Met behulp van 3D-printtechnologie om samenvoegen MRI met de histologie: A Protocol for Brain Snijden

Het algemene doel van dit protocol is om MRI-beeldvolumes nauwkeurig uit te lijnen met histologische coupes door de creatie van op maat gemaakte 3D-geprinte breinhouders en slice-boxen. Hoewel deze video zich richt op hersenweefsel geëxtraheerd uit eenmarmositeit, kan dit protocol worden toegepast op elk brein, of dit nu afkomstig is van een knaagdier, een niet-menselijke primaat of een mens. Richt een werkstation in zoals beschreven in het protocol.

Vul de buis met Fomblin en gaas tot de markering van 20 milliliter. Comprimeer het gaas om onderweg luchtbellen te verwijderen. Droog de hersenen voorzichtig van formaline.

Plaats vervolgens het brein met de voorkant naar de bodem van de buis. Bevestig het brein voorzichtig in de buis door gaas rond de zijkant van het brein aan te brengen om de positie te fixeren. Vul de rest van de buis met gaas en Fomblin.

Verwijder tijdens dit proces voorzichtig alle luchtbellen. Draai vervolgens de dop stevig vast en verzegel de buis met paraffine. Markeer de dop en de lijn ter hoogte van de interhemisferische fissuur.

Wikkel de buis vervolgens in een papieren handdoek en plaats deze in de spoel met de markering in de bovenste centrale positie. Plaats de spoel in de MRI-scanner. Na de acquisitie en post-processing beschikken we over een T2-gewogen beeld dat we kunnen gebruiken om een digitaal model van de hersenen te maken.

Open de MRI in de coronale oriëntatie. Gebruik vervolgens de transformatietools om het beeld te resamplen naar 1 millimeter isotrope voxels. Pas daarna een niet-lineair ruisonderdrukkingsfilter toe.

Selecteer de weergave van de opzoektabel. Klik vervolgens op de knop voor de dubbele drempelwaarde. Versleep de schuifregelaar op de grafiek om de gehele hersenen te beslaan.

Maak een binair hersenmasker met het segmentatie-algoritme Threshold using min/max. Voer de waarde die in de linkeronderhoek van de intensiteitsgrafiek staat, direct onder de schaal, in bij het vak Lower limit. Selecteer vervolgens Binary en vink Inverse threshold uit.

Selecteer het morfologische algoritme, Fill holes. Vink Process in 2.5D aan. Om de opening tussen de rhombencephalon en de cortex op te vullen, selecteert u line VOI.

Trek een verbinding tussen de rhombencephalon en de cortex aan beide zijden van de hersenen op het meest laterale punt. Ga verder met het tekenen van VOI-verbindingen door de hersenen. Converteer de VOI's naar een binair masker.

Gebruik de Image calculator om de VOI- en hersen-binaire maskers te combineren door de OR-operatie te selecteren. Selecteer Promote destination image type. Selecteer nu het morfologische algoritme Fill holes.

En vink Process in 2.5D aan. Selecteer het algoritme Extract surface, selecteer Mask image, voer een naam in en selecteer vervolgens het bestandstype ply. De openingen in de cutting box die overeenkomen met de locatie van het snijvlak kunnen worden geplaatst beginnend vanaf de voorkant van de hersenen, de achterkant van de hersenen of relatief aan een gebied van belang, zoals de laesies in de witte stof die hier te zien zijn.

Teken met behulp van de box VOI een kader rondom de hersenen. Kopieer en plak het kader op het aantal MRI-plakjes dat overeenkomt met de beoogde dikte van de plaatopeningen. Sla vervolgens het aantal MRI-plakjes per sectie over en plaats het kader zoals eerder gedaan om een volgende mesopening te creëren.

Herhaal dit proces door het gehele brein. Zet de box VOI's om naar een binair masker. Extraheer vervolgens het oppervlak met Extract surface, zoals eerder is gedaan voor het brein.

Selecteer het binaire masker van de mesopening. Gebruik Image math om dit met 10.000 te vermenigvuldigen. Gebruik vervolgens Image calculator om het vermenigvuldigde binaire masker toe te voegen aan de geresamplede isotrope MRI.

Door nu de triplanaire weergave te selecteren, kan een MRI-meskaart waarop de locatie van de hersensneden is aangegeven, in drie orthogonale weergaven worden bekeken. Selecteer in Netfabb Professional 'Add part'. Selecteer vervolgens de modellen 'Blade Gap' en 'Brain Model plys'.

Selecteer het hersenmodel en klik op de reparatiemodus. Gebruik de knop voor schilselectie om de hersenen te selecteren. Schakel vervolgens de selectie over naar de andere schillen en verwijder deze.

Pas vervolgens de reparatie toe en verwijder het oude deel. Selecteer 'Move' terwijl het brein is geselecteerd. Klik op 'to origin' en noteer de parameters in de X-, Y- en Z-vakken.

Deze zijn nodig om de positionering van de mesopening te handhaven. Klik op vertalen. En sluit het venster.

Selecteer het Blade Gap-model en vertaal dit met behulp van de parameters die in de vorige stap zijn genoteerd. Selecteer het Brain-model en klik op de reparatiemodus. Gebruik de knop voor shell-selectie om de hersenen te selecteren.

Select vervolgens Smooth triangles. Voer vier in als aantal Iterations. En vink Prevent volume shrinking aan.

Selecteer Reduce Triangles en voer 200000 in bij het vak Target Triangle Count. Selecteer vervolgens Automatic repair en voer een standaardreparatie uit. Pas de reparatie toe.

Exporteer vervolgens het gladgestreken hersenmodel als een STL. Importeer het gladgestreken hersenmodel in Meshmixer. Gebruik de sculpting-tools om de gebieden die met de lijn-VOI's zijn getekend glad te maken.

En herstel alle overige kleine defecten in het model. Importeer het gladgestreken en bewerkte breinmodel in Netfabb Professional. Voeg vervolgens het onderdeel 'brain slicer parts marmoset' toe.

Selecteer Shells naar onderdelen. Hernoem vervolgens elk onderdeel zoals beschreven in het protocol. Klik en sleep de onderdelen met de in het protocol beschreven selectie-instellingen om de hersenen in het midden van de box te positioneren.

Klik en sleep de onderdelen om de diepte van de hersenen in de box aan te passen. Selecteer het gladgestreken, bewerkte hersenmodel, het box-cutout-model en selecteer de booleaanse bewerking. Klik op het hersenmodel om het rood te maken.

Selecteer vervolgens booleaanse aftrekking. Voer de berekeningen uit. Controleer op overhangingen die kunnen voorkomen dat de hersenen correct worden geplaatst.

Raadpleeg de aanvullende sectie van het protocol voor een methode om deze te verwijderen. Selecteer het model van de mesopening en klik op verplaatsen. Registreer op Z-positie.

Dit zal de positie van de meest posterieure mesopening zijn. Sluit vervolgens het venster. Selecteer het mesgedeelte uit de onderdelen van de hersensnijmachine en klik op Verplaatsen.

Voer de Z-waarde uit de vorige stap in. Voer vervolgens de huidige positie X- en Y-waarden in. Selecteer absolute Translation en voer de translatie uit.

Klik op Dupliceren. Als de sectiedikte consistent is, zoals hier getoond, voert u het totale mesnummer, het totale aantal en de Z-telling in, en voert u de sectiedikte in het vak voor de Z-gap in. Selecteer vervolgens dupliceren.

Selecteer het microtoommes-onderdeel uit de onderdelen van de hersensnijder. Herhaal dezelfde stappen voor het verplaatsen en dupliceren als bij het mes-onderdeel. Selecteer alle Microtoommesen en de hoofdmesshouder en klik op de booleaanse bewerking.

Selecteer alle Microtoomassen om ze rood te maken en klik op booleaanse aftrekking. Pas vervolgens de berekeningen toe. Ga naar de reparatiemodus en selecteer Automatische reparatie.

Voer een Extended Repair uit en pas de reparatie toe. Exporteer de blade holder als een STL. Selecteer alle blades, de hoofd- en subdozen en het afgevlakte, bewerkte Brain-model, en klik op boolean operation.

Gebruik het selectievenster voor Onderdelen om alle Onderdelen, met uitzondering van de hoofdbehuizing, rood te maken. Selecteer vervolgens booleaanse aftrekking. Voer de berekeningen uit.

Ga naar de reparatiemodus en vink het vakje aan voor scherpe randen die het brein zouden kunnen beschadigen. Deze kunnen worden hersteld in de reparatiemodus van Netfabb, of met behulp van de sculpting-tools in Meshmixer.

Selecteer vervolgens Automatisch herstel. Voer een Uitgebreid herstel uit. Pas daarna het herstel toe.

Exporteer de brain box als een STL-bestand. Selecteer in Cura 'Load' en importeer de Brain Box. Klik op de knop 'Rotate'.

Klik vervolgens en sleep om de box plat te leggen. Pas de printinstellingen aan zoals beschreven in het protocol. Sla daarna het gereedschapspad op.

Volg hetzelfde proces voor de meshouder en dupliceer ook dit object. Sla vervolgens het gereedschapspad op. Breng een dunne laag lijm aan op het printbed en print de breinbox en de meshouders op de 3D-printer met de instellingen die in het protocol worden beschreven.

Nadat het printen is voltooid, kan het brein worden voorbereid op het snijden. Richt een werkstation in zoals beschreven in het protocol. Plaats het brein voorzichtig in de doos en zorg ervoor dat het stevig is vastgezet.

Plaats de microtoombladen in de bladhouders in de overeenkomstige openingen van de doos. Druk met beschermende handschoenen stevig op de bladhouders. Oefen een langzame, gelijkmatige druk uit om het brein te snijden.

Verwijder de plakjes één voor één, beginnend bij de voorkant van de hersenen. Hoewel deze aanpak rechttoe rechtaan is, vereist de methode veel stappen en het gebruik van verschillende soorten software; onderzoekers moeten daarom bekend raken met de gebruikersinterfaces voordat ze met de procedure beginnen. Deze workflow vat het protocol voor het maken van de snijkist voor marmosietenhersenen samen.

De hersenen worden gefixeerd met Formalin en er wordt een T2-gewogen MRI gemaakt met een resolutie van 150 micron. De beelden worden verwerkt en er wordt een drempelwaarde toegepast om een binair masker te creëren. Het oppervlak wordt vervolgens gerenderd in 3D-modelleersoftware.

Een booleaanse aftrekking tussen een sjabloon van de slicer en het hersenmodel creëert het digitale model van de hersenslicer. De slicerbox voor de hersenen wordt vervolgens op een 3D-printer geprint. De hersenen worden daarna stevig in de slicerbox geplaatst om te kunnen snijden.

Zodra het brein is gesneden, onthult een visuele vergelijking tussen de In Vivo en post-mortem MRI-beelden en foto's van de oppervlakkige zijden van de plakken een goede overeenstemming in de oriëntatie over meerdere plakken heen. Een grondigere vergelijking tussen de hoge-resolutie post-mortem MRI en de LFB CV-gekleurde histologische coupes van meerdere breinplakken demonstreert een nauwkeurige en consistente match over alle structuren van het marmosetbrein. In dit diermodel voor Multiple Sclerose ontwikkelen de dieren wittestoflaesies die verspreid over het hele brein voorkomen.

Met deze techniek kunnen kleine laesies die via in vivo MRI zijn gedetecteerd, worden gevolgd op zowel post-mortem MRI als histologische coupes. De histologie en post-mortem MRI kunnen bovendien laesies onthullen die anders over het hoofd zouden zijn gezien op de in vivo MRI. In dit geval vertoonde de in vivo MRI geen overtuigend bewijs van een normaal, hyperintens signaal dat zou wijzen op laesies in een van de tractus optici.

Niettemin werden in de post-mortem MRI signaalhyperintensiteiten in het opticustractus waargenomen. Deze gebieden kwamen direct overeen met de gemyeliniseerde laesies die zichtbaar waren in de LFB CV histologische sectie. Concluderend stelt de hier geïntroduceerde methodologie onderzoekers in staat om de pathologie die ten grondslag ligt aan MRI-bevindingen nauwkeurig te beoordelen.

Wij beschouwen dit als een veelbelovende benadering voor het identificeren van nieuwe biomarkers voor ziekten met betrekking tot de hersenen en voor specifieke pathologische processen zoals inflammatie en remyelinisatie.