Name: Flow cytometrische analyse van de NK-cel lytische activiteit in humaan volbloed (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Leer een snelle en betrouwbare methode voor de analyse van NK-cel lytische activiteit in humaan volbloed. Deze techniek biedt reproduceerbare resultaten voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd ondersteund door de Agriculture and Food Research Initiative Competitieve Subsidie nr. 2100-68003-30395 van het USDA National Institute of Food and Agriculture.

LET OP: Alle incassoprocedures bloed werden uitgevoerd in overeenstemming met de uiteengezet door de Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB) richtlijnen. 1. Hele bloedafname <ol><li> Heeft u een gecertificeerde phlebotomist bloed te trekken volgens de richtlijnen van de World Health Organization. </li><li> Trekken bloed in een 4 ml bloedafname met Di-Kalium Ethyleendeniaminetetraacetaat (K 2 EDTA). Inverteer bloedafname volgens de instructies van de fabrikant. Houd bloedafname bij kamertemperatuur op een bankje-top rocker tot scheiding. </li></ol> 2. Voorbereiding van de DIO-gelabelde doelcellen <ol><li> Groeien K562 cellen in compleet Iscove&#39;s gemodificeerd Dulbecco&#39;s Media (IMDM), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline streptomycine gedurende verscheidene weken voorafgaand aan de test om de gezondheid van de cellen te waarborgen. Pas de concentration van de cellen 3 x 10 5 cellen / ml dagelijks door de voltooiing van een celgetal en daaropvolgende passage van cellen. Voer een volledige media veranderen elke 2 tot 3 dagen. </li><li> Op de dag van de test uitvoert een celtelling met een 1: 1 hemocytometer. <ol><li> Verwijderen 10 pi uit de K562 kolf en plaats in 1,5 ml buis. </li><li> Voeg 10 ul van trypan blauwe kleurstof in dezelfde 1,5 ml buis voor een verdunningsfactor van 1: 1. </li><li> Zachtjes flick buis K562 cellen mixen en trypan blauw kleurstof. </li><li> Sta K562 cel-trypan blauwe kleurstof incuberen 1 min bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder 15 pi van gebrandschilderd K562 cellen uit buis. </li><li> Pipet op hemocytometer voor celgetal. </li><li> Aantal cellen in de vier hoeken vierkanten en het middelste vierkant in totaal vijf vierkanten. </li><li> Bereken cellen met de volgende formule: Total cellen / ml = Total cellen geteld X (verdunningsfactor / aantal vierkantjes) X 10.000 / mL </li></ol></li&gt; <li> Resuspendeer K562 doelcellen in een uiteindelijke dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml in serumvrij IMDM kweekmedium. </li><li> Voor ongekleurde K562 doelcellen, voeg 10 ml K562 targetcellen een 15 ml buis bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml voor een totaal van 10 x 10 6 K562 cellen. Plaats in een 37 ° C incubator met 5% CO 2 tot aan gebruik. </li><li> Dio gekleurd K562 doelcellen, voeg 10 ml K562 doelcellen een 15 ml buis bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml voor een totaal van 10 x 10 6 K562 cellen. <ol><li> Voeg 1 ul van DIO cel-labeling oplossing per ml celsuspensie in 15 aangewezen voor DIO kleuring en voorzichtig vortex ml buis. Bijvoorbeeld, voeg 10 ul van cel-labeling oplossing Dio 10 x 10 6 K562 cellen / ml in een volume van 1 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Incubate K562-dio oplossing gedurende 20 minuten bij 37 ° C met 5% CO2 in een 15 ml buis. </li></ol></li><li> Volgening incubatie 3 ml kamertemperatuur fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan K562-Dio oplossing die 15 ml buis. </li><li> Centrifugeer 10 min bij 135 xg bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder voorzichtig supernatant zonder verstoring van de cel pellet met een 1000 ui volume verstelbare pipet. </li><li> Voeg 10 ml vers IMDM naar cel pellet bevattende 15 ml buis. </li><li> Voorzichtig vortex buis om de cellen te resuspenderen. </li><li> Herhaal stap 2,7-2,10 twee keer. </li><li> WINKEL cellen in een 37 ° C incubator met 5% CO 2 tot aan gebruik. OPMERKING: Cellen kunnen worden opgeslagen in de incubator gedurende maximaal 24 uur, maar het de voorkeur om ze te gebruiken op dezelfde dag. </li></ol> 3. Voorbereiding van Controls <ol><li> Breng de volgende in afzonderlijke en gemerkte 1,5 ml buizen: <ol><li> Voeg 500 ul van vers IMDM dat gesuspendeerd DIO-gelabelde K562 cellen in de &quot;Double Positive&quot; gelabeld 1,5 ml buis. </li><li> Voeg 500 ul van vers IMDM dat gesuspendeerd DIO-gelabelde K562 cellen in de &quot;enige dio&quot; gelabeld 1,5 ml buis. </li><li> Voeg 500 ul vers IMDM geresuspendeerd met ongelabelde K562 cellen in de &quot;propidiumjodide (PI) in&quot; gelabelde 1,5 ml buis. </li></ol></li><li> Breng het dubbele positieve en PI alleen buizen in een 55 ° C waterbad gedurende 5 min. </li><li> Na 5 minuten is verstreken verwijderen buizen en afvegen met 70% ethanol. </li><li> Voeg 10 L van PI Double positieve en PI slechts 1,5 ml buizen. </li><li> Plaats alle drie K562 doelcel controles in de incubator bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Na 30 minuten incubatie is verstreken, centrifuge drie K562 doelwitcel regelaars voor 2 min bij 163 x g. </li><li> Verwijder voorzichtig supernatant zonder verstoring van de cel pellet. </li><li> Resuspendeer elk besturing met 20 pL vers IMDM celkweekmedia, en laat in de 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende ten minste30 min voor een optimale Dio signaal. LET OP: De controles zijn nu klaar om cytometer worden uitgevoerd door de beeldvorming flow. </li></ol> 4. NK Cell Geautomatiseerde Separation <ol><li> Schakel cel afscheider en laat de start-up cyclus te beëindigen. </li><li> Zorg ervoor dat alle vloeistof flessen verlichtingen zijn groen en dat de fles afval leeg is. </li><li> Zorg voor een kamertemperatuur van 15 ml buis rack. LET OP: De selectie is gebaseerd op de steekproef volumes. Bijvoorbeeld, voor een hoeveelheid van minder dan 3 ml gebruiken een 15 ml buis en rek voor een volume van meer dan 3 ml gebruiken een 50 ml buis rek. </li><li> Label monsterbuizen dienovereenkomstig (Repeat per monster / deelnemer): Deelnemer 1 volledig bloedmonster; Deelnemer 1 Negatieve fractie; Deelnemer 1 Positief fractie. </li><li> Voorzichtig pipet 1,5 ml volbloed van Stap 1.2 in &quot;Whole Blood Sample&quot; 15 ml buis. </li><li> Plaats op geschikte wijze gemerkte 15 ml &quot;Whole Blood Sample&quot; buis uit stap 4.5 en gelabeld 15 ml &quot;Negatief Fraction&quot; en&quot;Positief Fractie&quot; buizen uit stap 4.4 in de buis rack. Gebruik thefollowing sample rack set-up: Rij (R1) A: volledig bloedmonster, Row (R2) B: Negatief, ongelabelde fractie, Row (R4) C: Positief, magnetisch gemerkte fractie. </li><li> Plaats de separator rack op de MiniSampler voor autolabeling. </li><li> Selecteer &quot;reagens&quot; op het menu en markeer de positie waar de flacon in de afscheider rack wordt geplaatst. </li><li> Selecteer &quot;Lees Reagent&quot; naar de 2D-codelezer activeren. </li><li> Plaats het reagens flacon voor de 2D-codelezer tussen 0,5-2,5 cm vanaf de codelezer deksel. OPMERKING: Bijvoorbeeld, de vereiste reagens NK celscheiding is CD56. </li><li> Houd reagensflesje schuin voor 2D-codelezer optimaal lezen. </li><li> Plaats de reagensflesje in de juiste afscheider rack positie. </li><li> Markeer de gewenste posities op het tabblad Separation op het scherm. </li><li> Vanaf het submenu Labeling, wijst u een autolabeling programma. </li><li> Wijs de Cell Separation Reagent CD56 microbolletjes posities 1, 2, 3, en 4 rack. </li><li> Selecteer de &quot;posselwb&quot; scheiding programma. </li><li> Selecteer de &quot;spoelen&quot; wasprogramma. </li><li> Plaats een sample volume van 1500 pi in de &quot;Volume&quot; submenu met behulp van het numerieke toetsenbord. </li><li> Selecteer de &quot;Enter&quot; optie op het toetsenbord. </li><li> Selecteer &quot;Run&quot; om de scheiding cel te starten. </li><li> Selecteer &quot;OK&quot; om te bevestigen dat er voldoende buffer is beschikbaar voor de verwerking van alle monsters. </li></ol> 5. NK Cell Count Na Cell Separation <ol><li> Onmiddellijk na celscheiding met de cel separator, halen de positieve fractie. Laat bij kamertemperatuur. Deze fractie bevat de gewenste zuivere NK celpopulatie. </li><li> Voor elk individueel monster, het uitvoeren van een aantal cellen met behulp van een hemocytometer als per stap 2.2. <ol><li> Na de berekeningen, noteer de celgetal. </li&gt; </ol></li></ol> 6. cytotoxiciteit Assay Monstervoorbereidingstesten <ol><li> Bereid en label 1,5 ml buizen voor elk monster / deelnemer dienovereenkomstig. </li><li> Pipet gewenste verhouding van NK-cellen en DIO-gelabeld K562 cellen in elke buis. OPMERKING: Bijvoorbeeld, de gewenste verhouding van K562 doelwitcellen en effector NK cellen 1: 5. </li><li> Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 135 x g. </li><li> Verwijder voorzichtig supernatant zonder verstoring van de cel pellet. </li><li> Resuspendeer NK-Dio gemerkte K562 celmengsel in 500 pi van NK celmedium zonder interleukine-2 (IL-2) en 2-mercaptoethanol (2-ME) (incomplete NK celkweekmedium). LET OP: De onvolledige NK media voor celkweek is Minimum Essential Medium Eagle met natriumbicarbonaat, zonder L-glutamine, ribonucleosiden en deoxyribonucleosides. </li><li> Voeg 5 ul van PI aan elke buis. </li><li> Centrifugeer gedurende 2 min bij 163 x g. </li><li> Incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Na 2 uur incubatie, centrifugalege gedurende 2 minuten bij 163 x g. </li><li> Verwijder voorzichtig supernatant zonder verstoring van de cel pellet. </li><li> Resuspendeer cellen in 25 ul onvolledige NK celkweek media. </li></ol> 7. Bereiding van Spontane ( &quot;S&quot;) Sample <ol><li> Pipetteer 500 ul van DIO-gelabelde K562 cellen (concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml) in 1,5 ml buis. </li><li> Voeg 10 ul van PI aan elke buis. </li><li> Centrifugebuis gedurende 2 minuten bij 163 x g. </li><li> Incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Na 2 h incubatie centrifugeer gedurende 2 min bij 163 x g. </li><li> Verwijder voorzichtig supernatant zonder verstoring van de cel pellet. </li><li> Resuspendeer cellen in 25 ul incomplete alpha-Minimum Essential Medium (α-MEM) celkweek media. </li></ol> 8. Data Acquisition met Imaging flowcytometer <ol><li> Druk op de groene knop in de voordeur van de imaging stromingscytometer te schakelen op het instrument. </li><li> Zet all computers in verband met de beeldvorming flowcytometer. </li><li> Start de imaging flowcytometer software. </li><li> Klik op de &quot;Startup&quot; knop om het systeem te spoelen en de voorbereiding van het monster lijn. </li><li> Zodra de &quot;Startup&quot; is voltooid, sluit het venster &quot;Calibrations&quot;. </li><li> Wijs kanalen: op de bovenste linkerkant, klikt u op elk kanaal om ze toe te wijzen. </li><li> Aan de rechterkant, klikt u op de scatterplot knop om 4 scatterplots maken: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 en FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01. </li><li> Begin met het analyseren van monsters door eerst met behulp van de &quot;Double Positive&quot; control. <ol><li> Klik op &quot;Load.&quot; </li><li> Plaats de 1,5 ml buis met de &quot;Double Positive&quot; monster van Stappen 3,4-3,9 in het monster loader. </li><li> Selecteer de 40X doelstelling onder het tabblad &quot;Vergroting&quot;. </li><li> Schakel de 405 mW en642 mW lasers. </li><li> Schakel de &quot;Helderveld&quot; kanaal. </li><li> Klik op &quot;Select Intensity.&quot; </li><li> Op basis van de &quot;Double Positive&quot; controlemonster, bepalen de gewenste intensiteit van de laser 405 mW zodat de detector niet overbelast. Opmerking: Zo werd de optimale intensiteit voor dit experiment ingesteld op 11 mW. </li></ol></li><li> Nadat de gewenste set-up wordt bereikt, te verwerven gegevens. <ol><li> Onder het tabblad &quot;File Acquisition&quot;, voer in een aangepaste bestandsnaam tekst. Selecteer een map voor het opslaan van de data file (s). </li><li> Voer het aantal cellen te verwerven naast &quot;Verzamel&quot;. Normaal gesproken is dit aantal varieert tussen 1000 tot 10.000. </li><li> Klik op &quot;te verwerven.&quot; LET OP: Als het gewenste aantal cellen is verkregen, wordt het bestand automatisch opgeslagen in de eerder geselecteerde map. </li></ol></li><li> Na de overname is voltooid, plaatst u de volgende controle monster - Dio alleen controle. </strong&gt; <ol><li> Klik op &quot;Load.&quot; </li><li> Plaats de 1,5 ml buis met de &quot;DIO only&quot; monster in het monster loader. </li><li> Laat de 40X doelstelling onder het tabblad &quot;Vergroting&quot; geselecteerd. </li><li> Laat de 405 mW laser ingeschakeld. </li><li> Schakel de 642 mW laser en de &quot;Helderveld&quot; kanaal. OPMERKING: Nu de gewenste opstelling is bereikt, kan data worden verkregen. </li><li> Onder het tabblad &quot;File Acquisition&quot;, voer in een aangepaste bestandsnaam tekst en selecteer een map voor het opslaan van de data file (s). Voer het aantal cellen te verwerven naast &quot;Collect.&quot;. Meestal is dit getal 1000. </li><li> Klik op &quot;te verwerven.&quot; LET OP: Als het gewenste aantal cellen is verkregen van de gegevens wordt automatisch opgeslagen in de eerder geselecteerde map. </li></ol></li><li> Herhaal stap 8.10 voor de &quot;PI-only&quot; controlemonster. De experimentele monsters zijn nu klaar om te worden verzameld. </li><li> Behandel de remaining experimentele monsters, inclusief de &quot;spontane&quot; S &quot;monsters&quot; als volgt: <ol><li> Laat de 40X doelstelling onder het tabblad &quot;Vergroting&quot; geselecteerd. </li><li> Zet de 405 mW en 642 mW lasers. </li><li> Zet de &quot;Helderveld&quot; kanaal. </li><li> Klik op &quot;Set Intensity.&quot; </li><li> Onder het tabblad &quot;File Acquisition&quot;, voer in een aangepaste bestandsnaam tekst en selecteer een map voor het opslaan van de data file (s). Voer in een aangepaste bestandsnaam tekst. </li><li> Voer het aantal cellen te verwerven naast &quot;Collect.&quot; </li><li> Klik op de &quot;Acquire&quot; knop. LET OP: Als het gewenste aantal cellen is verkregen van de gegevens wordt automatisch opgeslagen in de eerder geselecteerde map. </li></ol></li><li> Herhaal stap 8.12 voor alle experimentele monsters. </li><li> Na alle experimentele gegevens en bestanden zijn verzameld, klikt u op de &quot;Afsluiten&quot; knop om het systeem te steriliseren. </li></ol> 9. Imaging flowcytometer Sample Analysis <ol><li> Open de beeldvorming flowcytometer analyse software. </li><li> Onder &quot;File&quot;, opent een experimentele .RIF bestand. </li><li> Bouw een nieuwe matrix met behulp van de enkele kleur .RIF bestanden (DIO-uitsluitend het beheer en PI-only control, gemaakt tijdens stappen 8.10 en 8.11) door te kiezen voor &quot;Create a New Matrix&quot; onder het tabblad Compensation in de imaging flowcytometer software. OPMERKING: De software vraagt ​​voor de selectie van één kleur bestanden en samenvoegen tot een matrix bestand (.ctm extensie) te creëren, die wordt geselecteerd kanaalcompensatie passen. </li><li> Maak dot plots met behulp van de functie &quot;bouwstenen&quot; van de software. <ol><li> Maak een dot-plot (BrightFieldGradient_RMS vs frequentie) aan de poort van de gerichte cellen. Bel de gate &quot;Focus&quot; (Figuur 1A). </li><li> Met behulp van de &quot;Focus&quot; poort, maak een dot plot van Bright Field Area vs Bright Field beeldverhouding g<html> at de singlet cellen. Bel de gate &quot;Single&quot; (Figuur 1B). </li><li> Met behulp van de &quot;Single&quot; poort, maak een dot plot van Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Gebruik dit perceel te identificeren en gate DIO-positieve alleen cellen (targets, levend) en PI-DIO dubbele positieve cellen (targets, dood) (figuur 1C). LET OP: Alle percelen beschreven in de stappen 9.4.1, 9.4.2 en 9.4.3 kan worden gemaakt met behulp van de functie &quot;bouwstenen&quot; van de software. </li></ol></li><li> Klik op de statistieken functie van de dot plot om toegang te krijgen cel aantallen van elke poort. </li><li> Bereken het percentage dode doelen in de spontane monster en proefmonsters volgens de volgende formule: % Dode doelwitten in het monster = (#dead targets x 100) / (# wonen targets + #dead targets) </li><li> Bereken cytotoxiciteit met de volgende formule: % Cytotoxiciteit = [(Experimental dead-Spontaan dood) / (100-Spontane dood)] x100 </li></ol>_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54779/54779fig1.jpg" /> Figuur 1: Representatieve histogrammen, scatter plots en afbeeldingen voor cytotoxische activiteit analyse. (A) aandacht cel analyse. (B) single cell analyse. (C) doelwitcel kleuring analyse. Alle bepalingen worden uitgevoerd met de afbeelding bij elke gebeurtenis. Dit kan in de analyse software worden benaderd door simpelweg te klikken op het evenement op de grafieken. (D) representatief beeld van een doublet evenement, dat een apoptotische NK cel en een live-K562 doel. CH01, Helderveld. CH02, Dio. CH05, PI. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54779/54779fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<ol><li>Cerwenka, A., Lanier, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells%2C+viruses+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells, viruses and cancer.</a> Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).</li>
<li>Nieman, D. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7883395">Exercise, infection, and immunity.</a> Int J Sports Med. 15, Suppl 3 131-141 (1994).</li>
<li>Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+activity%2C+immunity+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nutr+Soc%22%5BJournal%5D)">Physical activity, immunity and infection.</a> Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).</li>
<li>Nieman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marathon+training+and+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Marathon training and immune function.</a> Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).</li>
<li>Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+and+the+Regulation+of+Immune+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Exercise and the Regulation of Immune Functions.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).</li>
<li>Walsh, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+statement.+Part+one%3A+Immune+function+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Exerc+Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Position statement. Part one: Immune function and exercise.</a> Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).</li>
<li>Timmons, B. W., Cieslak, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+natural+killer+cell+subsets+and+acute+exercise%3A+a+brief+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exerc+Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review.</a> Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).</li>
<li>Westermann, J., Pabst, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+lymphocyte+subsets+and+natural+killer+cells+in+the+human+body%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Investig%22%5BJournal%5D)">Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body.</a> Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+leucocytes+from+human+blood.+Further+observations.+Methylcellulose%2C+dextran%2C+and+ficoll+as+erythrocyteaggregating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Clin+Lab+Invest+Suppl%22%5BJournal%5D)">Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).</li>
<li>McMillan, R., Scott, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+labeling+with+51-Chromium.+I.+Technic+and+results+in+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects.</a> Blood. 32 (5), 738-754 (1968).</li>
<li>Berk, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+long+endurance+running+on+natural+killer+cells+in+marathoners%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners.</a> Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).</li>
<li>McAnulty, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+blueberry+ingestion+on+natural+killer+cell+counts%2C+oxidative+stress%2C+and+inflammation+prior+to+and+after+2.5+h+of+running%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Physiol+Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running.</a> Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).</li>
<li>Millard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+Exercise+Increases+Peripheral+Blood+NK+Cell+Counts+without+Immediate+Functional+Changes%2C+but+Impairs+their+Responses+to+ex+vivo+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation.</a> Front Immunol. 4, 125(2013).</li>
<li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaneway%2C+CA+%22Immunobiology%3A+The+Immune+System+in+Health+and+Disease.+5th+edn%22">Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn</a>. , Garland Science. (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De werkwijze beschreven in deze studie meet direct de specifieke activiteit van NK-cellen van een individu in reactie op stimuli (in dit geval, langdurige oefening). Kenmerkend worden NK-cellen geïsoleerd van bloed dichtheidsscheiding gradiënten of celsortering door een combinatie van merkers. Hoewel deze werkwijzen op grote schaal worden gebruikt, hebben veel nadelen: ze zijn tijdrovend, omvatten meerdere manipulaties en zijn sterk afhankelijk van de gebruiker. Hierdoor wordt onnodige nadruk gelegd op de geïsoleerde NK...

Natural killer cellen zijn een essentieel onderdeel van het aangeboren immuunsysteem. Terwijl de kamers worden gereguleerd, ze hebben de mogelijkheid om te herkennen en te elimineren abnormale cellen via cel-cel contact en zonder voorafgaande activering 1. Als zodanig vormen ze een snelle lijn van verdediging tegen infecties. Oefening, intense, is aangetoond dat tijdelijk onderdrukken van het immuunsysteem 2, 3, 4, 5. NK-cellen zijn bijzonder gevoelig voor dit effect 4, 6, 7, waardoor effectief een venster van verhoogde gevoeligheid voor ziekte. Vandaar dat de studie van interventies voor, tijdens of na intensieve training met als doel het verminderen van de gevolgen NK celfunctie van bijzonder belang is voor het welzijn van atleten na wedstrijden. 8 bij ongeveer 1% van de witte bloedcellen compartiment; 2) NK-cellen zeer gevoelig zijn voor stress en vertrouwen op constante blootstelling aan fysiologische omstandigheden levensvatbaar en stabiel tijdens experimenten te blijven; en 3) standaard assays voor NK-cel cytotoxiciteit te bepalen, zoals Ficoll gradiënten 9 kort assays 10, onbetrouwbaar en inconsistent. De inherente variabiliteit van menselijke stalen verbinding alleen deze kwesties. Verse menselijke monsters verzameld tijdens ingrepen zijn vrij geregeld en moeilijk te schaffen, tenminste in vergelijking met diermonsters of geïmmortaliseerde cellijnen. Dit vermindert de kansen om experimenten te herhalen of de deelnemers aan de studie cohort om significante statistische drempels bereiken. Tezamen zijn deze problemen achter de noodzaak voor een gestroomlijnde protocol waarmee for zowel high-throughput en een zeer betrouwbare analyse van de NK-cel lytische activiteit in menselijke monsters. We hebben een workflow dat de tijd verkort die nodig zijn om te identificeren, te isoleren en te testen NK-cellen uit menselijk bloed terwijl het minimaliseren van de blootstelling aan externe factoren. De werkwijze optimaliseert het gebruik van twee instrumenten, een magnetisch gebaseerde celsorteerinrichting en een beeldvormende stromingscytometer en een test-specifieke, geoptimaliseerde T: E verhouding tot de detectie van afname of toename van NK-cel cytotoxiciteit mogelijk.

<table><tbody><tr><td>K-562 lymfoblasten</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Gemodificeerd Dulbecco's Media</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>Hoge glucose, met L-Glutamine, met HEPES, Sterile-gefilterd</td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential medium</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td>Zonder ribonucleosiden en deoxyribonucleosiden maar met 2 mM L-glutamine en 1,5 g/L natriumbicarbonaat</td></tr><tr><td>Trypan Blauw Oplossing 0,4%</td><td>Amresco</td><td>K940-100ML</td><td>Weefselcultuurkwaliteit</td></tr><tr><td>Propridium Jodide Kleuring Oplossing</td><td>BD Pharmingen</td><td>51-66211E</td><td></td></tr><tr><td>Vybranto DiO cel-labeling oplossing</td><td>Vybranto</td><td>V-22886</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Running Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Washing Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-987</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Whole Blood CD56 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-875</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream X Mark II Beeldvorming Flow Cytometer</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speedbeads</td><td>Amnis Corporation</td><td>400030</td><td></td></tr><tr><td>0,4-0,7% Hypochloriet (Sterilizer)</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Clenz</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>70% Isopropanol (Debubbler)</td><td>EMD Millipore</td><td>1.3704</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (Sheath vloeistof)</td><td>EMD Millipore</td><td>BSS-1006-B (1X)</td><td>Geen calcium of magnesium</td></tr><tr><td>INSPIRE Software</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Versie Mark II, september 2013</td></tr><tr><td>Ideas Toepassing Software</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Versie 6.1, juli 2014</td></tr></tbody></table>

flow cytometrische analyse van de nk-cel lytische activiteit in humaan volbloed

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK-cel cytotoxiciteit is een veel gebruikte maat voor het effect van externe interventie NK celfunctie bepalen. Echter, de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van deze test onstabiel beschouwd, hetzij door een vergissing gebruiker of vanwege de gevoeligheid van NK cellen voor experimentele manipulatie. Om deze problemen te elimineren, een workflow die hen reduceert tot een minimum werd opgericht en wordt hier gepresenteerd. Ter illustratie, we bloedmonsters op verschillende tijdstippen van lopers (n = 4), die een intensieve training opgemeten werden. Eerst worden NK-cellen tegelijkertijd geïdentificeerd en geïsoleerd door middel van CD56-tagging en magnetische gebaseerde sortering direct uit volbloed en van slechts één milliliter. De gesorteerde NK cellen verwijderd van elke reagens of capping antilichamen. Ze kunnen worden geteld om een ​​nauwkeurige NK cellen vast per milliliter bloed. Ten tweede kan de gesorteerd NK-cellen (effector cellen of E) worden gemengd met 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine perchloraat (DIO) hebben K562 cellen (doelcellen of T) en een test-optimaal 1: 5 T: E-verhouding en geanalyseerd met een beeldvormende flow cytometer dat zorgt voor de visualisatie van elk voorval en het verdwijnen van een valspositieve of valse negatieven (zoals doubletten of effectorcellen). Deze workflow kan worden voltooid in ongeveer 4 uur, en zorgt voor een zeer stabiele resultaten, zelfs bij het werken met menselijke monsters. Indien beschikbaar, kunnen onderzoeksteams testen verschillende experimentele interventies bij menselijke proefpersonen, en vergelijk metingen tussen verschillende tijdstippen, zonder afbreuk te doen aan de integriteit van de gegevens.

Bepaling van NK cellen Het effect van zware verkeer op NK cellen in volbloed werd berekend op basis van de inspanningsprotocol in figuur 2 beschreven. Bloedmonsters werden voor de inspanning, onmiddellijk na de training, 1,5 uur na inspanning, en tenslotte 24 en 48 uur na de eerste bloedafname. De concentratie van NK cellen per milliliter bloed werd gemeten voor elke loper (figuur 3A) en gemiddeld (Figuur 3B) voor elk tijdstip. </...

Dit werk beschrijft een geavanceerd werkproces voor de nauwkeurige en snelle bepaling van het NK (Natural Killer) celgetal en de NK celcytotoxiciteit in menselijke bloedmonsters.

Flow cytometrische analyse van de NK-cel lytische activiteit in humaan volbloed

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Het algemene doel van dit experiment is om het aantal NK-cellen en de niveaus van cytotoxische activering in een menselijk volbloedmonster op een snelle, betrouwbare en stabiele manier te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van immunologie, zoals, Wat zijn de effecten van externe interventies op de bioactiviteit van NK-cellen? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze snel en nauwkeurig is, terwijl nog steeds reproduceerbare resultaten over experimenten heen wordt geleverd.Om NK-cellen uit menselijk volbloed te isoleren, plaats eerst buizen van 15 milliliter met de labels Volbloedmonster, Negatieve Fractie en Positieve Fractie op de juiste posities in het tuberek van de celseparator. Wanneer alle buizen zijn geladen, plaats het scheidingsrekje op de mini-sampler voor automatische labeltoewijzing en selecteer Reagens op het menu om de positie te markeren waar de fles op het rekje zal worden geplaatst. Selecteer Reagens lezen om de 2D-codelezer te activeren en houd de juiste reagentiënfles in een hoek van 0,5 tot 2,5 centimeter van de codeleezerdeksel voor de 2D-codelezer.Plaats de gelezen fles in de juiste scheidingsrekpositie. Markeer vervolgens onder het tabblad Scheiding de gewenste posities. Open vervolgens het submenu Labeling en selecteer een automatisch labelprogramma.Wijz de celscheidingsreagensmicrobeads toe aan rekposities 1, 2, 3 en 4. En selecteer het Posselwb scheidingsprogramma. Selecteer het Spoel Was programma.Voer 1500 microliter in voor het Steekproefvolume onder het submenu Volume en druk op Enter. Klik vervolgens op Uitvoeren om de celscheiding te starten. Klik op OK om te bevestigen dat er voldoende buffer beschikbaar is voor het verwerken van alle monsters.Om een Cytotoxiciteit Assay-monster voor te bereiden, label eerst buizen van 1,5 milliliter voor elk monster en/of deelnemer zoals gepast, en pipeer de gewenste verhouding van NK-cellen en DIO-gelabelde K562-cellen in elke buis. Verzamel de cellen door centrifugatie en verwijder voorzichtig het supernatant zonder de celpellet te verstoren. Resuspendeer vervolgens het celmengsel in 500 microliter onvolledig NK-celmedium en label de cellen in elke buis met 5 microliter propidiumjodide.Verzamel de cellen via een andere centrifugatie en incubeer de celcultuur gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, centrifugeer de cellen onder dezelfde centrifugatiecondities en resuspendeer het pellet in 25 microliter vers onvolledig NK-celkweekmedium. Om de cellen te analyseren door flowcytometrie, klik eerst op de startknop in de imaging flowcytometersoftware om het systeem te spoelen.Klik vervolgens op de scatterplotknop om vier scatterplots te maken en laad de dubbel positieve controlebuis. Gebruik het dubbel positieve controlemonster om de gewenste intensiteit voor de 405 milliwattlaser te bepalen, zodat de detector niet overbelast raakt, en stel de imager in om het juiste aantal celtellingen te verwerven. Het instellen van de 405 milliwattlaser op een intensiteit die geschikt is voor de detectie van zowel DIO als PI zal ervaring vereisen met beide kleurstoffen en de detectiebereik van de flowcytometer.Nadat de acquisitie van het dubbel positieve controlemonster is voltooid, laad het DIO-alleen controlemonster, selecteer het 40X objectief en zet de 642 milliwattlaser en de Brightfield-kanaal uit. Kweek het juiste aantal cellen en herhaal de acquisitie voor het propidiumjodide-alleen monster. Wanneer alle controlemonsters zijn uitgevoerd, zet de 405 milliwattlaser en het Brightfield-kanaal weer aan en klik op Intensiteit instellen.Vervolgens, onder het tabblad Bestandsverwerving, voer een aangepaste bestandsnaam in en selecteer een map voor het opslaan van de gegevensbestanden. Voer vervolgens het aantal te verwerven cellen in. Laad de eerste experimentele steekproefbuis en klik op de Knop Verwerven.Wanneer alle monsters zijn uitgevoerd, open de imaging flowcytometeranalysesoftwareapplicatie en open een enkel experimenteel RIF-bestand. Selecteer onder het tab Compensatie Nieuwe Matrix maken. De software vraagt om de selectie van de enkelkleurige bestanden en voegt ze samen om een matrixbestand te maken dat kan worden geselecteerd voor het toepassen van de kanaalcompensatie.Gebruik de Building Blocks-functie om de juiste stipplots in te stellen. Klik vervolgens op de statistiekfunctie om toegang te krijgen tot het aantal cellen in elke gate. In dit representatieve experiment werden bloedmonsters genomen zoals aangegeven en werd de concentratie van NK-cellen per milliliter volbloed gemeten voor elke loper en gemiddeld voor elk tijdstip.Drie van de vier lopers vertoonden een soortgelijke lichte toename in het aantal NK-cellen na de oefening. Direct gevolgd door een scherpe daling, voordat ze langzaam terugkeerden naar normaal, 24 tot 48 uur na het einde van het evenement. Gemiddeld nam het aantal NK-cellen 1,5 uur na de oefening af, maar keerde terug naar bijna normale niveaus na 24 uur.Na het berekenen van het celtelling, werd de cytotoxische activiteit van de NK-cellen onmiddellijk geanalyseerd zoals zojuist is aangetoond, met een gemiddelde afname in NK-celcytotoxiciteit onmiddellijk en 1,5 uur na het beëindigen van de oefening, die significant toenam na 24 uur na de oefening. De NK-cytotoxiciteit bleef hoog vergeleken met de niveaus vóór de oefening, zij het niet significant. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in ongeveer vier uur worden voltooid wanneer deze correct wordt uitgevoerd.Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het aantal en de cytotoxische activiteit van NK-cellen uit menselijke bloedmonsters op een reproduceerbare hydropische manier kunt verkrijgen en karakteriseren.

flow-cytometric-analysis-natural-killer-cell-lytic-activity-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the lytic activity of natural killer cells against fluorescently-stained target cells. The method enables NK cell-induced cytotoxicity measurement by staining dead cells and using a flow cytometer to quantify live and dead target cells.

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

This video demonstrates performing a lactate dehydrogenase release assay to determine the cytotoxicity of natural killer (NK) cells against the target cancer cells. The assay quantifies the release of the cytoplasmic lactate dehydrogenase enzyme from cancer cells by measuring the absorbance of the red-colored product formed.

An In Vitro Assay for Evaluating Natural Killer Cell Cytotoxicity against Cancer Cells

Dit protocol beschrijft een gevoelige, cel-gebaseerde cytotoxiciteit assay. Door het tellen van de afname in frequentie van levende doelwit CD4+ T-cellen in aanwezigheid van een toenemend aantal effector CD8+ T-cellen, staat deze assay toe de directe beoordeling van de cytolytische activiteit van antigeen-specifieke CD8+ T-cellen.

Celgebaseerde flowcytometrie-test om cytotoxische activiteit te meten

Een eenvoudige en betrouwbare werkwijze is beschreven om een ​​set van NK celfuncties zoals degranulatie cytokine en chemokine productie in verschillende NK cel subsets te analyseren.

Flowcytometrie-gebaseerde test voor het toezicht op NK celfuncties

Een stroom cytometry gebaseerde methode om kwantitatief de cytotoxische activiteit van menselijke natural killer cellen wordt hier weergegeven.

Een stroom Cytometry gebaseerde cytotoxiciteit Assay voor de beoordeling van menselijke NK cel activiteit

Ontduiking van natuurlijke killer (NK) celgemedieerde uitroeiing door kankercellen is belangrijk voor kanker initiatie en progressie. Hier presenteren we twee niet-radioactiviteit-gebaseerde protocollen om NK cel-gemedieerde cytotoxiciteit te evalueren in de richting van levertumorcellen. Daarnaast wordt een derde protocol gepresenteerd om NK-celmigratie te analyseren.

Meting van Natural Killer Cell-Gemedieerde Cytotoxiciteit en Migratie in de context van levertumorcellen

Een protocol voor het bestuderen van FcγRIIIa-gedreven gebeurtenissen door therapeutische antilichamen in menselijke natural killer cellen wordt hier beschreven. Dit kunstmatige stimulatieplatform maakt het mogelijk om stroomafwaartse effectorfuncties te onderzoeken, zoals degranulatie, chemokine / cytokineproductie en signaalroutes gemedieerd door de FcγRIIIa- en Fc-delen van antilichamen die betrokken zijn bij binding.

Beoordeling van menselijke natural killer celgebeurtenissen gedreven door FcγRIIIa betrokkenheid bij de aanwezigheid van therapeutische antilichamen

In dit artikel beschrijven we een methode om glycolyse en mitochondriale ademhaling te meten in primaire menselijke Natural Killer (NK) cellen geïsoleerd van perifeer bloed, in rust of na IL15-geïnduceerde activering. Het beschreven protocol kan gemakkelijk worden uitgebreid tot primaire menselijke NK-cellen die worden geactiveerd door andere cytokines of oplosbare stimuli.

Analyse van human natural killer cell metabolisme

Dit protocol beschrijft een labelvrije methode voor de snelle analyse van het aantal en de activiteit van natural killer (NK) cellen met behulp van lensloze schaduwbeeldvormingstechnologie. Deze methode kwantificeert morfologische veranderingen in individuele NK-cellen door computeranalyse van hun diffractiepatronen.

In het veld inzetbaar lensloos beeldvormingsplatform voor snelle labelvrije analyse van de activering van natural killer-cellen

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde in vitro. workflow voor consistente meting van natuurlijke, chimere antigeenreceptor-gemedieerde en antistofafhankelijke cytotoxiciteit van menselijke natuurlijke moordenaars met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie.

Kwantificatie van NK-cel cytotoxiciteit versterkt door chimerische antigeenreceptoren en therapeutische antilichamen met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie

Leer een snelle en betrouwbare methode voor de analyse van NK-cel lytische activiteit in humaan volbloed. Deze techniek biedt reproduceerbare resultaten voor immunologisch onderzoek.

Flow cytometrische analyse van de NK-cel lytische activiteit in humaan volbloed

Meer video's verkennen