Structurele Informatie van Single-molecule FRET experimenten met de Fast Nano-positioneringssysteem
February 9th, 2017
We presenteren de opstelling en experimentele procedure om smFRET-gegevens te verkrijgen van grote donor-acceptor-netwerken met een TIRF-microscoop. De stapsgewijze analyse van deze metingen met de Bayesiaanse inferentiesoftware Fast-NPS levert hoog opgeloste structurele informatie op via de toepassing van aangepaste kleurstofmodellen.
Het algemene doel van het Fast Nano-positioning systeem is om real-time structurele informatie van biomoleculen te leveren door single-molecule FRET experimenten te combineren met rigoureuze statistische analyse. Deze methode beantwoordt belangrijke vragen op het gebied van structurele biologie, zoals de lokalisatie van flexibele domeinen in macromoleculen waar standaard structurele biologie tools niet kunnen worden toegepast. De belangrijkste verbetering van fast NPS in vergelijking met andere FRET-gebaseerde structurele tools is dat verschillende kleurstofmodellen kunnen worden vergeleken door niet alleen de meest waarschijnlijke posities, maar een driedimensionale waarschijnlijkheidsverdeling te gebruiken.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het structurele gegevens uit de eiwitdatabase combineert met kwantitatieve single-molecule fluorescentiemetingen. Om de procedure te beginnen, monteer een flowkamer en een steekhouder. Om de inlaat- en uitlaatscharen voor te bereiden, schroef siliconen slangen in holle tab-schroeven en snijd de slangen aan beide uiteinden recht met een scheermesje.
Schroef de tab-schroeven op de steekhouder. Lijn de kwartsschuifgaatjes van de flowkamer uit met de schroefdraad van de steekhouder. Draai voorzichtig de glazen houderschroeven vast om de flowkamer op zijn plaats te fixeren.
Schroef 20 centimeter lange stukken siliconen slang in de inlaat- en uitlaatscharen. Was de flowkamer met 500 microliter PBS. Spoel vervolgens de flowkamer met 100 microliter neutravidin-oplossing in PBS, zorg ervoor dat er een druppel aan het einde van de inlaatslang ontstaat om te voorkomen dat lucht in de steekhouder komt.
Klem de inlaat- en uitlaatslang na elke manipulatie dicht om lucht uit de flowkamer te weren. Incubeer de kamer gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Was vervolgens de neutravidin-oplossing weg met 500 microliter PBS.
Plaats een druppel immersie-olie op het prisma en schroef het prisma op de steekhouder. De single-molecule FRET-gegevens worden verkregen met behulp van een totale interne reflectie fluorescentiemicroscoop. Start de camerasoftware en de stage piezo-motor software.
Monteer de kamer horizontaal, zo recht mogelijk en op een manier dat deze alle drie de lasers kruist, op de micrometertrap van de TIRF-microscoop. Voeg immersievloeistof toe en focus de microscoopobjectieven door de IR reflecties te controleren. Stel de cameraparameters, het bestandspad en de automatische incrementparameters in.
Start de live camerafeed en bleek de achtergrondfluorescentie met alle drie de lasers met volle intensiteit. Draai vervolgens de laserintensiteiten naar beneden. Laad vervolgens 100 microliter van een oplossing met fluorescerende bollen in de kamer.
Wacht 10 minuten tot de bollen aan de oppervlakte van de kamer hechten. Neem een film op met een gezichtsveld van 50 tot 100 bollen en voer een batchanalyse uit met een hoge drempelwaarde voor piekdetectie. Laad het filmbestand en kies twee bollen met duidelijke centra in tegenoverliggende hoeken van het gezichtsveld.
Selecteer de pixels met maximale intensiteit in die bollen. Verwijder en maak het prisma schoon. Bereid een tweede steekhouder voor en schroef de prismahouder op de steekhouder.
Monteer de steekhouder op de micrometertrap. Laad vervolgens 100 microliter van een oplossing met 50 tot 100 picomolair biotinyleerd fluorescerend gekleurd monster in de steekhouder. Wacht tot de moleculen zich aan de oppervlakte van de steekhouder hechten.
Klik tegelijkertijd op Signaal opnemen om de opname te starten en schakel de donor-excitatielaser in. Pas de laserkracht aan om ervoor te zorgen dat ten minste 80%van de moleculen in het gezichtsveld gebleekt is. Vervolgens verplaats de steekhouder om een ongebleekt gebied te tonen en neem de volgende film op. Bleek de rest van de steekhouder op deze manier.
Na de metingen op de TIRF-microscoop moeten de verkregen single-molecule FRET-gegevens worden geanalyseerd om de gemiddelde FRET-efficiëntie op te leveren. Voer een batchanalyse uit van de donor- en acceptor-films van het monster. Laad vervolgens de gegroepeerde filmbestanden in de gegevensanalysesoftware.
Klik op de knop NIET Geselecteerd om de individuele FRET-fasen aan te geven. Klik op het begin van de FRET-periode, vervolgens het tijdstip waarop de acceptorintensiteit afneemt door bleken en tot slot het tijdstip waarop de donorintensiteit afneemt door bleken. Selecteer in het volgende venster Ja om het geselecteerde FRET-efficiëntietraject te behouden.
Zodra elke molecuul is geanalyseerd, sla de trajectgegevens op en analyseer de volgende film. Zodra de analyse voltooid is, voer een script uit om de FRET-resultaten te combineren. Importeer het gecombineerde frame-gewijze FRET-bestand in de gegevensanalysesoftware met behulp van de standaard invoeroptie.
Plot de gegevens als een histogram en gebruik de niet-lineaire curve-aanpassingstool om aan te passen aan een Gauss. De overschrijdingswaarde is de belangrijkste FRET-efficiëntie. Gebruik UV VIS en fluorescentiespectroscopie om de isotropische Förster-radius en de steady-state anisotropiewaarden voor elke kleurstof te bepalen.
Het nano-positioneringssysteem is geïnspireerd door het bekende GPS, omdat we een onbekende positie, de antenne, lokaliseren met behulp van verschillende bekende posities, de satellieten. Om de NPS-analyse te starten, start u de FastNPS-software en maakt u een nieuw taakbestand. Om de positieprioriteiten van de gelabelde antennes en satellieten te definiëren, voert u in het ModelDyePrior-venster de ruimtelijke resolutie van de gedefinieerde positie in.
Sluit het binnenste van het macromolecuul uit door het bijbehorende gecentreerde PDB-bestand te laden. Voer de kleurstofdiameter en de skeletafstand in. Vul de minimale en maximale positiecoördinaten van de mogelijke kleurstoffpositie in.
Als de te definiëren positie een satelliet is, selecteer dan kleurstofbevestiging via flexibele verbinder en voer de atoomcoördinaten in vanuit het gecentreerde PDB-bestand. Vul de lengte en diameter van de verbinder in. Klik op bereken toegankelijk volume, sla de positieprioriteit op en exporteer deze voor visualisatie.
Herhaal dit proces voor alle satellieten en antennes. Zodra de posities zijn gedefinieerd,
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerde procedure voor het verkrijgen van single-molecule FRET (smFRET) data met behulp van een totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscoop. De methode integreert Bayesiaanse afleidende software voor verbeterde structurele analyse van biomoleculen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Structuurbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
- Single-Molecule Technieken
Achtergrond
- Snel Nano-positioneringssysteem biedt real-time structurele informatie.
- Combineert smFRET met statistische analyse om flexibele domeinen te lokaliseren.
- Verbetert traditionele FRET-methoden door gebruik te maken van driedimensionale waarschijnlijkheidsverdelingen.
- Integreert structurele gegevens uit eiwitdatabases met fluorescentiemetingen.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het analyseren van biomoleculaire structuren die moeilijk te bestuderen zijn met conventionele technieken.
- Om de resolutie van structurele informatie verkregen uit FRET-experimenten te verbeteren.
- Om een uitgebreid protocol te bieden voor onderzoekers op het gebied.
Gebruikte methoden
- Samenstelling van een stromingskamer en monsterhouder voor FRET-experimenten.
- Voorbereiding en wassen van de stromingskamer met PBS en neutravidine oplossing.
- Verwerving van smFRET-data met behulp van een TIRF-microscoop.
- Analyse van FRET-efficiëntie met behulp van Bayesiaanse afleidende software.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle verwerving van hoge-resolutie smFRET-data.
- Demonstratie van de mogelijkheid van de methode om flexibele domeinen in biomoleculen te lokaliseren.
- Validatie van de FastNPS-software voor het analyseren van FRET-data.
- Stablisering van een protocol dat kan worden gerepliceerd door andere onderzoekers.
Conclusies
- Het snelle Nano-positioneringssysteem verbetert de analyse van biomoleculaire structuren aanzienlijk.
- Deze methode biedt een robuust kader voor toekomstig onderzoek in de structurele biologie.
- Het combineren van FRET met geavanceerde statistische analyse opent nieuwe onderzoeksmogelijkheden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to resolve dynamic structural information of transient biomolecular complexes that are inaccessible to conventional structural biology tools. By integrating single-molecule FRET data with Bayesian inference, it provides quantitative three-dimensional probability distributions that capture experimental uncertainty and support mechanistic de-risking in target validation. The approach enhances predictive confidence in early discovery by localizing flexible domains and informing structure-based design where standard techniques fail.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by localizing unknown dye positions within protein complexes through trilateration of smFRET measurements.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by providing posterior distributions that quantify structural uncertainty in flexible domains.
- Operational Value: Allows comparison of five dye models to assess orientational and spatial behavior, improving target confidence in lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by defining position priors from smFRET data and structural priors from X-ray crystallography.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through probabilistic data analysis that combines fluorescence measurements with structural databases.
- Operational Value: Enables scalable platform reuse by calculating complete three-dimensional posterior distributions for smFRET networks with numerous dye molecules.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease relevance through application to archaeal RNA polymerase open promoter complex, establishing continuity from discovery to preclinical validation.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by capturing dynamic structural information of transient complexes not addressable by existing tools.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by allowing quick comparison of dye models and subsequent MD simulation refinement.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself within the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, enabling iterative refinement of structural models consistent with experimental smFRET data.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by localizing flexible domains in macromolecules where standard structure biology tools cannot be applied.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative single-molecule fluorescence measurements combined with structural data from protein databases.
- Analytics: Provides statistical outputs including credible volumes and posterior distributions that enable teams to compare conditions and assess model consistency.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating structural models against experimental data in biologically relevant systems like open promoter complexes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for analyzing smFRET networks, allowing rapid comparison of dye models and adaptation across target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through three-dimensional probability distributions that indicate experimental uncertainty.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via Bayesian parameter estimation with Markov Chain Monte Carlo sampling and parallel tempering.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling comparison of dye models to minimize credible volumes while maintaining consistency above 90%.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing structural insights that inform advancement decisions in lead optimization pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule fluorescence microscopy, Bayesian inference, and structural biology data integration.
- Needs instrumentation including TIRF microscope, laser systems, piezo-motor stage, and UV-VIS/fluorescence spectroscopy for dye characterization.
- Demands cross-team standardization in defining position priors, dye models, and FRET pair measurements across multiple laboratories.
- Involves adaptation considerations when applying the five dye models to different biomolecular environments and linker chemistries.
- Includes practical limitations such as the need for high-quality smFRET data, accurate quantum yield and anisotropy measurements, and sufficient sampling for convergence in MCMC analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Single-molecule FRET (smFRET) Measurements with Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy
5:19
Determination of Mean FRET Efficiency
6:45
Determination of Credible Volumes with the Fast Nano-positioning System (Fast-NPS)
10:09
Results: smFRET Fast Nano-positioning System Modeling of Archaeal RNA Polymerase Open Promotor Complex
11:42
Conclusion
