Synthese van gekationiseerde Magnetoferritin voor ultrasnelle magnetisatie van Cells

Het algemene doel van deze methode is om een magnetisch nanodeeltje binnen een proteïnekooi te synthetiseren en vervolgens het proteïne zodanig te functionaliseren dat een snelle binding van het magnetische nanodeeltje aan cellen mogelijk wordt. Deze methode kan worden gebruikt om magnetische nanodeeltjes te genereren die een snelle en efficiënte magnetische labeling van cellen mogelijk maken, wat belangrijk is voor toepassingen zoals MRI of magnetische celseparatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat celmagnetisatie kan worden bereikt met lage nanodeeltjesconcentraties en korte incubatietijden, waardoor potentiële bijwerkingen door blootstelling aan nanodeeltjes worden voorkomen.

Begin met het ontzuurstoffen van 500 milliliters gedeïoniseerd water door een buis die is verbonden met een stikstofgascilinder in het water te plaatsen en het vat af te sluiten met vershoudfolie. Laat vervolgens gedurende ongeveer 60 minuten stikstofgas door het water borrelen. Verwarm een waterbad dat is verbonden met het dubbelwandige reactievat tot 65 degrees Celsius.

Voeg vervolgens 75 milliliter 50 millimolaire HEPES-buffer, pH 8,6 toe aan het reactievat. Sluit het vat en ontzuurstof de bufferoplossing door gedurende ongeveer 20 minuten stikstofgas door de oplossing te borrelen. Roer de bufferoplossing tegelijkertijd met een magnetische roerder.

Nadat de HEPES-buffersolutie is gedeoxygeneerd, wordt de stikstofbuis uit de buffer verwijderd, terwijl deze boven de vloeistof blijft hangen om een stikstofatmosfeer te behouden. Voeg apoferritine toe om een eindconcentratie van 3 mg/mL te bereiken. Zet het magnetisch roeren voort, maar verminder de roersnelheid indien er schuimvorming optreedt.

Gebruik voor de synthese van magnetoferritine twee spuitpompen om gelijktijdig 10.1 milliliters van de ijzer-kobaltprecursor en 10.1 milliliters waterstofperoxide in de apoferritine-oplossing te injecteren bij een stroomsnelheid van 0.15 milliliters per minuut. Vervolg met de synthestappen zoals beschreven in het tekstprotocol. Laad vervolgens de monster op een kolom met een kationische matrix met behulp van een peristaltische pomp bij een stroomsnelheid van 10 milliliters per minuut.

Was de kolom met ongeveer 100 milliliter loopbuffer met behulp van een gradiëntpomp bij een stroomsnelheid van 10 milliliter per minuut. Om het eiwit te elueren, wordt de kolom gewassen met 150 milliliter toenemende concentraties natriumchloride en trisbuffer bij 10 milliliter per minuut. Aangezien het eiwit elueert bij een natriumchlorideconcentratie van 500 millimolar, wordt dit opgevangen in fracties van 50 milliliter met behulp van een automatische fractiecollector.

Concentreer de 150 milliliter magnetoferritine tot een volume van ongeveer twee milliliter met behulp van een centrifugale filtereenheid van 15 milliliter, gevolgd door een eenheid van vier milliliter. Raadpleeg de instructies van de fabrikant van de centrifugale filtereenheden voor een gedetailleerd protocol voor deze procedure. Laad vervolgens het geconcentreerde monster met een injectielus op een gelfiltratiekolom.

Was de kolom met running buffer bij een stroomsnelheid van 1,3 milliliters per minuut. Verzamel fracties van zes milliliter met een automatische fractiecollector. Eiwitmonomeren elueren als laatste.

Op dit punt kan gezuiverd magnetoferritine bewaard worden bij vier graden Celsius tot aan de kationisering. Weeg voor 10 milligram magnetoferritine 374 milligram DMPA af en los dit op in 2,5 milliliter 200 millimolar MES-buffer. Stel de pH van de oplossing bij naar ongeveer zeven met behulp van geconcentreerd zoutzuur.

Er komen giftige dampen vrij wanneer u de pH van de DMPA-oplossing aanpast met zoutzuur. Zorg ervoor dat u deze materialen in een zuurkast hanteert. Voeg 2,5 milliliters magnetoferritine-oplossing toe met een concentratie van vier milligram per milliliter.

Voeg een magnetische roerder toe en roer twee uur lang om te equilibreren. Nadat de oplossing is ingesteld op pH 5,0, voegt u 141 milligram EDC-poeder toe aan de DMPA-magnetoferritine-oplossing. Roer nog drie en een half uur verder.

Filter de oplossing door een spuitfilter van 0,22 micron om eventuele neerslagen te verwijderen en dialyseer het eiwit zoals beschreven in het tekstprotocol. Kweek hMSC's zoals beschreven in het tekstprotocol. Was de geplaatste cellen met twee milliliters PBS op kamertemperatuur.

Voeg vervolgens één milliliter van de gesteriliseerde kationische magnetoferritine-oplossing toe aan de geplaatste cellen voordat u deze gedurende de gewenste tijd incubeert. Was de cellen met PBS en oogst ze vervolgens door 0,5 milliliter Trypsine-EDTA toe te voegen en vijf minuten te incuberen bij 37 °C. Voeg één milliliter kweekmedium toe om de trypsine-EDTA te inactiveren, breng de oplossing over naar een centrifugebuis van 15 milliliter en centrifugeer vijf minuten bij 524 ×g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 0,5 milliliter magnetische scheidingsbuffer.

Bevestig vervolgens de magneet aan het multifunctionele statief en plaats een magnetische scheidingskolom op de magneet. Plaats een voor-scheidingsfilter op de kolom. Voeg daarna 0,5 milliliters magnetische scheidingsbuffer toe aan het voor-scheidingsfilter en laat dit door zowel het filter als de kolom lopen om deze te wassen.

Plaats vervolgens een centrifugebuis van 15 milliliter onder de kolom en voeg 0,5 milliliter van de celsuspensie toe aan het filterreservoir van de magnetische scheidingskolom. Wanneer het reservoir leeg is, voegt u 0,5 milliliter magnetische scheidingsbuffer toe. Zodra het reservoir opnieuw leeg is, voegt u nogmaals 0,5 milliliter magnetische scheidingsbuffer toe.

Herhaal de wasbeurt nog een keer, voor een totaal volume magnetische scheidingsbuffer van 1,5 milliliter. Deze wasstap elueert alle niet-gemagnetiseerde cellen uit de kolom. Verwijder de kolom van de magneet en plaats deze in een nieuwe centrifugebuis van 15 milliliter.

Verwijder vervolgens het filter uit het reservoir van de kolom. Voeg 1 milliliter van de magnetische scheidingsbuffer toe aan het reservoir en duw dit onmiddellijk door de kolom met de door de fabrikant meegeleverde zuiger. Hierdoor worden de gemagnetiseerde cellen uit de kolom in de centrifugebuis geëlueerd.

Ga verder met de kwantificering van ijzer zoals beschreven in het tekstprotocol. Transmissie-elektronenmicroscopiebeelden van negatief gekleurde magnetoferritine-monsters toonden aan dat er nanodeeltjes zijn gevormd binnen de proteïnecage. Zeta-potentiaalmetingen bevestigen dat magnetoferritine een positieve oppervlaktelading heeft gekregen na kationisering.

Het blootstellen van humane mesenchymale stamcellen aan gecationiseerde magnetoferritine gedurende één minuut resulteerde in de magnetisering van 92% van de celpopulatie en de aflevering van 3,6 picogram ijzer per cel. Het verhogen van de incubatietijd naar 15 minuten leidde tot de magnetisering van de gehele celpopulatie. Na het bekijken van deze video zou u inzicht hebben in hoe u een magnetisch nanodeeltje in de apoferritineholte kunt synthetiseren door metaalzoutprecursoren sequentieel toe te voegen aan de eiwitoplossing.

Vervolgens wordt beschreven hoe het eiwit chemisch gecationiseerd kan worden met behulp van TMPA-koppeling. Eenmaal beheerst kunnen de synthese, zuivering en cationisering van magnetoferritine in drie dagen worden voltooid, mits dit correct wordt uitgevoerd. Tijdens deze procedure is het belangrijk om zuurstofcontaminatie te vermijden en de juiste temperatuur en pH gedurende de gehele synthese van magnetoferritine te handhaven.

Na deze procedure kunnen andere ladingen, zoals quantum dots of therapeutische middelen, worden ingekapseld in de gecationiseerde apoferritine-cage om een efficiëntere aflevering van deze materialen aan cellen te bereiken. Deze techniek kan de weg effenen voor onderzoekers op het gebied van magnetische celmanipulatie om magnetische labeling te verkennen in cellen die een slechte opname van nanodeeltjes vertonen of die zeer gevoelig zijn voor langdurige blootstelling aan nanodeeltjes of verhoogde concentraties nanodeeltjes.