Flow cytometrische analyse van de NK-cel lytische activiteit in humaan volbloed

Het algemene doel van dit experiment is om het aantal NK-cellen en de niveaus van cytotoxische activering in een menselijk volbloedmonster op een snelle, betrouwbare en stabiele manier te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van immunologie, zoals, Wat zijn de effecten van externe interventies op de bioactiviteit van NK-cellen? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze snel en nauwkeurig is, terwijl nog steeds reproduceerbare resultaten over experimenten heen wordt geleverd.

Om NK-cellen uit menselijk volbloed te isoleren, plaats eerst buizen van 15 milliliter met de labels Volbloedmonster, Negatieve Fractie en Positieve Fractie op de juiste posities in het tuberek van de celseparator. Wanneer alle buizen zijn geladen, plaats het scheidingsrekje op de mini-sampler voor automatische labeltoewijzing en selecteer Reagens op het menu om de positie te markeren waar de fles op het rekje zal worden geplaatst. Selecteer Reagens lezen om de 2D-codelezer te activeren en houd de juiste reagentiënfles in een hoek van 0,5 tot 2,5 centimeter van de codeleezerdeksel voor de 2D-codelezer.

Plaats de gelezen fles in de juiste scheidingsrekpositie. Markeer vervolgens onder het tabblad Scheiding de gewenste posities. Open vervolgens het submenu Labeling en selecteer een automatisch labelprogramma.

Wijz de celscheidingsreagensmicrobeads toe aan rekposities 1, 2, 3 en 4. En selecteer het Posselwb scheidingsprogramma. Selecteer het Spoel Was programma.

Voer 1500 microliter in voor het Steekproefvolume onder het submenu Volume en druk op Enter. Klik vervolgens op Uitvoeren om de celscheiding te starten. Klik op OK om te bevestigen dat er voldoende buffer beschikbaar is voor het verwerken van alle monsters.

Om een Cytotoxiciteit Assay-monster voor te bereiden, label eerst buizen van 1,5 milliliter voor elk monster en/of deelnemer zoals gepast, en pipeer de gewenste verhouding van NK-cellen en DIO-gelabelde K562-cellen in elke buis. Verzamel de cellen door centrifugatie en verwijder voorzichtig het supernatant zonder de celpellet te verstoren. Resuspendeer vervolgens het celmengsel in 500 microliter onvolledig NK-celmedium en label de cellen in elke buis met 5 microliter propidiumjodide.

Verzamel de cellen via een andere centrifugatie en incubeer de celcultuur gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, centrifugeer de cellen onder dezelfde centrifugatiecondities en resuspendeer het pellet in 25 microliter vers onvolledig NK-celkweekmedium. Om de cellen te analyseren door flowcytometrie, klik eerst op de startknop in de imaging flowcytometersoftware om het systeem te spoelen.

Klik vervolgens op de scatterplotknop om vier scatterplots te maken en laad de dubbel positieve controlebuis. Gebruik het dubbel positieve controlemonster om de gewenste intensiteit voor de 405 milliwattlaser te bepalen, zodat de detector niet overbelast raakt, en stel de imager in om het juiste aantal celtellingen te verwerven. Het instellen van de 405 milliwattlaser op een intensiteit die geschikt is voor de detectie van zowel DIO als PI zal ervaring vereisen met beide kleurstoffen en de detectiebereik van de flowcytometer.

Nadat de acquisitie van het dubbel positieve controlemonster is voltooid, laad het DIO-alleen controlemonster, selecteer het 40X objectief en zet de 642 milliwattlaser en de Brightfield-kanaal uit. Kweek het juiste aantal cellen en herhaal de acquisitie voor het propidiumjodide-alleen monster. Wanneer alle controlemonsters zijn uitgevoerd, zet de 405 milliwattlaser en het Brightfield-kanaal weer aan en klik op Intensiteit instellen.

Vervolgens, onder het tabblad Bestandsverwerving, voer een aangepaste bestandsnaam in en selecteer een map voor het opslaan van de gegevensbestanden. Voer vervolgens het aantal te verwerven cellen in. Laad de eerste experimentele steekproefbuis en klik op de Knop Verwerven.

Wanneer alle monsters zijn uitgevoerd, open de imaging flowcytometeranalysesoftwareapplicatie en open een enkel experimenteel RIF-bestand. Selecteer onder het tab Compensatie Nieuwe Matrix maken. De software vraagt om de selectie van de enkelkleurige bestanden en voegt ze samen om een matrixbestand te maken dat kan worden geselecteerd voor het toepassen van de kanaalcompensatie.

Gebruik de Building Blocks-functie om de juiste stipplots in te stellen. Klik vervolgens op de statistiekfunctie om toegang te krijgen tot het aantal cellen in elke gate. In dit representatieve experiment werden bloedmonsters genomen zoals aangegeven en werd de concentratie van NK-cellen per milliliter volbloed gemeten voor elke loper en gemiddeld voor elk tijdstip.

Drie van de vier lopers vertoonden een soortgelijke lichte toename in het aantal NK-cellen na de oefening. Direct gevolgd door een scherpe daling, voordat ze langzaam terugkeerden naar normaal, 24 tot 48 uur na het einde van het evenement. Gemiddeld nam het aantal NK-cellen 1,5 uur na de oefening af, maar keerde terug naar bijna normale niveaus na 24 uur.

Na het berekenen van het celtelling, werd de cytotoxische activiteit van de NK-cellen onmiddellijk geanalyseerd zoals zojuist is aangetoond, met een gemiddelde afname in NK-celcytotoxiciteit onmiddellijk en 1,5 uur na het beëindigen van de oefening, die significant toenam na 24 uur na de oefening. De NK-cytotoxiciteit bleef hoog vergeleken met de niveaus vóór de oefening, zij het niet significant. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in ongeveer vier uur worden voltooid wanneer deze correct wordt uitgevoerd.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het aantal en de cytotoxische activiteit van NK-cellen uit menselijke bloedmonsters op een reproduceerbare hydropische manier kunt verkrijgen en karakteriseren.