High-throughput detectie van respiratoire pathogene in dierlijke specimens door nanoschaal PCR
28 november 2016
High-throughput testen van DNA en RNA gebaseerde pathogenen op nanoschaal PCR wordt omschreven met een syndromale honden en paarden luchtwegen PCR panel.
Het algemene doel van deze real-time PCR-testmethodologie is om zowel op DNA als op RNA gebaseerde pathogenen samen op een hoog rendement te detecteren. Nucleïnezuur uit klinische monsters wordt vooraf versterkt met een gemeenschappelijke primerpool die op een OpenArray-plaat wordt geladen en geanalyseerd op de aanwezigheid van pathogenen. Deze methode kan helpen bij het bevorderen van OneHealth-toezichtspogingen voor infectieziekten.
In vergelijking met traditionele technieken, laat deze methode toe dat meer monsters worden getest op meer doelen zonder met elkaar te concurreren, waardoor de testefficiëntie wordt verbeterd. De methode gebruikt een aangepaste nanoscale PCR-plaat. De primers en sondes worden gedrukt op de randen van doorlopende gaten en de monsters worden geladen met behulp van een vloeistofhandler.
We zullen de methode demonstreren op klinische monsters die worden getest op een panel van respiratoire pathogenen van paarden en honden. Om deze procedure te starten, ontwerpt u de plaat zoals beschreven in het tekstprotocol. De plaat die hier wordt gebruikt, is geconfigureerd met 18 doelen in drievoudige uitvoering.
Voeg media toe aan de swabs en tracheale wassingen zodat er ten minste één tot twee milliliter vloeistof is. Vortex de swab en DMEM krachtig in de buis. Gebruik vervolgens een pipet om ongeveer 1 milliliter media over te brengen naar een nieuwe buis.
Voeg 235 microliter lysisbuffer en 175 microliter monster toe aan elke beadbuis. Ga verder met het protocol van de fabrikant om het totale nucleïnezuur te extraheren. Bereid de omgekeerde transcriptie en voorversterking van nucleïnezuur of preamp voor zoals beschreven in het tekstprotocol door eerst de monsterkaart te verifiëren.
Voeg 8,5 microliter preamp mastermix en 5,5 microliter DNA/RNA-monster toe aan elke put van een standaard 96-wellsplaat, alleen de linkerkant van de plaat gebruikend. Na het combineren van de monsters, positieve controles en negatieve controles met preampmix, verzegel de standaard 96-wellsplaat volledig met een duidelijke zelfklevende verzegeling. Verwijder eventueel overtollig verzegelingsmateriaal met een scheermes om het vormen van verzegelingsspleten tijdens het cyclussen te voorkomen.
Centrifugeer de verzegelde plaat gedurende 20 seconden met behulp van een PCR-plaatspinner. Controleer of alle reagentia in de bodem van de plaatputten zijn gecombineerd. Na het inschakelen van een conventionele thermocycler, selecteert u het preamp-cyclusprogramma en start het programma.
Plaats de 96-wellsplaat in de thermocycler pas wanneer de onderste sectie van de thermocycler de temperatuur bereikt die vereist is voor cDNA-productie door de temperatuur op het scherm te controleren. Zodra de preamp-run voltooid is, controleert u of de plaat verzegeld is gebleven. Nadat u dubbele handschoenen en sleeve covers hebt aangetrokken, verwijdert u de verzegeling van de preamp-plaat.
Verwijder vervolgens voorzichtig de buitenste handschoenen. Verdun de preamp-producten een op vijf door 56 microliter TE-buffer toe te voegen aan elke put van kolom één tot en met zes van de 96-wells preamp-plaat en mengen door op en neer te pipetteren. Om dit te doen, gaat u alleen naar de eerste stop van de pipet, aspireert vanaf de bodem en geeft hogerop, maar creëer geen bellen.
Voeg TE-buffer toe aan alle zes kolommen, ongeacht ongebruikte putten. Bereid u voor op de 384-wells overdracht naar de amplificatieplaat zoals beschreven in het tekstprotocol. Na voltooiing van de voorbereidingsstappen, trek nieuwe goed passende dubbele handschoenen en sleeve covers aan.
Vanwege hoge verdampingssnelheden tijdens het pipetteren van lage volumes, is het van cruciaal belang om mastermix en monster efficiënt te doseren en de plaat onmiddellijk te verzegelen. Voeg 2,5 microliter amplificatiemastermix toe aan een 384-wellsplaat. Witte platen worden hier gebruikt voor demonstratiedoeleinden, maar zwarte platen moeten worden gebruikt om vermoeidheid van de ogen te verminderen.
Breng 2,5 microliter van het verdunde preamp-product over naar de 384-wellsplaat volgens de kaart in het tekstprotocol. De gekleurde dobbelstenen die hier worden getoond, illustreren de overdrachtssequentie voor een vaste kanaalpipet. Bedek de plaat onmiddellijk goed met een folie-afdichting.
Verwijder de buitenste handschoenen en sleeve covers. Centrifugeer de 384-wellsplaat gedurende 20 seconden in de PCR-plaatspinner. Verwijder de folie-afdichting niet, maar plaats de 384-wellsplaat in de vloeistofhandler.
Open de verpakking met een behuizing met een amplificatieplaat en plaats deze voorzichtig in de vloeistofhandler in de eerste sleuf met het serienummer aan de rechterkant, houd de behuizing vast aan de randen zonder de oppervlakte van de plaat aan te raken. Verwijder de folie-afdichting van de 384-wellsplaat in de vloeistofhandler zodra alles op zijn plaats zit. Klik op volgende en controleer vervolgens alle vakjes terwijl elke stap wordt voltooid.
Sluit de deur naar de vloeistofhandler en start onmiddellijk het vulproces. Blijf naast de vloeistofhandler staan en ga onmiddellijk door naar de volgende stap zodra de plaat is gevuld. Terwijl de vloeistofhandler actief is, verwijdert u de beschermfolie van de onderkant van een behuizingsdeksel.
Laat de bovenste film op zijn plaats. Prime de rode tape door er lichtjes aan te trekken om deze los te maken van de kleefstof. Verwijder de geladen amplificatieplaat uit de vloeistofhandler en plaats deze voorzichtig in de platenpers met het serienummer aan de rechterkant.
Plaats het deksel bovenop de plaat met de inkeping aan de rechterkant en de kleefstof aan de onderkant. Trek voorzichtig aan de platenpershendel om deze te sluiten, het lampje zal 20 seconden knipperen. Raak de platenpers gedurende deze tijd niet aan.
Zodra het lampje vast groen wordt, til de hendel op en verwijder voorzichtig de verzegelde plaat door deze aan de randen vast te houden. Terwijl u de verzegelde amplificatieplaat verticaal door de randen van de behuizing vasthoudt, steekt u onmiddellijk de spuittip in de laadpoort aan he
Overzicht
Dit artikel beschrijft een high-throughput PCR-methodologie voor het detecteren van DNA- en RNA-pathogenen in respiratoire monsters van honden en paarden. De aanpak verhoogt de efficiëntie van het testen door meerdere monsters gelijktijdig te laten analyseren.
Belangrijke onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Detectie van pathogenen
- Veterinaire geneeskunde
Achtergrond
- Traditionele PCR-methoden beperken vaak het aantal monsters en targets.
- OneHealth-surveillance benadrukt de onderlinge verbondenheid van de menselijke, dierlijke en ecologische gezondheid.
- High-throughput-technieken kunnen de diagnostische mogelijkheden verbeteren.
- Nanoscale PCR-platen maken een efficiënte monsterverwerking mogelijk.
Doel van de studie
- Om een real-time PCR-methode te ontwikkelen voor de gelijktijdige detectie van meerdere pathogenen.
- Om de efficiëntie van het testen op luchtwegaandoeningen bij honden en paarden te verhogen.
- Om OneHealth-initiatieven te ondersteunen door middel van verbeterde surveillance.
Gebruikte methoden
- Klinische monsters worden gepre-amplificeerd met behulp van een gemeenschappelijke primerpool.
- Monsters worden geladen op een op maat gemaakte nanoschaal PCR-plaat.
- Er wordt real-time PCR uitgevoerd om de aanwezigheid van pathogenen aan te tonen.
- Protocollen omvatten zorgvuldige behandeling en verwerking van monsters om de nauwkeurigheid te waarborgen.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt het mogelijk om meerdere targets te testen zonder interferentie.
- Verbeterde efficiëntie bij het verwerken van monsters in vergelijking met traditionele methoden.
- Aangetoonde effectiviteit bij klinische monsters van honden en paarden.
- Ondersteunt een snelle respons bij uitbraken van infectieziekten.
Conclusies
- Deze high-throughput PCR-methode vormt een belangrijke vooruitgang in de detectie van pathogenen.
- Het faciliteert een betere surveillance en beheersing van respiratoire aandoeningen bij dieren.
- De aanpak kan worden aangepast voor gebruik in diverse veterinaire en volksgezondheidscontexten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Real-time PCR op nanoschaal maakt high-throughput, gemultiplexe detectie van respiratoire pathogenen in veterinaire monsters mogelijk, wat een snelle en uitgebreide surveillance van infectieziekten ondersteunt. Deze workflow verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de identificatie van pathogenen en optimaliseert de diagnostische doorvoer op kritieke punten van ontdekking en triage. De aanpak is direct relevant voor portfoliestrategieën die schaalbare, kwantitatieve en reproduceerbare pathogeendetectie vereisen over diverse monstermatrices.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt gelijktijdige analyse van meerdere pathogeentargets mogelijk om de etiologie van infectieziekten te verduidelijken.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door kwantitatieve detectie van zowel DNA- als RNA-agentia te bieden.
- Vergemakkelijkt de voorspellende betrouwbaarheid bij targetidentificatie voor verdere diagnostische of therapeutische ontwikkeling.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde high-throughput panels voor voor snelle screening van klinische monsters en surveillancesamples.
- Standaardiseert assay-condities om reproduceerbaarheid te waarborgen en kruisreacties tussen targets te minimaliseren.
- Levert kwantitatieve cycle threshold (Ct) output voor een robuuste vergelijking tussen monsters en controles.
- Maakt schaalbare, geparallelliseerde workflows mogelijk voor een efficiënte evaluatie van verbindingen of pathogenen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij syndroomgebaseerde diagnostische panels om translationele biomarkerstrategieën in veterinaire contexten en binnen OneHealth te ondersteunen.
- Zorgt voor continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door zowel DNA- als RNA-pathogenen te accommoderen.
- Vermindert het risico bij het verder ontwikkelen van diagnostische kandidaten door een uitgebreide pathogenendekking te waarborgen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze nanoscale PCR-workflow integreert processen van vroege ontdekking tot screening en translationeel onderzoek, wat snelle hypothesetoetsing en high-throughput pathogenensurveillance ondersteunt.
- Discovery Biology: Maakt hypothese-gestuurde detectie van meerdere respiratoire pathogenen in één run mogelijk.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor assay-standaardisatie en downstream-analyse.
- Analytics: Genereert cycle threshold-gegevens en amplificatiecurves voor robuuste statistische vergelijking.
- Translational Research: Ondersteunt syndroomgebaseerde panels voor systeemafstemming die relevant zijn voor de ziekte.
- Enterprise Reuse: Biedt een schaalbaar, aanpasbaar platform voor diverse infectieziektenpanels en monster-typen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de detectie van pathogenen.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, high-throughput en reproduceerbare workflows voor diagnostische laboratoria.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en de kapitaalefficiëntie door snelle, uitgebreide testen mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van diagnostische en surveillance-initiatieven.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in nucleïnezurextractie, PCR-assayontwerp en automatisering van vloeistofafhandeling.
- Toegang tot nanoscale PCR-instrumentatie, liquid handlers en data-analyse software is noodzakelijk.
- Strikte standaardisatie tussen teams voor monstervoorbereiding en data-interpretatie is vereist.
- Aanpasbaar aan diverse monstermatrijsen en zowel DNA- als RNA-pathogeendoelen.
- Verdampings- en contaminatierisico's moeten worden beheerst tijdens pipetteren van lage volumes en plathandeling.
