Name: Structurele Informatie van Single-molecule FRET experimenten met de Fast Nano-positioneringssysteem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Leer single-molecule FRET-analyse voor structurele biologie met het Fast Nano-positioneringssysteem. Deze methode combineert TIRF-microscopie met Bayesiaanse inferentie om flexibele domeinen in biomoleculen te lokaliseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken B. Gruchmann voor de mechanische tekeningen van de stromingskamer. Verder willen we onze dank uiten aan Max Beckers en Florian Drechsler voor hun inzichten en discussies over NPS en de onderliggende bemonsteringsmotor.

<ol><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Particle+Cryo-EM+at+Crystallographic+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution.</a> Cell. 161, 450-457 (2015).</li>
<li>Garman, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+X-ray+Crystallographic+Structure+Determination+of+Biological+Macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developments in X-ray Crystallographic Structure Determination of Biological Macromolecules.</a> Science. 343 (6175), 1102-1108 (2014).</li>
<li>Sali, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+the+First+wwPDB+Hybrid%2FIntegrative+Methods+Task+Force+Workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Outcome of the First wwPDB Hybrid/Integrative Methods Task Force Workshop.</a> Structure. 23, 1156-1167 (2015).</li>
<li>Hopfner, K. P., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+nucleic+acid+translocases%3A+lessons+from+structural+biology+and+single-molecule+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics.</a> Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).</li>
<li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+AFM+and+applications+to+biomolecular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">High-speed AFM and applications to biomolecular systems.</a> Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).</li>
<li>Neuman, K. K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5, 491-505 (2008).</li>
<li>Yildiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+walks+hand-over-hand%3A+single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).</li>
<li>Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Single-Molecule+Fluorescence+Methods+for+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology.</a> Annu Rev Biochem. 77 (1), 51-76 (2008).</li>
<li>Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating-laser+excitation%3A+single-molecule+FRET+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond.</a> Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).</li>
<li>Stryer, L., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+transfer%3A+a+spectroscopic+ruler%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Energy transfer: a spectroscopic ruler.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).</li>
<li>Rasnik, I., Myong, S., Cheng, W., Lohman, T. M., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-binding+Orientation+and+Domain+Conformation+of+the+E.+coli+Rep+Helicase+Monomer+Bound+to+a+Partial+Duplex+Junction%3A+Single-molecule+Studies+of+Fluorescently+Labeled+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA-binding Orientation and Domain Conformation of the E. coli Rep Helicase Monomer Bound to a Partial Duplex Junction: Single-molecule Studies of Fluorescently Labeled Enzymes.</a> J Mol Biol. 336 (2), 395-408 (2004).</li>
<li>Andrecka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+tracking+of+mRNA+exiting+from+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 135-140 (2008).</li>
<li>Schröder, G. F., Grubmüller, H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0010465504000748">FRETsg: Biomolecular structure model building from multiple FRET experiments.</a> Comput Phys Commun. 158 (3), 150-157 (2004).</li>
<li>Margittai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer+reveals+a+dynamic+equilibrium+between+closed+and+open+conformations+of+syntaxin+1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15516-15521 (2003).</li>
<li>Kalinin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+and+benchmark+study+for+FRET-restrained+high-precision+structural+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling.</a> Nat Methods. 9 (12), 1218-1227 (2012).</li>
<li>Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nsmb/journal/v23/n2/full/nsmb.3148.html">N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation-elongation dynamics.</a> Nat Struct Mol Biol. 23 (August 2015), 110-115 (2015).</li>
<li>Svensson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+trilateration+of+probes+bound+within+functional+ryanodine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">FRET-based trilateration of probes bound within functional ryanodine receptors.</a> Biophys J. 107 (9), 2037-2048 (2014).</li>
<li>Stephenson, J. D., Kenyon, J. C., Symmons, M. F., Lever, A. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+3D+RNA+structure+by+single+molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing 3D RNA structure by single molecule FRET.</a> Methods. (2016), 1-11 (2016).</li>
<li>Lee, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophys J. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li>
<li>McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+methods+to+recover+absolute+FRET+efficiency+from+immobilized+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules.</a> Biophys J. 99 (3), 961-970 (2010).</li>
<li>Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+molecular+modeling+with+single+molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET.</a> J Struct Biol. 173, 497-505 (2011).</li>
<li>Schuler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+of+protein+structure+and+dynamics+-+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22J+nanoboitechnology%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET of protein structure and dynamics - a primer.</a> J nanoboitechnology. 11, Suppl 1. 1-17 (2013).</li>
<li>Choi, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET-derived+model+of+the+synaptotagmin+1-SNARE+fusion+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (3), 318-324 (2010).</li>
<li>Dale, R. E., Eisinger, J., Blumberg, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientational+freedom+of+molecular+probes.+The+orientation+factor+in+intramolecular+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer.</a> Biophys J. 26 (2), 161-193 (1979).</li>
<li>Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating-laser+excitation+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Alternating-laser excitation of single molecules.</a> Acc Chem Res. 38 (7), 523-533 (2005).</li>
<li>Muschielok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nano-positioning+system+for+macromolecular+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A nano-positioning system for macromolecular structural analysis.</a> Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).</li>
<li>Muschielok, A., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+nano-positioning+system+to+the+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Application of the nano-positioning system to the analysis of fluorescence resonance energy transfer networks.</a> J Phys Chem B. 115 (41), 11927-11937 (2011).</li>
<li>Andrecka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano+positioning+system+reveals+the+course+of+upstream+and+nontemplate+DNA+within+the+RNA+polymerase+ii+elongation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase ii elongation complex.</a> Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).</li>
<li>Treutlein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Architecture+of+a+Minimal+RNA+Polymerase+II+Open+Promoter+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic Architecture of a Minimal RNA Polymerase II Open Promoter Complex.</a> Mol Cell. 46 (2), 136-146 (2012).</li>
<li>Nagy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+architecture+of+the+archaeal+RNA+polymerase+open+complex+from+single-molecule%5BTitle%5D)+AND+%22FRET+and+NPS.+Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule.</a> FRET and NPS. Nat Commun. 6, 6161(2015).</li>
<li>Grohmann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Initiation+Factor+TFE+and+the+Elongation+Factor+Spt4%2F5+Compete+for+the+RNAP+Clamp+during+Transcription+Initiation+and+Elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Initiation Factor TFE and the Elongation Factor Spt4/5 Compete for the RNAP Clamp during Transcription Initiation and Elongation.</a> Mol Cell. 43 (2), 263-274 (2011).</li>
<li>Beckers, M., Drechsler, F., Eilert, T., Nagy, J., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+structural+information+from+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discuss%22%5BJournal%5D)">Quantitative structural information from single-molecule FRET.</a> Faraday Discuss. 184, 117-129 (2015).</li>
<li>Bennink, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unfolding+individual+nucleosomes+by+stretching+single+chromatin+fibers+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers.</a> Nat Struct Biol. 8 (7), 606-610 (2001).</li>
<li>Chandradoss, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J Vis Exp. (86), e50549(2014).</li>
<li>Würth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M., Resch-Genger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+and+absolute+determination+of+fluorescence+quantum+yields+of+transparent+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Relative and absolute determination of fluorescence quantum yields of transparent samples.</a> Nat Protoc. 8 (8), 1535-1550 (2013).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , Springer US. Boston, MA. (2006).</li>
<li>Korkhin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+complex+RNA+polymerases%3A+The+complete+archaeal+RNA+polymerase+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of complex RNA polymerases: The complete archaeal RNA polymerase structure.</a> PLoS Biol. 7 (5), (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We presenteren de opzet en experimentele procedure nauwkeurig te bepalen FRET efficiënties tussen kleurstoffen verbonden via flexibele linkers aan biomacromoleculen, dwz, nucleïnezuren en / of eiwitten. Om te garanderen smFRET nauwkeurige metingen (paragraaf 3), is het cruciaal om lucht uit de stromingskamer dat op elk moment tijdens de meting. Bovendien, zorg ervoor dat niet te veel stroom kamer met fluoroforen. De fluoroforen moeten duidelijk gescheiden om een ​​correcte analyse te waarborgen. Zoals smFRET paren, die niet bleken van de donor vertonen hebben van de analyse uitgesloten, ervoor zorgen dat&gt; 80% van de moleculen in het gezichtsveld worden gebleekt op het einde van de film. Om rekening te houden inhomogeniteiten in het monster de β-factor en de γ-factor corrigeren van overspraak en relatieve detectie efficiency van de donor en acceptor kanaal respectievelijk worden voor elk afzonderlijk FRET paar. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; De camera-instellingen (integratie tijd, electron multiplier gain, voorversterker gain en uitlezing tarief in paragraaf 3.9 beschreven) moet worden ingesteld op waarden van het geven van de beste afweging tussen de signaal-ruisverhouding, dynamisch bereik en tijdsresolutie. Ze moeten opnieuw worden afgesteld voor verschillende experimenten of andere hardware wordt gebruikt. Het aantal frames moeten hoog genoeg zodat het merendeel van de donor moleculen bleken binnen de observatietijd worden. Voor de metingen van de fluorescentie spectrometer (Secties 7 tot 9) een goed compromis tussen de signaalintensiteit en de spectrale resolutie van de geregistreerde gegevens worden gevonden. Daartoe de sleuven in de excitatie en emissie route van de fluorescentie spectrometer hebben afhankelijk van het gebruikte instrument en het monster concentratie worden aangepast. Bovendien presenteren we de Fast-NPS analysemethode om structurele informatie van voorbijgaande of dynamische Macrom verkrijgenolecular complexen. NPS is toegepast op het pad van de niet-matrijs-DNA-streng en de positie van transcriptie initiatie factoren in het archeale RNA polymerase geopend complex onthullen. Via het netwerk van meer dan 60 verschillende afstandsmetingen we aangetoond dat Fast-NPS, voorzien van een nieuw geïmplementeerde sampling engine (Dave, T., Beckers, M., Drechsler, F. &amp; Michaelis, J. in voorbereiding), vermindert de tijd die nodig is voor de analyse van dit complex smFRET netwerk ≈2 orden van grootte in vergelijking met de oorspronkelijke globale methode NPS 27. robuustheid van het algoritme is geworteld in een Metropolis-within-Gibbs sampler gecombineerd met een parallel tempering regeling. Fast-NPS toont exacte reproduceerbaarheid van het netwerk van de resultaten en stemt overeen met de resultaten eerder 30 gepubliceerd. Verschillende methoden zijn gepubliceerd gericht op structurele informatie afleiden uit smFRET metingen 11 </sup&gt;, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. Al deze benaderingen slechts één specifieke kleurstof model. Aldus kleurstoffen, die de aannames van die modellen voldoen, kan niet worden gebruikt of leiden tot vals structurele informatie. Snel NPS daarentegen, maakt het mogelijk om kiest per kleurstofmolecuul een ander model. Dit helpt om rekening te houden verschillende conformationeel gedrag van zowel de kleurstof molecuul zelf, evenals de linker voor de bevestiging. De lokale omgeving van de moleculaire kleurstofmolecuul, evenals de fysische eigenschappen bepalen welk model het meest geschikt is. Voor de geanalyseerde smFRET netwerk van de Archaea initiatiecomplex, een isotrope aanname voor kleurstofmoleculen leidt tot een drastische afname in de grootte van de geloofwaardige volumes in vergelijking met het klassieke model. In combinatie met een dynamische functie gemiddeld voor verfmoleculen de mediaan van alle geloofwaardige volume maten (95%) beperkt tot minder dan 0,5 nm 3. Echter, deze kleurstofmolecuul posteriors zijn niet meer met hun smFRET metingen aangeeft dat de veronderstellingen leiden tot vals structurele informatie. In tegenstelling, de in het klassieke model posteriors zijn consistent met de bepaalde smFRET efficiëntie. Van de hypothese van isotrope en / of dynamische functie gemiddelde voor alle kleurstoffen leiden tot inconsistenties Fast-NPS maakt kleurstofmolecuul prioren waarbij elke kleurstof kan worden toegewezen een van de vijf modellen. Elk model maakt gebruik van dezelfde toegankelijke volume. Het algoritme voor de berekening van de kleurstof AVS maakt aantal aannamen. Eerst wordt de ruimtelijke vorm van de fluorofoor is benaderd door een bol. Dus een diameter inachtneming wid het fluorofoor&#39;sth, hoogte en de dikte moet worden gebruikt (artikel 12). Verder is het verbindingsstuk van vorm benaderd door een flexibele stang. De in artikel 12 waarden werden berekend voor de kleurstof Alexa 647 gekoppeld via een 12-C linker. Tot op heden is het niet mogelijk om nauwkeurig te bepalen a priori welk model het meest geschikt is, aangezien een experimentele geometrie, en dus alle modellen worden getest. In het algemeen zal men het model dat de kleinst mogelijke afmetingen geeft achterste kiezen, terwijl het nog steeds in overeenstemming met de gegevens. Nagaan modelkeuze is met de smFRET data berekenen we zowel het achterste en de waarschijnlijkheid. Consistentie betekent dat meer dan 90% van de vanuit het achterste monsters binnen het 95% betrouwbaarheidsinterval van de waarschijnlijkheid. Hoewel het waar is dat hoe lager de anisotropie, hoe kleiner de afstand onzekerheid in een netwerk smFRET geometrische opstellingen van de kleurstofmoleculen moeten ook in aanmerking worden genomen. Dus, terwijl representing kleurstofmoleculen met een lage fluorescentie anisotropie met een iso-model is een typische eerste keus, de consistentie test geeft een meer directe manier voor het selecteren van de juiste kleurstof model. De optimale keuze van kleurstof modellen kunnen leiden tot een drastische verhoging lokalisatie precisie en tegelijkertijd behouden consistentie van het netwerk met FRET data. Om samen te vatten, Fast-NPS maakt het mogelijk om structurele en dynamische informatie van grote macromoleculaire complexen te krijgen. In tegenstelling tot normale structuur werkwijzen zoals x-ray kristallografie of cryo elektronenmicroscopie dit voeren ter controle zeer flexibele of transient complexen, dus sterk verruimen onze mechanistisch begrip van complexe biologische processen.

Het bepalen van de structuur van een biomolecuul is een belangrijke voorwaarde voor het begrijpen van zijn functie. Twee goed gevestigde methoden voor structuurbepaling zijn cryo-elektronenmicroscopie en X-ray kristallografie 1, 2. Vandaag, beide methoden bieden een hoge-resolutie structurele informatie met een resolutie tot aan de Angstrom niveau. Deze twee methoden zijn uitgebreid gebruikt om de structuur van grote biomoleculen zoals helderen eiwitcomplexen. Hoewel de bestaande werkwijzen continu gedurende de laatste jaren verbeterd, de complexiteit van biologische structuren vormt nog steeds een belangrijke uitdaging voor structurele biologie, in het bijzonder bij grote, dynamische en kortlevende complexen onderzocht 3. Om de dynamiek van macromoleculaire complexen en de structuur-functie relatie name bestuderen single-molecule methodologieën provided nuttige informatie 4. Verschillende nieuwe strategieën ontwikkeld verschaffen van een orthogonale aanpak op het verwerven van structurele en dynamische informatie. Voorbeelden zijn hoge snelheid AFM 5, mechanische manipulatie 6, fluorescentie microscopie lokalisatie 7, evenals individuele molecuul Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) 8, 9. Aangezien al vroeg FRET is genoemd moleculair liniaal, door de afstand afhankelijkheid van de lengteschaal van biomacromoleculen 10. Een bijzonder interessante toepassing van smFRET is de afstand informatie van smFRET metingen gebruiken om afleiden structurele informatie 11, 12, 13, 14, 15 </sup&gt;, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. Vanwege de hoge tijdsresolutie van smFRET kan de positie van de beweegbare delen van een eiwitstructuur worden gelokaliseerd. Echter, om kwantitatieve informatie smFRET data belangrijk correctieparameters de kleurstofmoleculen extraheren moet tijdens de meting 24 te bepalen. Met deze correctiefactoren, kan de FRET efficiëntie E FRET worden berekend met de formule <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq1.jpg" /> , waar ik A en I D </sub&gt; de fluorescentie-intensiteit van de donor en de acceptor molecule zijn (zie figuur 2). De β-factor is goed voor cross-talk, het lekken van donor-emissie in de acceptor kanaal en wordt berekend door <img alt="vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq2.jpg" /> waarin I &#39;en A Ik zou de fluorescentie-intensiteit van de donor en de acceptor molecule na bleken door het acceptormolecuul. Het γ-factor corrigeert het verschil in de relatieve detectie-efficiëntie van de twee kanalen en de verschillen in de fluorescentie kwantumopbrengst van de donor en de acceptor kleurstof. Het wordt berekend op basis van elk individu tijd spoor door Merk op, dat deze beschrijving verwaarloost directe excitatie van de acceptor molecule, die soms belangrijk wordt en zou moeten worden gecorrigeerd ook. Voor het vaststellen van deze correctiefactoren is het nuttig om zowel de donor als de acceptor wekken in een afwisselend schema 25 om onderscheid te maken tussen foto-fysische veranderingen en structuurdynamica. Om niet alleen kwantitatieve smFRET efficiëntie maar ook kwantitatieve structurele informatie te verkrijgen, de Nano-Positioning System (NPS) werd in 2008 26. De naam werd gekozen op basis van de overeenkomsten met de satelliet-gebaseerde Global Positioning System (GPS). De NPS is een hybride techniek combineert smFRET en röntgenkristallografie gegevens voor het lokaliseren van onbekende kleurstof posities in Biomacromoleculaire complexen. de crystal structuur fungeert als referentieframe en de smFRET resultaten worden gebruikt om informatie afstand tussen een onbekende fluorofoor positie (antenne) en staat bekend uit de kristalstructuur (satelliet) te verkrijgen. In opeenvolgende experimenten werd de afstand tussen de antenne en meerdere satellieten worden gemeten en de positie van de antenne wordt bepaald met behulp van een statistisch rigoureuze analyseschema Bayesian parameterschatting. Daardoor is niet alleen de meest waarschijnlijke positie van de antenne berekend, maar de volledige 3D onzekerheid distributie, de zogenaamde posterior, gevisualiseerd door geloofwaardige volumes. Bovendien NPS uitgebreid, teneinde de analyse van complete netwerken smFRET 27. De NPS is gebruikt om een ​​aantal belangrijke vragen in eukaryote transcriptie, namelijk tijdens het stroomopwaartse DNA, de niet-matrijs-DNA en de ontluikende mRNA in het RNA polymerase II elongatie co lossenmplex 12, 28, blijkt ook het effect van transcriptie initiatie factoren 26 en de dynamische architectuur van een open-promotor complex 29. Bovendien, de NPS werd gebruikt om de structuur van de Archaea RNA Polymerase geopend complex 30 met name de positie van transcriptie initiatie factor TFE, die competitief aan dezelfde plaats als transcriptiefactor elongatie factor Spt4 / 5 31 helderen. Sindsdien zijn er een aantal smFRET gebaseerd structurele aanpak is gepubliceerd op 15, 18, 21, 23. Bij het vergelijken van verschillende smFRET gebaseerd structurele methoden, wordt duidelijk dat de schijnbare nauwkeurigheid van de werkwijze sterk afhankelijk van de bepaalde keuze van kleurstof modellen. Men moet er rekening mee datkleurstofmoleculen kunnen verschillende ruimtelijke en oriënterende gedrag vertonen afhankelijk van de lokale omgeving. Hiertoe werd Fast-NPS 32 geïntroduceerd. Fast-NPS maakt gebruik van een geavanceerde sampling algoritme het verminderen van de rekentijden drastisch. Bovendien, Fast-NPS maakt het mogelijk om een ​​structurele analyse uit te voeren en voor elke kleurstof molecule kan de gebruiker kiezen uit een reeks van vijf verschillende kleurstof modellen die volgende zal worden beschreven. De meest conservatieve model, de zogenaamde klassieke, gaat ervan uit dat de kleurstof neemt slechts één, maar onbekende, positie. Bij deze stand kan de fluorofoor vrij draaien binnen een kegel, waarvan de grootte wordt bepaald door zijn respectieve (tijdsafhankelijke) fluorescentie anisotropie. De oriëntatie van de conus is onbekend, wat leidt tot grote onzekerheden bij het converteren van gemeten smFRET efficiëntie in afstanden. In dit opzicht is het model conservatief, omdat het leidt tot de kleinste precisie vergeleken met andere kleurstoffen modusls. Alleen voor zeer korte afstanden moet de aannames van het klassieke model leiden tot een merkbaar onjuiste positiebepaling. Voor typische smFRET waarden wordt de juiste positie steeds ingesloten in het relatief grote volume geloofwaardig. Aangezien een hogere nauwkeurigheid gewenst is, is het belangrijk om te ontwikkelen en te testen alternatieve modellen kleurstof, die kan bijdragen tot de nauwkeurigheid te verbeteren. Als de kleurstof veel sneller dan zijn inherente fluorescentie levensduur roteert, kan de zogenaamde iso model worden toegepast. Hier is de oriëntatie factor K2 (nodig voor het berekenen van de karakteristieke isotrope Förster radius <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq4.jpg" /> ) Is ingesteld op 2/3. Dientengevolge, de berekende geloofwaardige volumes bijna twee orden van grootte kleiner in vergelijking met die in de klassieke model 32. In het geval dat de fluorofoor in een omgeving die niet alleen snel maakt reorientatie, maar daarnaast snelle beweging over haar toegankelijke volume moet de meanpos-iso-model worden gebruikt. In dit model, de kleurstof effectief neemt slechts een gemiddelde positie, waarbij de ruimtelijke middeling wordt verklaard door een polynoom afstand conversie 15. Dit model is van toepassing als bijvoorbeeld de (algemeen hydrofobe) kleurstof wordt een hydrofiel gebied, bijvoorbeeld het DNA bevestigd. Toepassing van de meanpos iso-model leidt tot een verdere verkleining van de geloofwaardige volumes met een factor van ongeveer twee. Echter, kan een kleurstof gebonden aan een eiwit reversibel binden aan verscheidene hydrofobe vlekken in het sterisch toegankelijke volume (AV). Een fluorofoor dat onmiddellijk schakelt tussen deze regio&#39;s, maar binnen één regio ondergaat vrije rotatie en snelle gelokaliseerde beweging wordt het best beschreven door de var-meanpos-iso-model. Voor een vergelijkbare situatie waarbij de kleurstof niet vrij de var-meanpos model geldt roteren. meer d<html> IJZE over deze modellen kunt u vinden in onze recente publicatie 32. Deze modellen bieden een uitgebreid repertoire om specifiek rekening te houden met de verschillende omgevingen een kleurstof tegenkomen en de toepassing ervan optimaliseert wijselijk de lokalisatie precisie. Fast-NPS elke kleurstof molecuul gekoppeld aan een bepaalde positie kan worden toegewezen aan een specifiek voertuig, zodat FRET-partners mogen verschillende modellen. Dit maakt het mogelijk onbeperkt en close-to-natuur modellering. Het is echter belangrijk dat men voert strikt statistische proeven uit teneinde de door de uiteindelijke modellencombinatie resultaat nog steeds in overeenstemming met de experimentele gegevens. Deze tests zijn in de Fast-NPS software. Om Fast-NPS toepassing op experimentele gegevens van de meting (alleen) drie invoerparameters vereist. Ten eerste, de kleurstof-pair specifieke isotrope Förster radii (/54782/54782eq5.jpg &quot;/&gt;) Moeten worden bepaald. Daarom is de kwantumopbrengst (QY) van de donorkleurstof, de donor fluorescentie-emissiespectra en de acceptor absorptie spectra te meten nodig. Deze metingen kunnen worden uitgevoerd in bulk, met een standaard spectrometer en een standaard fluorescentie spectrometer. Voor elk paar, het R 0 wordt vervolgens berekend met de freeware PhotochemCAD en kan worden gebruikt in de NPS analyse. Ook de (Tijdsgeresolveerde) fluorescentie anisotropie van de kleurstofmoleculen moeten worden verkregen met een polarisatie (en tijd) gevoelige fluorescentie spectrometer. de belangrijkste invoerparameters voor Fast-NPS zijn smFRET rendementen gemeten op een enkel-molecuul fluorescentie microscopie setup, zoals een totale interne reflectie fluorescentie microscoop (TIRFM) . Hier presenteren we een stap-voor-stap protocol voor het verkrijgen smFRET databank toepassen Fast-NPS (figuur 1).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Flowchamber voorbereiding</td></tr><tr><td>Aangepaste metall staalhouder</td><td>zelf gebouwd</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>kwartsglas slides, 76&nbsp;mm x 26&nbsp;mm</td><td>Technical Glass Products</td><td>26007</td><td></td></tr><tr><td>coverslips, 60 mm x 24&nbsp;mm</td><td>Marienfeld</td><td>101242</td><td></td></tr><tr><td>detergent, Hellmanex II</td><td>Hellma</td><td>320.001</td><td></td></tr><tr><td>ultrazuiver water van Synergy UV</td><td>Millipore</td><td>2512600</td><td></td></tr><tr><td>Zepto plasma cleaner</td><td>Diener</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>(3-aminopropyl)-triethoxysilaan, p.a.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>methoxy PEG-succinimide valerate, 5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>gebiotinyleerd PEG-succinimide valerate, 5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>BIOTIN-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Natrium bicarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761 Sigma&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Natrium carbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127 Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>sealing film (Nescofilm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12981805</td><td></td></tr><tr><td>Tygon flexibele siliconen slang, 0.8&nbsp;mm ID, 2.4&nbsp;mm OD</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics</td><td>720958</td><td></td></tr><tr><td>Fine-Bore Polyethyleen slang, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12665497</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Life Technologies</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Total internal reflection fluorescence microscoop</td></tr><tr><td>Nd:YAG Laser, 532 nm</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td>EXLSR-532-100-CDRH</td><td></td></tr><tr><td>diode-gepompte solid-state laser, 491 nm, Calypso</td><td>Cobolt</td><td>904010050</td><td></td></tr><tr><td>diode laser 643 nm, iBeam smart</td><td>Toptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td></td></tr><tr><td>dichroic spiegel, 532 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-540</td><td></td></tr><tr><td>dichroic spiegel, 476 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-476z</td><td></td></tr><tr><td>akoesto-optische afstembare filter</td><td>AA Opto-Electronic</td><td>AOTFnC-VIS</td><td></td></tr><tr><td>plano-convex cilindrische lens, f = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1703L1-A</td><td></td></tr><tr><td>plano-concave cilindrische, f = -300&nbsp;mm</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>prisma, PS 991</td><td>Thorlabs</td><td>PS991</td><td></td></tr><tr><td>focuslens, f = 75&nbsp;mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1608-B</td><td></td></tr><tr><td>seringpomp, PHD 2000</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2002</td><td></td></tr><tr><td>2 stepper motors, Z812B</td><td>Thorlabs</td><td>Z812B</td><td></td></tr><tr><td>piëzoëlektrische actuator, PE4</td><td>Thorlabs</td><td>PE4</td><td></td></tr><tr><td>IR diode laser</td><td>Edmund Optics</td><td>CPS808</td><td>onderdeel van het autofocus systeem</td></tr><tr><td>dichroic spiegel, 775 DCXR</td><td>Chroma</td><td>775 DCXR</td><td></td></tr><tr><td>positie-detectie detector (PSD), PDP90A</td><td>Thorlabs</td><td>PDP90A</td><td>onderdeel van het autofocus systeem</td></tr><tr><td>water-immersie objectief, Plan Apo 60X WI, NA 1.2</td><td>Nikon</td><td></td><td>MRD07601</td></tr><tr><td>dichroic spiegel, 645 DCXR</td><td>Chroma</td><td>645 DCXR</td><td>onderdeel van de emissiebaan</td></tr><tr><td>emissie filter, 3RD550-510</td><td>Omega Optical</td><td>3RD550-510</td><td>groene kanaal in de emissiebaan</td></tr><tr><td>emissie filter, 3RD660-760</td><td>Omega Optical</td><td>3RD660-760</td><td>rode kanaal in de emissiebaan</td></tr><tr><td>EMCCD camera, iXon+ DU897EBV</td><td>Andor</td><td>AND-20-00032</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV</td><td>Andor</td><td>AND-20-000141</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Diverse</td></tr><tr><td>Varian 50</td><td>Cary</td><td></td><td>UV-VIS spectrometer</td></tr><tr><td>Fluorolog2</td><td>SPEX</td><td></td><td>fluorescentiespectrometer</td></tr><tr><td>Solis (V4.15)</td><td>Andor</td><td></td><td>besturingssoftware voor de EM-CCD camera</td></tr><tr><td>Apt gebruikers utility&nbsp; (V1.022)</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>besturingssoftware voor de piëzo-motoren</td></tr><tr><td>Norland Optical Adhesive 68</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>kleefstof</td></tr><tr><td>PC-AFN-0.8 Nile red</td><td>Kisker Biotech</td><td></td><td>avidine-gecoate fluorescente multispec beade&nbsp;</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>technische reken taal voor aangepaste geschreven software</td></tr><tr><td>Origin (V9.0)</td><td>Originlab</td><td></td><td>wetenschappelijke grafiek en gegevensanalyse software</td></tr><tr><td>Hellma 105-202-15-40</td><td>Hellma</td><td>105-202-15-40</td><td>absorptie cuvet met 1&nbsp;cm padlengte</td></tr><tr><td>Hellma 105-251-15-40</td><td>Hellma</td><td>105-251-15-40</td><td>fluorescentie cuvet met 3 mm padlengte</td></tr></tbody></table>

structurele informatie van single-molecule fret experimenten met de fast nano-positioneringssysteem

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) kan worden gebruikt om structurele informatie over biomoleculaire complexen in real-time te verkrijgen. Hierbij worden meerdere smFRET-metingen gebruikt om een onbekende kleurstofpositie binnen een eiwitcomplex te lokaliseren door middel van trilateratie. Om kwantitatieve informatie te verkrijgen, gebruikt het Nano-Positioneringssysteem (NPS) probabilistische gegevensanalyse om structurele informatie uit röntgenkristallografie te combineren met gegevens van single-molecule fluorescentie om niet alleen de meest waarschijnlijke positie te berekenen, maar ook de volledige driedimensionale waarschijnlijkheidsverdeling, aangeduid als posterior, die de experimentele onzekerheid aangeeft. Het concept werd gegeneraliseerd voor de analyse van smFRET-netwerken met talrijke kleurstofmoleculen. De nieuwste versie van NPS, Fast-NPS, beschikt over een nieuw algoritme dat gebruik maakt van Bayesiaanse parameterschattingen op basis van Markov Chain Monte Carlo-sampling en parallelle tempering, waardoor de analyse van grote smFRET-netwerken in een relatief korte tijd mogelijk is. Bovendien maakt Fast-NPS de berekening van de posterior mogelijk door voor elke kleurstof een van de vijf verschillende modellen te kiezen, die rekening houden met het verschillende ruimtelijke en oriëntatiegedrag dat de kleurstofmoleculen vertonen als gevolg van hun lokale omgeving.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het verkrijgen van smFRET-gegevens en het toepassen van Fast-NPS. We geven gedetailleerde instructies voor het verkrijgen van de drie invoerparameters van Fast-NPS: de smFRET-waarden, evenals de kwantumopbrengst en anisotropie van de kleurstofmoleculen. Onlangs is NPS gebruikt om de architectuur van een open promotorcomplex van archaea te verduidelijken. Deze gegevens worden gebruikt om de invloed van de vijf verschillende kleurstofmodellen op de posterior-verdeling te demonstreren.

Transcriptie is de eerste stap in genexpressie in alle organismen. In Archaea, wordt transcriptie door één RNA-polymerase (RNAP) uitgevoerd. Ten opzichte van eukaryoten, de Archaea RNAP draagt ​​een opvallende structurele gelijkenis met hun eukaryote tegenhangers, terwijl met een eenvoudiger transcriptie machines. Aldus kan Archaea worden gebruikt als een modelsysteem voor de eukaryote transcriptie-initiatie door RNA polymerase bestuderen II (Pol II). Onlangs heeft de volledige architectuur van de Archaea RNA-polymerase geopende complex is vastgesteld op basis van single-molecule FRET en NPS. De gegevens uit NPS analyse werd gebruikt om een ​​model van de volledige Archaea geopend promotor complex dat bruikbaar inzicht geeft in de werking van transcriptie initiatie bouwen. Om deze structuur op te helderen, werden smFRET rendementen gemeten tussen onbekende antenne kleurstofmoleculen gelegen binnen de open promotor complex en verschillende bekende satelliet kleurstofmoleculen die op vijf referentie-sites in de RNAP, waarvan de posities zijn bekend uit kristallografische structuren (pdb-ID: 2WAQ) werden opgenomen 37. De antenne kleurstoffen werden vastgemaakt aan één van verschillende posities op de niet-matrijs-DNA, TFB, TBP of TFE. Totale netwerk gebruikt in deze studie bestond uit meer dan 60 gemeten afstanden. Figuur 7 toont het model van de volledige Archaea geopend promotor complex gebouwd van de NPS-analyse. Het omvat de dubbelstrengs promotor DNA (licht en donker blauw), het RNA-polymerase (grijs) en de transcriptie initiatie factoren TBP (paars), TFB (groen) en TFE (geel). Het model wordt gesuperponeerd met de resultaten van de NPS analyse, de geloofwaardige volumes, die werden berekend met het klassieke model (A), het iso-model (B), de meanpos-iso-model (C), de var-meanpos-iso model (D) en de var-meanpos<html> model (E). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig1.jpg" /> Figuur 1: Workflow van de overname en de verwerking van de parameters die nodig zijn voor de Fast-NPS berekening. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig2.jpg" /> Figuur 2: Voorbeelden van fluorescentie-intensiteit tijd spoor van een smFRET evenement. De fluorescentie-intensiteiten van de donor (groen) en het acceptormolecuul (rood) van de drie karakteristieke fasen: I: smFRET, II: donor fluorescentie na fotobleken acceptor, III: achtergrondfluorescentie donor na fotobleken.g2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig3.jpg" /> Figuur 3: Schematische weergave van de stromingskamer voor smFRET experimenten. De stroom kamer wordt op een op maat gemaakte metalen houder met acryl glazen houders gemonteerd. Het sandwich-ontwerp van de stromingskamer omvat een kwartsglas (fused silica) schuiven met twee gaten voor de bevestiging en uitlaat slang, een afdichtingsfolie en een dekglaasje dat de stromingskamer gesloten. Het prisma voor TIRF verlichting wordt op de onderste helft van de stroom kamer gemonteerd. Hollow tab schroeven zorgen voor de inlaat en uitlaten voor de stroom kamer. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img<html> alt = &quot;Figuur 4&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54782 / 54782fig4.jpg&quot; /&gt; Figuur 4: Bereiding van het kwartsglas glijbaan en het afsluitfolie. Mechanische tekening van het kwartsglas slede waarop de plaats van de openingen (in mm). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig5.jpg" /> Figuur 5: Mechanische tekening van de stroom kamer. De maatregelen voor de aluminium prisma houder, acryl glazen houders en aluminium montageframe worden gegeven in millimeters. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> IGUUR 6 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg &quot;/&gt; Figuur 6: Schematische weergave van het prisma-type TIRF setup voor smFRET experimenten. Afkortingen voor optische componenten: A, opening; DM, dichroïsche spiegel; F, emissie-filter; L, lens; M, spiegel; O, objectief; P, prisma; PSD, positiegevoelige fotodiode; S, monster; PS, positionering stadium; T, telescoop. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 7" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig7.jpg" /> Figuur 7: Simulatie resultaten van de verschillende modelveronderstellingen. Alle foto&#39;s tonen de Archaea RNA-polymerase (pdb-ID: 2WAQ, bovenaanzicht) samen met het model voor promotor DNA (TDNA en ntDNA in blauw en cyaan, respectievelijk), TBP (paars), TFB (groen) en TFE (geel)in de Archaea openen complex 30. De geloofwaardige volumes worden gelegd voor de NPS simulatie resultaten van (A) het klassieke model, (B) de iso-model, (C) de meanpos-iso-model, (D) de var-meanpos-iso-model en (E) de var -meanpos model. Alle volumes worden getoond bij 68% geloofwaardigheid. De klassieke en de var-meanpos netwerken zijn in overeenstemming met de smFRET data. In tegenstelling netwerken waarbij voor alle kleurstoffen de iso, meanpos-iso of de var-meanpos-iso-model wordt gekozen in strijd zijn met de gemeten data. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

We presenteren de opstelling en experimentele procedure om smFRET-gegevens te verkrijgen van grote donor-acceptor-netwerken met een TIRF-microscoop. De stapsgewijze analyse van deze metingen met de Bayesiaanse inferentiesoftware Fast-NPS levert hoog opgeloste structurele informatie op via de toepassing van aangepaste kleurstofmodellen.

Structurele Informatie van Single-molecule FRET experimenten met de Fast Nano-positioneringssysteem

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Het algemene doel van het Fast Nano-positioning systeem is om real-time structurele informatie van biomoleculen te leveren door single-molecule FRET experimenten te combineren met rigoureuze statistische analyse. Deze methode beantwoordt belangrijke vragen op het gebied van structurele biologie, zoals de lokalisatie van flexibele domeinen in macromoleculen waar standaard structurele biologie tools niet kunnen worden toegepast. De belangrijkste verbetering van fast NPS in vergelijking met andere FRET-gebaseerde structurele tools is dat verschillende kleurstofmodellen kunnen worden vergeleken door niet alleen de meest waarschijnlijke posities, maar een driedimensionale waarschijnlijkheidsverdeling te gebruiken.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het structurele gegevens uit de eiwitdatabase combineert met kwantitatieve single-molecule fluorescentiemetingen. Om de procedure te beginnen, monteer een flowkamer en een steekhouder. Om de inlaat- en uitlaatscharen voor te bereiden, schroef siliconen slangen in holle tab-schroeven en snijd de slangen aan beide uiteinden recht met een scheermesje.Schroef de tab-schroeven op de steekhouder. Lijn de kwartsschuifgaatjes van de flowkamer uit met de schroefdraad van de steekhouder. Draai voorzichtig de glazen houderschroeven vast om de flowkamer op zijn plaats te fixeren.Schroef 20 centimeter lange stukken siliconen slang in de inlaat- en uitlaatscharen. Was de flowkamer met 500 microliter PBS. Spoel vervolgens de flowkamer met 100 microliter neutravidin-oplossing in PBS, zorg ervoor dat er een druppel aan het einde van de inlaatslang ontstaat om te voorkomen dat lucht in de steekhouder komt.Klem de inlaat- en uitlaatslang na elke manipulatie dicht om lucht uit de flowkamer te weren. Incubeer de kamer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Was vervolgens de neutravidin-oplossing weg met 500 microliter PBS.Plaats een druppel immersie-olie op het prisma en schroef het prisma op de steekhouder. De single-molecule FRET-gegevens worden verkregen met behulp van een totale interne reflectie fluorescentiemicroscoop. Start de camerasoftware en de stage piezo-motor software.Monteer de kamer horizontaal, zo recht mogelijk en op een manier dat deze alle drie de lasers kruist, op de micrometertrap van de TIRF-microscoop. Voeg immersievloeistof toe en focus de microscoopobjectieven door de IR reflecties te controleren. Stel de cameraparameters, het bestandspad en de automatische incrementparameters in.Start de live camerafeed en bleek de achtergrondfluorescentie met alle drie de lasers met volle intensiteit. Draai vervolgens de laserintensiteiten naar beneden. Laad vervolgens 100 microliter van een oplossing met fluorescerende bollen in de kamer.Wacht 10 minuten tot de bollen aan de oppervlakte van de kamer hechten. Neem een film op met een gezichtsveld van 50 tot 100 bollen en voer een batchanalyse uit met een hoge drempelwaarde voor piekdetectie. Laad het filmbestand en kies twee bollen met duidelijke centra in tegenoverliggende hoeken van het gezichtsveld.Selecteer de pixels met maximale intensiteit in die bollen. Verwijder en maak het prisma schoon. Bereid een tweede steekhouder voor en schroef de prismahouder op de steekhouder.Monteer de steekhouder op de micrometertrap. Laad vervolgens 100 microliter van een oplossing met 50 tot 100 picomolair biotinyleerd fluorescerend gekleurd monster in de steekhouder. Wacht tot de moleculen zich aan de oppervlakte van de steekhouder hechten.Klik tegelijkertijd op Signaal opnemen om de opname te starten en schakel de donor-excitatielaser in. Pas de laserkracht aan om ervoor te zorgen dat ten minste 80%van de moleculen in het gezichtsveld gebleekt is. Vervolgens verplaats de steekhouder om een ongebleekt gebied te tonen en neem de volgende film op. Bleek de rest van de steekhouder op deze manier.Na de metingen op de TIRF-microscoop moeten de verkregen single-molecule FRET-gegevens worden geanalyseerd om de gemiddelde FRET-efficiëntie op te leveren. Voer een batchanalyse uit van de donor- en acceptor-films van het monster. Laad vervolgens de gegroepeerde filmbestanden in de gegevensanalysesoftware.Klik op de knop NIET Geselecteerd om de individuele FRET-fasen aan te geven. Klik op het begin van de FRET-periode, vervolgens het tijdstip waarop de acceptorintensiteit afneemt door bleken en tot slot het tijdstip waarop de donorintensiteit afneemt door bleken. Selecteer in het volgende venster Ja om het geselecteerde FRET-efficiëntietraject te behouden.Zodra elke molecuul is geanalyseerd, sla de trajectgegevens op en analyseer de volgende film. Zodra de analyse voltooid is, voer een script uit om de FRET-resultaten te combineren. Importeer het gecombineerde frame-gewijze FRET-bestand in de gegevensanalysesoftware met behulp van de standaard invoeroptie.Plot de gegevens als een histogram en gebruik de niet-lineaire curve-aanpassingstool om aan te passen aan een Gauss. De overschrijdingswaarde is de belangrijkste FRET-efficiëntie. Gebruik UV VIS en fluorescentiespectroscopie om de isotropische Förster-radius en de steady-state anisotropiewaarden voor elke kleurstof te bepalen.Het nano-positioneringssysteem is geïnspireerd door het bekende GPS, omdat we een onbekende positie, de antenne, lokaliseren met behulp van verschillende bekende posities, de satellieten. Om de NPS-analyse te starten, start u de FastNPS-software en maakt u een nieuw taakbestand. Om de positieprioriteiten van de gelabelde antennes en satellieten te definiëren, voert u in het ModelDyePrior-venster de ruimtelijke resolutie van de gedefinieerde positie in.Sluit het binnenste van het macromolecuul uit door het bijbehorende gecentreerde PDB-bestand te laden. Voer de kleurstofdiameter en de skeletafstand in. Vul de minimale en maximale positiecoördinaten van de mogelijke kleurstoffpositie in.Als de te definiëren positie een satelliet is, selecteer dan kleurstofbevestiging via flexibele verbinder en voer de atoomcoördinaten in vanuit het gecentreerde PDB-bestand. Vul de lengte en diameter van de verbinder in. Klik op bereken toegankelijk volume, sla de positieprioriteit op en exporteer deze voor visualisatie.Herhaal dit proces voor alle satellieten en antennes. Zodra de posities zijn gedefinieerd,

structural-information-from-single-molecule-fret-experiments-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In dit artikel beschrijven we hoe we krijgen FRET sporen van individuele DNA-moleculen geïmmobiliseerd op een oppervlak met behulp van een geautomatiseerde scanning confocale microscoop.

Geautomatiseerd systeem voor Single Molecule Fluorescentie metingen van Surface-geïmmobiliseerde biomoleculen

We beschrijven een werkwijze voor het lokaliseren van fluorescent gemerkte eiwitten in electronenmicroscoop. Fluorescentie wordt eerst gelokaliseerd met foto-geactiveerde lokalisatie microscopie op ultradunne secties. Deze beelden worden dan uitgelijnd op elektronenmicrofoto's van dezelfde sectie.

Nano-Fem: Eiwit Localization Met behulp van foto-geactiveerde Localization Microscopie en Electron Microscopy

Single fluoroforen kunnen worden gelokaliseerd met nanometer precisie met behulp van FIONA. Hier een overzicht van de FIONA techniek is gemeld, en hoe FIONA experimenten uit te voeren wordt beschreven.

Fluorescentie Imaging met One-nanometer nauwkeurigheid (FIONA)

Een methode voor het onderzoeken van de structuur van een eiwitfotoreceptor met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM) wordt beschreven in dit artikel. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) onthult intacte eiwitdimeren op een mica-oppervlak.

Atomic Force Microscopy van Red-Light Fotoreceptoren behulp PeakForce Kwantitatieve Nanomechanical Property Mapping

Er wordt een protocol gepresenteerd om een grote verscheidenheid aan enkele moleculen covalent aan een AFM-tip te koppelen. Procedures en voorbeelden om de adhesiekracht en vrije energie van deze moleculen op vaste ondergronden en bio-interfaces te bepalen, worden gegeven.

Onderzoekt Single Molecule Hechting van Atomic Force Spectroscopie

Er is onlangs een aantal FRET-gebaseerde krachtbiosensoren ontwikkeld, waardoor de proteïne-specifieke resolutie van intracellulaire kracht mogelijk is. In dit protocol laten we zien hoe een van deze sensoren, ontworpen voor de linker van het nucleoskelet-cytoskelet (LINC) complex-eiwit Nesprin-2G kan worden gebruikt om actomyosinekrachten op het nucleaire LINC-complex te meten.

Een protocol voor het gebruik van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensors te meten mechanische krachten over de Nuclear LINC Complex

Hier wordt een protocol voor hoogwaardige FRET-experimenten op het molecuulniveau voorgesteld. Daarnaast kan deze methodologie worden gebruikt om drie conformatieve staten in het ligand-bindende domein van de N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptor te identificeren. Het bepalen van precieze afstande is de eerste stap in de richting van het opbouwen van structurele modellen op basis van FRET-experimenten.

High Precision FRET op single-molecuul niveau voor biomolecule structuur bepaling

Deze gegevens van het protocol, de bouw en de exploitatie van een real-time 3D één deeltje tracking Microscoop staat tracking nanoschaal fluorescerende probes hoge diffusive snelheden en lage foton graaf tarieven.

Een Protocol voor Real-time 3D één deeltje Tracking

Tijd-opgeloste single-molecule eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering is een nuttige fluorescentiespectroscopische nabijheidssensor die gevoelig is voor lokale structurele veranderingen in eiwitten. Hier laten we zien dat het kan worden gebruikt om stabiele lokale conformaties in α-Synuclein te ontdekken, dat ook wel bekend staat als bolvormig ongestructureerd en onstabiel wanneer het wordt gemeten met behulp van de FRET-liniaal met een groter bereik.

Gebruik van time-resolved eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering om stabiele lokale conformaties één α-synucleïnemonomeer tegelijk te identificeren

Dit artikel presenteert een methode voor spatiotemporale analyse van mobiele, single-molecule Förster resonantie energieoverdracht (smFRET)-gebaseerde probes met behulp van widefield fluorescentiemicroscopie. De nieuw ontwikkelde softwaretoolkit maakt het mogelijk om smFRET-tijdsporen van bewegende sondes te bepalen, inclusief de juiste FRET-efficiëntie en de moleculaire posities, als functies van de tijd.

Geautomatiseerde tweedimensionale spatiotemporale analyse van mobiele fret-sondes met één molecuul

Dit protocol beschrijft de toepassing van atoomkrachtmicroscopie en infraroodspectroscopie op nanoschaal om de prestaties van fotothermische infraroodspectroscopie op nanoschaal te evalueren bij de karakterisering van driedimensionale multipolymere monsters.

Vooruitgang in infraroodspectroscopie op nanoschaal om meerfasige polymere systemen te onderzoeken

Leer single-molecule FRET-analyse voor structurele biologie met het Fast Nano-positioneringssysteem. Deze methode combineert TIRF-microscopie met Bayesiaanse inferentie om flexibele domeinen in biomoleculen te lokaliseren.

Structurele Informatie van Single-molecule FRET experimenten met de Fast Nano-positioneringssysteem

Meer video's verkennen