Hoge-resolutie optische kaart brengen van de Muis sinusknoop

Het algemene doel van dit experimentele protocol is het uitvoeren van optische mapping van de sinoatriale knoop van de muis vanuit een intact Langendorff-geperfuseerd hart of een geïsoleerde atriale preparatie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de electro- en pathofysiologie van de sinoatriale knoop over de mechanismen van pacemakerafwijkingen, het sick-sinus-syndroom en diverse ziekte-geassocieerde atriale aritmieën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de onderzoeking van meerdere parameters in intacte weefsels mogelijk maakt met een zeer hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Nadat het passende anesthetieniveau via een knijpprik in de teen is bevestigd, worden gebogen Mayo-scharen van 5,5 inch en Kelly hemostatische klemmen van 5,5 inch gebruikt om een incisie van één centimeter op de voorzijde van de thorax te maken. Gebruik gebogen Iris-pincetten van vier inch om het longweefsel snel vast te pakken en gebruik Iris-scharen van vier derde inch om de long, thymus en het hart samen met het pericard uit te snijden. Was de weefsels in gezuursourde gemodificeerde Tyrode-oplossing bij 37 graden Celsius.

Gebruik vervolgens gebogen Vannas Tubingen scharen van drie inch en nummer vijf pincetten van vier derde inch om de long, thymus en het vetweefsel van het hart te verwijderen. Gebruik daarna een op maat gemaakte canule van 21 gauge en twee gebogen nummer vijf B pincetten van 4,3 inch om de aorta te canuleren en het hart gelijktijdig te perfunderen en superfunderen met Tyrode-oplossing van 37 °C, waarbij de oplossing vóór de perfusie door een inline nylon filter van 11 micron wordt geleid om verstopping van de coronaire circulatie te voorkomen. Sluit vervolgens een druktransducer via een driewegkraan aan op een Luer-lock op de perfusielijn om de aortadruk te bewaken, waarbij de perfusiesnelheid naar behoefte wordt aangepast om de aortadruk tussen 60 en 80 mmHg te houden.

Voor optische mapping van de sinoatriale knoop uit een hart met Langendorff-perfusie, positioneert u het orgaan in een horizontale oriëntatie met de posterieure zijde naar boven in een glazen weefselbadkamer en gebruikt u pinnen met een diameter van 0,1 millimeter om de ventriculaire apex aan de silicone-gecoate bodem van de kamer te fixeren, om stroomgeïnduceerde beweging tijdens het experiment te voorkomen. Voer een kleine siliconenbuis in het linkerventrikel in via de vena pulmonalis, de linkeratria en de mitralisklep en gebruik een 40 zijden hechtdraad om de buis aan het omringende bindweefsel te fixeren. Gebruik vervolgens een andere 40 zijden hechtdraad om de vena cava superior en inferior af te binden en pin de rand van het rechterauriculaire appendage aan de bodem van de kamer.

Rek het andere uiteinde van de hechtdraad uit, spelden dit vast aan de bodem van de kamer en plaats een op maat gemaakte pacing-elektrode op de rand van het rechter atriumoor. Plaats vervolgens twee unipolaire ECG-naaldenelektroden van 12 millimeter nabij de basis van de rechter- en linkerventrikels en plaats de ECG-massaelektrode nabij de apex van de ventrikel. Om het weefsel te kleuren, injecteert u de verdunde kleurstof gedurende een periode van vijf tot zeven minuten via een inline perfussiepoort van de coronaire perfusielijn.

Voeg na 20 minuten stabilisatie 0,5 milliliters blebbistatin van 37 degree Celsius toe aan het perfusaat, gevolgd door de injectie van 0,1 milliliters blebbistatin verdund in 1 milliliter Tyrode-oplossing van 37 degree Celsius in de coronaire perfusielijn gedurende nog eens vijf tot zeven minuten met behulp van een inline Luer lock-injectiepoort. Blebbistatin moet met voorzichtigheid worden gebruikt. Om neerslag van de inhibitor te voorkomen, dient de blebbistatin eerst te worden opgelost in medium dat is opgewarmd tot een heldere 37 degrees, waarna het mengsel krachtig moet worden geroerd.

Om het monster optisch in kaart te brengen, fixeert u eerst een klein OBJECTGLAS op het oppervlak van de oplossing boven het weefsel om bewegingsartefacten door de vibrerende oplossing te verminderen. Richt vervolgens, met behulp van een flexibele vertakte lichtgeleider met excitatieverlichting geleverd door een constantstroom, geluidsarme halogeenlamp, de gefilterde lichtbundel op het weefsel en beeld het resulterende fluorescentiesignaal. Nadat het hart is gecannuleerd zoals zojuist gedemonstreerd, dissekeert u de ventrikels van de anterieure zijde en opent u het rechteratrium via de tricuspidalisklep langs de as van de vena cava superior en de tricuspidalisklep, gevolgd door een incisie door de mediale zijde van de crista terminalis.

Om de vrije voorwand van het atrium te openen, wordt een incisie gemaakt vanaf de middellijn van de incisie van de mediale poot tot aan de rand van de rechterbenedenhoek van de rechteratriaal appendage, waarna de afgeplatte vrije atriale wand op de bodem van een met silicone gecoate kamer wordt gepind. Om de linkeratriaal appendage te openen, wordt er door de mitralisklep gesneden langs de bovenhoek van de mitralisklep van de linkeratriaal appendage. Pin vervolgens het geopende linkeratrium vast, zoals eerder is gedaan voor het rechteratrium.

Verwijder vervolgens gedeeltelijk het ventriculaire weefsel. Behoud een rand van ventriculair weefsel om het preparaat vast te pinnen ter voorkoming van schade aan de atria en pin het weefsel aan de bodem van een met Sylgard gecoate kamer. Til het uiteindelijke preparaat nu ongeveer 0,5 millimeter op van de bodem van de met silicone gecoate kamer om superfusie vanaf zowel het epicardiale als het endocardiale oppervlak mogelijk te maken en superfuseer het monster met Tyrode-oplossing van 37 °C.

Plaats vervolgens een op maat gemaakte pacing-zilderchloride-elektrode op de rand van de gedissekeerde rechteratriaalappendage. Plaats één unipolaire elektrode-naald van 12 millimeter voor het elektrocardiogram nabij zowel de rechter- als de linkeratriaalappendage, en plaats de aarde-elektrode voor het elektrocardiogram nabij de atrioventriculaire overgang. Om het hartweefsel te kleuren, gebruikt u een pipet van 1 millimeter om spanningsgevoelige kleurstof, verdund in Tyrode-oplossing van 37 °C, langzaam direct op het weefsel aan te brengen.

Immobiliseer vervolgens het monster door verdunde blebbistatine direct op het weefsel aan te brengen, gevolgd door de toediening van nog eens 0,5 milliliter blebbistatine via het perfusaat, en voer de optische mapping van het monster uit zoals zojuist gedemonstreerd. De weefselkleuring en de blebbistatine-inhibitiestappen zijn cruciaal en vereisen een nauwkeurige uitvoering en een preciese kleurprocedure, zodat de fysiologische parameters van het atrium, waaronder de hartslag, de lokalisatie van de leidende pacemaker en de atriale geleiding, niet worden beïnvloed. Hier worden een typische activatiecontourkaart van het rechteratrium, gereconstrueerd voor spontaan sinusritme van een Langendorff-geperfundeerd muizenhart, en twee overeenkomstige contourkaarten van het rechteratrium, verkregen bij bemonsteringssnelheden van 1 en 0,5 milliseconde, getoond.

Het vroege activatiepunt bevindt zich in de intercavale regio nabij de vena cava superior, waar de sinoatriale knoop anatomisch is gedefinieerd. In dit experiment werd, na pacing van de rechter atriumoor appendages gedurende ten minste één minuut bij 10 tot 12 Hz, de elektrische stimulatie gestopt en werd de hersteltijd van de sinoatriale knoop berekend als het tijdsinterval tussen het laatste gevangen actiepotentiaal en het eerste spontane actiepotentiaal. Activatie van de geïsoleerde atriumpreparaat tijdens spontaan sinusritme maakt het mogelijk om de precieze locatie van de leidende pacemaker te identificeren.

Wanneer de chirurgische ingreep en de procedures voor het laden van de kleurstof correct worden gevolgd, mogen er geen significante veranderingen in de fysiologische kenmerken van het atrium worden waargenomen. Hoewel arteriële kleuring mogelijk een grotere hoeveelheid kleurstof vereist, lijkt het fluorescente signaal in het weefsel van het gebied van de sinoatriale knoop stabieler te zijn bij deze laadmethode, met een signaalintensiteit-vervalstijd na coronaire kleuring die bijna twee keer zo lang is als na oppervlaktekleuring. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 30 tot 40 minuten worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.

Houd bij het uitvoeren van deze procedure rekening met de anatomie van het atrium voordat u een incisie maakt, om beschadiging van het atriumweefsel en de sinusnode te voorkomen. Na deze procedure kunnen andere maatregelen, zoals conventionele glazen mitrale elektrode-registraties, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over commutatieve transmembraanpotentiaal-kenmerken te beantwoorden. Na de ontwikkeling heeft deze techniek onderzoekers op het gebied van intellectuele fysiologie de weg vrijgemaakt om atriumaritmieën te onderzoeken, waaronder disfunctie van de sinoatriale knoop in het hart.

Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u optische mapping met hoge resolutie uitvoert op een preparaat van de sinusknoop van een muis.