Driedimensionale Super resolutie microscopie van de F-actine filamenten door interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM)
1 december 2016
We presenteren een protocol voor de toepassing van interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM), een 3-dimensionale single-molecule lokalisatie super resolutie microscopie methode, aan de beeldvorming van het actine cytoskelet in hechtende zoogdiercellen. Deze aanpak maakt het mogelijk op basis van licht visualisatie van nanoschaal structurele kenmerken die anders onopgelost zouden blijven door middel van conventionele diffractie beperkt optische microscopie.
Het algemene doel van deze procedure is om het actinecytoskelet in adherante zoogdiercellen op ultrastructureel niveau te visualiseren, met behulp van een driedimensionale superresolutiemicroscopiemethode genaamd iPALM. iPALM-beeldvorming biedt sub-trendende nanometer ruimtelijke resolutie in alle drie dimensies. Dit maakt het mogelijk om ultrastructuren te visualiseren met behulp van fluorescentie-sondes, waardoor een hoge etiketteringsspecificiteit mogelijk is.
De procedure die in deze video wordt gepresenteerd, zou snel aanpasbaar en instructief moeten zijn voor het visualiseren van andere ultrastructurele kenmerken in cellen door enkelmolecuul lokalisatie op basis van superresolutiemicroscopie. Begin deze procedure door de cellen voor te bereiden op dekglazen in een zes-putjesplaat. Gebruik fijne pincetten om voorzichtig de monstersdekglas uit de bufferput te verwijderen om het beeldvormingsmonster samen te stellen.
Tik vervolgens snel en voorzichtig overtollig buffer weg door de rand van het dekglas aan te raken met gevouwen, absorberend papier. Plaats het dekglas met de celzijde naar boven op een stuk schoon lenspapier. Spoel het monster door 30 tot 50 microliter van de beeldvormingsbuffer op het monster te plaatsen.
Verwijder overtollig buffer door te kantelen en te tikken met gevouwen absorberend papier. Na het herhalen van de spoelstaps een paar keer, plaats 30 tot 50 microliter beeldvormingsbuffer op het monster. Droog de rand van het dekglas af met een doek en plaats meerdere zeer kleine stippen van snel uithardende epoxy op het droge gebied.
Laat langzaam een ander vooraf gereinigd nummer 1.5 dekglas op het centrum van het celbevattende 22 millimeter dekglas zakken. Laat de beeldvormingsbuffer beide dekglazen bevochtigen door capillaire actie. De kleine stippen van snel uithardende epoxy moeten op beide dekglazen hechten.
Druk voorzichtig op het geassembleerde monster met gevouwen absorberend papier om de druk gelijkmatig te verdelen. Gebruik voldoende druk om de monstercel dun en egaal te maken, maar niet zo veel om de cellen te verpletteren. Schaal de juiste dikte af door het Newton's ringpatroon te observeren.
Zorg ervoor dat u deze stap voorzichtig uitvoert om luchtbellen te minimaliseren. Indien nodig, oefen u eerst met lege dekglazen. Vervolgens verzegelt u het monster met gesmolten vaseline lanoline paraffine.
Spoel vervolgens het verzegelde monster met gedeïoniseerd water. Droog het monster af met perslucht om klaar te zijn voor montage op de microscoop. Beweeg de veerbelaste bovenobjectieflens omhoog om de monsterhouder te kunnen verwijderen.
Plaats het verzegelde specimen op de monsterhouder en bevestig het met verschillende kleine zeldzame aardmagneten. Breng immersieolie aan op beide zijden van het beeldvormingsmonster. Plaats de monsterhouder terug in de optische baan en laat de bovenobjectieflens voorzichtig zakken.
Schakel de excitatielasers in. Schakel ook de EMCCD-camera's in frame transfer-modus in. Draai vervolgens de juiste emissiefilters in.
Activeer een mechanische sluiter om de bovenste straalpad te blokkeren en de onderste straalpad te openen. Breng de onderste objectieflens in focus door in kleine incrementen te vertalen met behulp van de piezo-actuator. Zodra het referentiepunt in focus staat, opent u de bovenste straalpad terwijl u de onderste straalpad blokkeert en brengt u de bovenste objectieflens op dezelfde manier in focus.
Bewaak de breedte van het referentiepunt op het computerscherm voor optimale focus. Voor correcte centrering, opent u zowel de bovenste als de onderste straalpad. Pas handmatig de bovenste objectieflens aan terwijl de onderste objectieflens constant wordt gehouden met behulp van een paar microfijne setscrews totdat de beelden van de referentiepunten zo dicht mogelijk overlappen, idealiter binnen één pixel.
Voer vervolgens fijne aanpassingen uit zodat de beelden van de referentiepunten binnen een tiende van een EMCCD-pixel overlappen. Pas de top twee as-piezo gemonteerde spiegels aan via de besturingssoftware terwijl u beide objectieven en de onderste reflectiespiegels constant houdt. Vergelijk de centra van de referentiepunten van de bovenste en onderste objectiefweergaven via het computerscherm om het proces te begeleiden.
Met de lasers aan, de camera's continu streaming en beide bovenste en onderste straalpaden open, oscilleert u de monsterhouder Z piezo met behulp van een sinusvormige spanningsgolfvorm die wordt gegenereerd door de besturingssoftware voor een continue Z-as oscillatie over een magnitude van 400 nanometer. Vertaal handmatig de gemotoriseerde straafferdelerassemblage omhoog of omlaag totdat de intensiteit van het referentiepunt oscilleert. Vanwege het gewenste enkele foton interferentiëffect, betekent dit de nauwe aanpassing van de optische padlengten.
Een piek tot dale verhouding van meer dan 10 kan in optimale gevallen worden bereikt. Om ervoor te zorgen dat zowel de amplitude als fase op elk oppervlak zo uniform mogelijk zijn over het veld, pas de onderste spiegel van de straafferdelerassemblage in kleine stappen aan om de opening en de hoeken van de helling fijn af te stellen. Voer fijne uitlijning van de straafferdeler uit door het monster in stappen van acht nanometer Z over 800 nanometer te vertalen.
Bewaak de intensiteit van het referentiepunt tussen camera's één tot drie. Pas de hoogte, positie en helling van de onderste spiegel binnen de straafferdelerassemblage in kleine stappen aan, zodat de oscillatiefase van camera één ten opzichte van camera twee maximaal is, idealiter op 120 graden. Zodra de initiële uitlijning voltooid is, vertaal het monster om een geschikt gezichtsveld te scannen dat zowel cellen om af te beelden als meerdere referentiepunten in de buurt bevat.
Plaats een behuizing rond het systeem om zwerflicht en omgevingsstoringen te blokkeren. Zodra het beeldvormingsgebied is gevonden, vertaal het monster opnieuw en neem de kalibratiecurve op voor gebruik bij latere Z-coördinaatextracties. Gebruik de opdracht kalibratiescans verwerven versus monsterpiezo-positie in de hoofdinterface.
Zodra een gewenst gebied is gevonden en de kalibratiecurve is verkregen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het gebruik van interferometrische PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM) om het actine-cytoskelet in adherente zoogdiercellen te visualiseren. De methode maakt resolutiebeelden van nanostructuren die doorgaans niet zichtbaar zijn met conventionele microscopietechnieken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Het actine-cytoskelet speelt een cruciale rol in de celstructuur en -functie.
- Conventionele microscopiemethoden worden beperkt door diffractie.
- Superresolutietechnieken maken verbeterde beeldvormingsmogelijkheden mogelijk.
- iPALM maakt driedimensionale beeldvorming met nanometerresolutie mogelijk.
Doel van de studie
- Om het actine-cytoskelet op ultrastructureel niveau te visualiseren.
- Om de aanpasbaarheid van iPALM aan te tonen voor het imagen van diverse cellulaire structuren.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers in dit vakgebied.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van adherente zoogdiercellen op dekglasjes.
- Toepassing van fluorescentie-probes voor een hoge labelingsspecificiteit.
- Gebruik van fijne pincetten voor de monsterverwerking.
- Implementatie van iPALM voor beeldvorming met nanoschaalresolutie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van het actine-cytoskelet in drie dimensies.
- Demonstratie van een hoge ruimtelijke resolutie bij het in beeld brengen van cellulaire structuren.
- Het protocol is aanpasbaar voor andere ultrastructurele kenmerken.
- Hoge labelingspecificiteit bereikt met fluorescentiesondes.
Conclusies
- iPALM is een effectieve methode voor het bestuderen van het actine-cytoskelet.
- Het protocol kan worden toegepast op diverse cellulaire imaging-behoeften.
- Deze benadering vergroot ons begrip van de cellulaire ultrastructuur.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Het visualiseren van het actine-cytoskelet op nanoschaalresolutie maakt mechanische risicoreductie bij targetvalidatie mogelijk door de structurele dynamiek van cytoskeletregulatoren te onthullen. Dit ondersteunt het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door architectuur op moleculaire schaal te koppelen aan functionele fenotypes in ziekterelevante systemen. De aanpasbaarheid van de methode voor andere ultrastructurele kenmerken verbetert de translationele continuïteit over de verschillende stadia van ontdekking.
Strategische toepassingen in biopharmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar actine-afhankelijke signaleringspaden en mechanotransductiemechanismen die relevant zijn voor therapeutische doelwitten.
- Operationele waarde: Biedt kwantitatieve ruimtelijke mapping van de filamentorganisatie om target-interactie in cellulaire contexten te verduidelijken.
- Predictieve waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door ultrastructurele veranderingen bij modulatie van het doelwit in kaart te brengen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gegevens met een hoge specificiteit en een resolutie van minder dan 20 nm voor het valideren van fenotypische screening-hits die de cytoskeletdynamiek beïnvloeden.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare, isotrope 3D-lokalisatieoutputs die geschikt zijn voor assay-standaardisatie en automatisering.
- Schaalbaarheid: Aanpasbaar aan multi-well formaten en diverse fluorofoor-geconjugeerde probes voor target-agnostische ultrastructurele fenotypering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Slaat de brug tussen ontdekking en preklinische validatie door directe observatie van actine-remodellering in ziektemodellen mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Faciliteert de afstemming van biomarkers via correlatieve beeldvorming van de cytoskeletarchitectuur met functionele read-outs.
- Risicobeperking: Verhoogt het vertrouwen in de identificatie van lead-verbindingen door ambiguïteit in interpretaties van het werkingsmechanisme te verminderen.
Integratie van Pipeline en Workflow
De methode integreert in vroege discovery-workflows door ultrastructurele read-outs te bieden die beslissingen over target-validatie en lead-optimalisatie informeren voorafgaand aan de preklinische fase.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten van cytoskeletregulatoren via directe visualisatie van filamentreorganisatie.
- Screening: Maakt assay-ready, quantificatie-compatibele imaging van de actinearchitectuur mogelijk voor hit-bevestiging en SAR-exploratie.
- Analytics: Levert fase-opgeloste, multi-channel lokalisatiedata die statistische vergelijking van structurele fenotypes tussen verschillende condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt actinestructuren op nanoschaal met cellulaire functies in preklinische modellen via correlatieve structureel-functionele analyse.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbare superresolutie-capaciteit voor studies naar het cytoskelet, adhesie en organellen over verschillende projecten heen.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door mechanistische ambiguïteit in signaleringsknopen van het cytoskelet op te lossen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid door gekalibreerde interferometrische fase-extractie en uitlijning op basis van fiduciale markers.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door ultrastructureel bewijs te leveren van target-interactie en modulatie van signaalpaden.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van cytoskelet-targets mogelijk op basis van fenotypische resolutie op nanoschaal.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in single-molecule lokalisatiemicroscopie en interferometrische signaalverwerking.
- Is afhankelijk van stabiele EMCCD-camera's, piezo-actuatoren en multi-laser excitatiesystemen voor 3D-fase-extractie.
- Noodzaakt standaardisatie tussen teams voor monsterpreparatie, fiduciale labeling en omgevingscontroles ter minimalisering van drift.
- Aanpassing aan alternatieve modellen vereist optimalisatie van de labelingdichtheid, buffercompatibiliteit en montageprotocollen.
- Praktische beperkingen omvatten monsterdrift tijdens langdurige acquisities en de noodzaak van een hoge fotonopbrengst van photoswitchable probes.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:55
Imaging Specimen Preparation
3:11
Sample Placement and iPALM Alignment
5:29
Calibration of the iPALM Setup
7:47
Data Acquisition
9:09
Results: Actin Cytoskeleton of Adherent Mammalian Cells Visualized by iPALM with Sub-20 nm Spatial Resolution in 3D
10:55
Conclusion
