Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+and+analysis+of+cardiac+optical+mapping+data+obtained+with+potentiometric+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303 (7), H753-H765 (2012).</li>
<li>Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organisation+of+the+mouse+sinoatrial+node%3A+structure+and+expression+of+HCN+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels.</a> Cardiovasc Res. 73 (4), 729-738 (2007).</li>
<li>Verheijck, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+features+of+the+mouse+sinoatrial+node+in+relation+to+connexin+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution.</a> Cardiovasc Res. 52 (1), 40-50 (2001).</li>
<li>Krishnaswamy, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+parasympathetic+nervous+system+regulation+of+the+sinoatrial+node+in+Akita+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice.</a> J Mol Cell Cardiol. 82, 125-135 (2015).</li>
<li>Nygren, A., Lomax, A. E., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+action+potential+durations+in+isolated+mouse+left+and+right+atria+recorded+using+voltage-sensitive+dye+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of action potential durations in isolated mouse left and right atria recorded using voltage-sensitive dye mapping.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (6), H2634-H2643 (2004).</li>
<li>Efimov, I. R., Fedorov, V. V., Joung, B., Lin, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cardiac+pacemaker+circuits%3A+methodological+puzzles+of+the+sinoatrial+node+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping cardiac pacemaker circuits: methodological puzzles of the sinoatrial node optical mapping.</a> Circ Res. 106 (2), 255-271 (2010).</li>
<li>Aschar-Sobbi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+atrial+arrhythmia+susceptibility+induced+by+intense+endurance+exercise+in+mice+requires+TNFalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFalpha.</a> Nat Commun. 6, 6018(2015).</li>
<li>Hansen, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation+driven+by+micro-anatomic+intramural+re-entry+revealed+by+simultaneous+sub-epicardial+and+sub-endocardial+optical+mapping+in+explanted+human+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation driven by micro-anatomic intramural re-entry revealed by simultaneous sub-epicardial and sub-endocardial optical mapping in explanted human hearts.</a> Eur Heart J. 36 (35), 2390-2401 (2015).</li>
<li>Lang, D., Petrov, V., Lou, Q., Osipov, G., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+heart+rate+in+a+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electrocardiol%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of heart rate in a rabbit heart.</a> J Electrocardiol. 44 (6), 626-634 (2011).</li>
<li>Kanlop, N., Sakai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+study+of+blebbistatin-induced+chaotic+electrical+activities+in+isolated+rat+atrium+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Optical mapping study of blebbistatin-induced chaotic electrical activities in isolated rat atrium preparations.</a> J Physiol Sci. 60 (2), 109-117 (2010).</li>
<li>Glukhov, A. V., Flagg, T. P., Fedorov, V. V., Efimov, I. R., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+K%28ATP%29+channel+pharmacology+in+intact+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 48 (1), 152-160 (2010).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+sinoatrial+node+function+and+intra-atrial+conduction+in+murine+gain-of-function+Scn5a%2B%2FDeltaKPQ+hearts+suggest+an+overlap+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered sinoatrial node function and intra-atrial conduction in murine gain-of-function Scn5a+/DeltaKPQ hearts suggest an overlap syndrome.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (7), H1510-H1523 (2012).</li>
</ol>

Er worden geen belangenconflicten gedeclareerd.

Hier presenteerden wij twee soorten muizen SAN preparaten: 1) intact SAN in het Langendorff-geperfuseerde hele hart, en 2) SAN in het geïsoleerde, open atriale preparaat. Deze twee types van de voorbereiding dienen verschillende experimentele doeleinden. In de Langendorff-geperfuseerde hele hartsvoorbereiding, wordt de intacte atriale structuur behouden waardoor het mogelijk complexe atriale aritmieën zoals atriumfibrillatie en interacties tussen de SAN en atrium bestuderen bij inspringende tachycardie. 6 daa...

Nieuwe wetenschappelijke doorbraken die leiden tot sprongen in het begrip van de menselijke fysiologie worden vaak voorafgegaan door technologische vooruitgang. Fluorescerend optisch mapping bijvoorbeeld, maakt onderzoek mogelijk naar meerdere fysiologische parameters in zowel cellen als weefsels.1,2 Het heeft ons begrip ervan hoe de anatomische structuur geassocieerd is met elektrofysiologische functies en disfuncties aanzienlijk verbeterd. In het hart bestaan de natuurlijke pacemaker en geleidingssystemen zoals de sinoatriale knoop (SAN) en de atrioventriculaire overgang uit nodal myocyten die geïsoleerd worden door de omliggende atriale myocyten.3-5 Een dergelijke organisatie creëert complexe driedimensionale structuren met gespecialiseerde elektrische eigenschappen. Zowel structurele als functionele remodellering van deze pacemaker structuren is erkend als vorming van significante elektrofysiologische heterogeniteiten.6,7 Het begrijpen van het mechanisme dat ten grondslag ligt aan hoe dergelijke heterogeniteiten resulteren in SAN disfuncties en atriale aritmogenez zal de klinische behandeling van deze ziekten aanzienlijk ten goede komen. Het vereist een techniek om de voortplanting van elektrische signalen op weefselniveau te visualiseren, zoals optisch mapping.
Recentelijk heeft zich accumulerend bewijs voorgedaan dat het vooruitgaan van optisch mapping in studies van atriale elektrofysiologie en pathologie aantoont.2 Echter, nieuwe en rigoureuze studies zijn afhankelijk van de nauwkeurige interpretatie van experimentele gegevens, waarvan de validiteit en stabiliteit afhangen van zorgvuldige experimentprotocollen. Genetisch gemodificeerde muizen worden veelvuldig gebruikt voor onderzoek als diermodellen van menselijke ziekten, inclusief ziek sinus syndroom, pacemaker afwijkingen en atriale aritmieën.6,8-11 Dus, een combinatie van fluorescerend optisch mapping met transgene muismodellen biedt een krachtig hulpmiddel om cardiale elektrische abnormaliteiten geassocieerd met verschillende pathologieën te bestuderen. In dit artikel presenteren we een protocol voor hoog-resolutie optisch mapping van de muis SAN en atrium. Specifiek bespreken en vergelijken we verschillende kleurstof laad benaderingen, tijd effecten op kleurstof verbleking en hartslag stabiliteit tijdens het experiment.

<table><tbody><tr><td>water jacket</td><td>Radnoti</td><td>1660 Series Tissue Bath voor grote organen of isolatieprocedures voor enkele cellen</td><td></td></tr><tr><td>water bath / circulator</td><td>Fisher Scientific</td><td>1016S</td><td></td></tr><tr><td>drukversterker</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore Nylon Net Filters</td><td>Fisher Scientific</td><td>NY1102500</td><td></td></tr><tr><td>Druktransducer</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen Minutien Pins - 0,1 mm diameter</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Perfusiepompen</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4LS</td><td></td></tr><tr><td>Superfusiepomp</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4HS</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Tübingen schaar&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>503379</td><td></td></tr><tr><td>Dumont pincet</td><td>World Precision Instruments</td><td>501201, 500085</td><td></td></tr><tr><td>Mayo schaar</td><td>World Precision Instruments</td><td>501750</td><td></td></tr><tr><td>Kelly hemostatische pincet</td><td>World Precision Instruments</td><td>501241</td><td></td></tr><tr><td>Iris pincet</td><td>World Precision Instruments</td><td>15917</td><td></td></tr><tr><td>Iris schaar</td><td>World Precision Instruments</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>ECG 12 mm naald (29-gauge) elektroden (monopool)&nbsp;</td><td>AD Instruments</td><td>MLA1203</td><td></td></tr><tr><td>in-line Luer injectiepoort</td><td>Ibidi</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Ultima-L CMOS camera&nbsp;</td><td>SciMedia</td><td>MiCAM-05&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>halogeen lamp</td><td>Moritex USA Inc</td><td>MHAB-150W</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (6H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 (H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S1109</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr></tbody></table>

hoge-resolutie optische kaart brengen van de muis sinusknoop

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Disfuncties van de sino-atriale knoop (SAN) en bijbehorende complicaties vormen belangrijke oorzaken van morbiditeit bij patiënten met hartaandoeningen. De ontwikkeling van nieuwe farmacologische therapieën om deze patiënten te genezen, is afhankelijk van een grondig begrip van zowel de normale fysiologie als de pathofysiologie van de SAN. Onder de studies van cardiale pacemaking wordt de muis-SAN veel gebruikt vanwege de haalbaarheid voor modificaties in de expressie van verschillende genen die coderen voor SAN-ionkanalen of calcium-afhandelingseiwitten. Opkomend bewijs uit elektrofysiologische en histologische studies heeft ook de representativiteit en gelijkenis van de muis-SAN-structuur en functies aan grotere zoogdieren bewezen, inclusief de aanwezigheid van gespecialiseerde geleidingspaden van de SAN naar het atrium en een complexe hiërarchie van pacemakers binnen de SAN. Onlangs heeft de techniek van optisch mapping de exploratie en onderzoek van de oorsprong van excitatie en geleiding binnen en van de muis-SAN enorm vergemakkelijkt, wat op zijn beurt de begrip van de SAN heeft uitgebreid en klinische behandelingen van SAN-disfunctie geassocieerde ziekten heeft ten goede gekomen. In dit manuscript hebben we in detail beschreven hoe de optische mapping van de muis-SAN kan worden uitgevoerd vanuit het intacte, Langendorff-geperfundeerde hart en vanuit de geïsoleerde atriale preparatie. Dit protocol is een nuttig hulpmiddel om het begrip van de muis-SAN fysiologie en pathofysiologie te verbeteren.

Optische kaart brengen van de Intact SAN uit de Langendorff-geperfuseerde Heart Een typisch voorbeeld van een RA activatie hoogtekaart gereconstrueerd spontane sinusritme getoond in figuur 3 voor een Langendorff-geperfuseerde muizenhart. De vroege activatie punt ligt in het gebied nabij de intercaval SVC waarbij de SAN anatomisch gedefinieerd. 3,16 Twee RA activatie contourkaarten verworven 1,0 en 0,5 msec bemonsteringssnelheid zijn get...

Hier presenteren we een protocol voor optische kaart brengen van de elektrische activiteit van de muis rechteratrium en vooral de sinusknoop, bij een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Hoge-resolutie optische kaart brengen van de Muis sinusknoop

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

Het algemene doel van dit experimentele protocol is het uitvoeren van optische mapping van de sinoatriale knoop van de muis vanuit een intact Langendorff-geperfuseerd hart of een geïsoleerde atriale preparatie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de electro- en pathofysiologie van de sinoatriale knoop over de mechanismen van pacemakerafwijkingen, het sick-sinus-syndroom en diverse ziekte-geassocieerde atriale aritmieën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de onderzoeking van meerdere parameters in intacte weefsels mogelijk maakt met een zeer hoge ruimtelijke en temporele resolutie.Nadat het passende anesthetieniveau via een knijpprik in de teen is bevestigd, worden gebogen Mayo-scharen van 5,5 inch en Kelly hemostatische klemmen van 5,5 inch gebruikt om een incisie van één centimeter op de voorzijde van de thorax te maken. Gebruik gebogen Iris-pincetten van vier inch om het longweefsel snel vast te pakken en gebruik Iris-scharen van vier derde inch om de long, thymus en het hart samen met het pericard uit te snijden. Was de weefsels in gezuursourde gemodificeerde Tyrode-oplossing bij 37 graden Celsius.Gebruik vervolgen

high-resolution-optical-mapping-of-the-mouse-sino-atrial-node

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een hoge temporele en ruimtelijke resolutie techniek om optisch image actie potentiaal beweging op het oppervlak van de Langendorff-geperfuseerde rattenharten met behulp van een potentiometrische kleurstof (di-8-ANEPPS).

Optisch in kaart brengen van Langendorff-geperfuseerde Rat Hearts

Dit rapport geeft een gedetailleerde beschrijving van de methodologie en de resultaten van gelijktijdige endocardiale en epicardiale optische in kaart brengen van de elektrische prikkeling in de intacte linker atrium van een Langendorff-doorbloed schapen hart tijdens stretch-geïnduceerde atriumfibrilleren.

High-Resolution endocardiale en epicardiale Optical Mapping in een Schaap Model van Stretch-Induced atriale fibrillatie

Dit artikel beschrijft de basisprocedures voor het uitvoeren van optische in kaart brengen van experimenten in de Langendorff-geperfuseerde konijn hart met behulp van het panoramische imaging systeem, en de dubbele (spanning en calcium) beeldvormende modaliteit.

Multiparametrische Optische kaart brengen van de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Dit document beschrijft de dissectie procedure, instrumentale setup, en de experimentele omstandigheden tijdens de optische in kaart brengen van de transmembraan potentiaal (Vm) en intracellulair calcium van voorbijgaande aard (CAT) in intacte geïsoleerde Langendorff doorbloed muis harten.

Optische kaart brengen van actiepotentialen en Calcium Transiënten in de muis Hart

This video demonstrates the procedure to isolate sinoatrial node or SAN from mouse heart. The SAN houses the sinoatrial cells that initiates heartbeat by generating spontaneous action potentials.

Sinoatrial Node Isolation from Mouse Model: A Procedure to Harvest SA Node from Murine Heart

Dit protocol beschrijft de elektrofysiologische evaluatie van lymfkliertest atria met behulp van een optische mapping systeem met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, met inbegrip van dubbele opnamen van de membraan spanning en Ca2 + voorbijgaande onder geprogrammeerd stimulatie door middel van een speciale elektrode-katheter.

Elektrofysiologische beoordelingvan lymfkliertest Atria met hoge resolutie optische Mapping

We bieden een stapsgewijs protocol voor immunofluorescentiekleuring van de sinoatriale knoop (SAN) en atrioventriculaire knoop (AVN) in muizenharten.

Whole-Mount Immunofluorescentie kleuring, confocale beeldvorming en 3D-reconstructie van de sinoatriale en atrioventriculaire knoop in de muis

Dit protocol heeft tot doel een nieuwe methodologie te beschrijven om de intrinsieke cardiale vuursnelheid te meten met behulp van micro-elektrode array-registratie van het hele sinoatriale knoopweefsel om pacemaking-defecten bij muizen te identificeren. Farmacologische middelen kunnen ook in deze methode worden geïntroduceerd om hun effecten op intrinsieke pacemaking te bestuderen.

Micro-elektrode array-opname van de vuursnelheid van de sinoatriale knoop om intrinsieke cardiale pacemakingdefecten bij muizen te identificeren

We rapporteren een methode voor mesoscopische reconstructie van het hele muizenhart door nieuwe ontwikkelingen in weefseltransformatie en kleuring te combineren met de ontwikkeling van een axiaal gescande lichtplaatmicroscoop.

Mesoscopische optische beeldvorming van het hele muizenhart

Het protocol maakt gebruik van geavanceerde light-sheet microscopie samen met aangepaste methoden voor het opruimen van weefsel om ingewikkelde hartstructuren in knaagdierharten te onderzoeken, met een groot potentieel voor het begrijpen van cardiale morfogenese en remodellering.

Light-sheet beeldvorming om de hartstructuur in knaagdierharten te onthullen

Leer optische mapping van de sinusknoop in muizen met hoge resolutie via Langendorff-geperfuseerde harten of geïsoleerde atriumpreparaten. Deze methode ondersteunt onderzoek naar pacemakerafwijkingen en hartritmestoornissen.

Hoge-resolutie optische kaart brengen van de Muis sinusknoop

Meer video's verkennen