Name: Het vervaardigen van een UV-Vis en Raman spectroscopie Immunoassay Platform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Leer een aanpasbaar immunoassay-platform ontwikkelen met gouden nanopartikels en UV-Vis/Raman-spectroscopie voor betrouwbare optische detectie van biomarkers.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een Research Catalyst Award van Utah State University. De auteurs willen Annelise Dykes, Cameron Zabriskie en Donald Wooley bedanken voor hun bijdragen.

1. Bereiding van Buffers <ol><li> Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) <ol><li> Verdun 50 ml van 10x PBS met 450 ml HPLC kwaliteit water tot een 1X PBS concentratie te maken. Steriele filter de oplossing met een 0,22 urn filter. </li><li> Winkeloplossing bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Bereiding van Tris gebufferde zoutoplossing + Tween 20 (TBST) <ol><li> Verdun 50 ml van 10x Tris gebufferde zoutoplossing (TBS) met 450 ml HPLC kwaliteit water tot een 1X concentratie te maken. Voeg 250 ul van Tween-20 voor een 0,05% (v / v) Tween-20. Steriele filter de oplossing met een 0,22 urn filter. </li><li> Bewaren bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Bereiding van menselijk serumalbumine (HSA) blokkeeroplossing <ol><li> Weeg 0,45 g HSA in 15 ml steriel gefiltreerde 1 x PBS tot een 3% te w / v HSA oplossing. Vortex oplossing totdat HSA volledig is opgelost. </li><li> WINKEL HSA oplossing bij 4 ° C. OPMERKING: runderserumalbumine(BSA) kan ook worden gebruikt als blokkerende oplossing. </li></ol></li><li> Bereiding van gePEGyleerde antilichaam (Ab-PEG) -oplossing LET OP: Het antilichaam oplossing moet vrij zijn van vervoerder of het stabiliseren van eiwitten zoals BSA, die met conjugatiereacties zou verstoren door te concurreren voor de n-hydroxysulfosuccinimide (NHS) binding sites. Wanneer het antilichaam wordt geleverd in een Tris of glycine bufferoplossing moet een buffer uitwisseling aminen of ammoniumzouten voorkomen stoort de NHS conjugatiereactie ondergaat. Als het antilichaam in een gelyofiliseerde vorm kunnen worden geresuspendeerd volgens de aanbeveling van de fabrikant in een concentratie van 1-10 mg / ml. <ol><li> Op antilichamen in een Tris of glycinebuffer Voer een bufferuitwisseling naar 100 mM natriumbicarbonaat met een ontzoutingskolom. Gebruik de 100 mM buffer om de pH te verhogen tot ongeveer 8,5 tot het versnellen van de conjugatiereactie. </li><li> Hydraat ortho-pyridyl disulfide-PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS) met 100 mM sodium bicarbonaat tot een volume van 1 ml in een concentratie van 1 mg / ml of hoger. LET OP: OPSS-PEG-NHS moet vers worden gemaakt en gebruikt binnen ongeveer 20 minuten. De NHS groep op de OPSS-PEG-NHS heeft een halfwaardetijd van ongeveer 20 min in een waterige oplossing bij pH 8,5. </li><li> Add OPSS-PEG-NHS het antilichaam oplossing bij een 2: 1 verhouding (PEG: Antibody) conjugatie verhouding te gebruiken voor de testmonsters. In een aparte microcentrifugebuis, voeg OPSS-PEG-NHS het antigeen oplossing bij een 2: 1 verhouding van conjugatie wordt gebruikt voor de controle. NB: De 2: 1 verhouding wordt uitgaande van een 50% rendement conjugatie. Het objectief is elk antilichaam te labelen met een PEG-keten. In deze stap, over-labeling is beter dan onder-labeling. Gebruik de volgende vergelijking om de juiste hoeveelheden OPSS-PEG-NHS en oplossing antilichaam te bepalen: <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_2.jpg" /> waarbij V het volume is, C is de concentratie in moleculen oftibodies per ml. Subscripts PEG en Ab OPSS-PEG-NHS en antilichamen, respectievelijk. Het uiteindelijke volume moet ongeveer 250 ul. </li><li> Incubeer PEG-Ab oplossing bij 4 ° C gedurende 8 uur of overnacht. Winkeloplossing in goede hoeveelheden van ongeveer 25 ul bij -20 ° C om de bevriezing dooicycli beperken en zorg ervoor dat lage bindingsaffiniteit buizen gebruikt. </li></ol></li></ol> 2. Bereid UV-Vis / Raman Probes <ol><li> Bereid kale AuNP oplossing <ol><li> Bereid een 2 ml oplossing van AuNPs met een concentratie van ongeveer 1 x 10 11 deeltjes per ml. <ol><li> Als de AuNPs moeten worden geconcentreerd, vul lage binding centrifuge buizen met 2000 ul voorraad AuNP en centrifugeer bij 5000 xg gedurende 20 minuten of totdat het supernatans helder is. Verwijder de bovenstaande vloeistof door pipetteren, zorg dat u de AuNP pellet niet te verstoren. </li><li> Combineer de resterende AuNP oplossingen in één buis en schat de ConcentraTIE verkrijgen van een UV-Vis meten en vergelijken van waarden met bekende concentraties is een lineair verband. </li></ol></li></ol></li><li> Bepaal de juiste Raman verslaggever etikettering verhouding <ol><li> Bereid een werkoplossing van het Raman reporter opgelost in methanol. Deze concentratie is afhankelijk van de reporter gebruikt wordt. In dit werk voor te bereiden 3,3-diethylthiatricarbocyanine jodide (DTTC) bij een werkende oplossing van 200 micrometer. </li><li> Uitgaande van een eindvolume van 100 ui voor elk putje, voeg genoeg van de werkende reporter oplossing in elk putje van de eerste rij van een 96-wells plaat zodanig dat de Raman reporter zal variëren in concentraties van 0,2 uM tot 10 uM. Voeg genoeg HPLC kwaliteit water aan elk putje zodat het volume 80 pi. Voeg 20 ul van AuNP aan elk putje om een ​​eindvolume van 100 ul per put. Een voorbeeld wordt gegeven in tabel 1. </li><li> Meet het UV-Vis spectra van 400 tot700 nm met behulp van een plaat lezen UV-Vis spectrofotometer. De geschikte concentratie van de hoogste concentratie met gedefinieerde pieken voor de UV-Vis spectra. Herhaal stap 2.2.2 bij toenemende concentraties tot de hoogste concentratieverhouding van Raman reporters AuNPs gevonden. OPMERKING: De kleurstof en AuNP vorm, grootte en fabrikant beïnvloeden de geschikte concentratie. Daarom moet de vermelde stappen worden beoordeeld en aangepast afhankelijk van de elementen. Dit protocol omvatte de toepassing van een positief geladen kleurstof. Als zodanig, binding tussen de AuNP en reporter werd verbeterd door het gebruik van negatief geladen AuNPs. Dit werd gedaan met behulp van citraat bedekte AuNPs. Zie de discussie sectie voor meer informatie. </li></ol></li><li> Bindend Raman reporter en PEG-Ab naar AuNP <ol><li> Bereid twee 1,5 ml partijen AuNP en Raman reporter op de vastgelegde concentratie, waardoor de Raman reporter te binden aan de AuNPs gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li><li> Voeg het gepegyleerde antilichaam (Ab-PEG) tot een partij van de AuNP en Raman reporter oplossing voor een 200 maken: 1 verhouding van antilichamen tegen deeltjes. Deze oplossing zal zijn voor de testmonsters. In een aparte microcentrifugebuis, voeg gePEGyleerde antigeen aan de andere partij van de AuNP en Raman reporter oplossing bij een 200: 1 verhouding van antilichaam tegen deeltjes worden gebruikt als de controle. Incubeer de oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. OPMERKING: De verhouding van antilichamen tegen deeltjes specifiek voor de AuNPs en kleurstof gebruikt en moeten worden geoptimaliseerd voor elk individueel geval. Het doel hier is om de hoogste verhouding van antilichamen voor de AuNP probes binden aan en voorkomt aggregatie van de deeltjes. Gebruik de volgende vergelijking om de juiste hoeveelheden te bepalen om samen te voegen: <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_200.jpg" /> waarbij V het volume is, C is de concentratie in deeltjes per ml of antilichamen. de final volume moet ongeveer 1,5 ml. </li></ol></li><li> Block overige locaties op het AuNP oppervlak met mPEG-SH. <ol><li> Bereid mPEG-SH door oplossende vaste methoxypolyethyleenglycol thiol een 200 uM concentratie met water. Vortex de oplossing tot mPEG-SH volledig is opgelost. </li><li> Add mPEG-SH met een 40.000: 1 verhouding voor AuNP-PEG-Ab oplossing bereid in stap 2.3. Incubeer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 10 min te zorgen voor de resterende plaatsen op de gouden nanodeeltjes worden geblokkeerd. Gebruik de volgende vergelijking om de juiste hoeveelheden te bepalen om samen te voegen: <img alt="Vergelijking" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_40000.jpg" /> waarbij V het volume is, C is de concentratie in deeltjes per ml of antilichamen. Het eindvolume moet ongeveer 1,5 ml. </li></ol></li><li> Recover gefunctionaliseerde Raman probes. <ol><li> Centrifuge deeltjes bij 5.000 g gedurende 20 min in lage bind centrifuge buizen of totdat het supernatans helder is. Verwijder de bovenstaande vloeistof door pipetteren zorg dat u de AuNPs niet te verstoren. </li><li> Resuspendeer de deeltjes met 1 ml 1x PBS-oplossing die eerder werd gemaakt. Schat de AuNP concentratie door een UV-Vis meting van een kleine hoeveelheid oplossing (3 ui) en de resultaten vergelijkt met metingen van een bekende concentratie AuNP. Stel het volume zodanig dat de uiteindelijke oplossing ten minste 1 x 10 11 deeltjes per ml. </li><li> Winkeloplossingen bij 4 ° C totdat het wordt gebruikt voor het functionaliseren van de immunoassay plaat. Gebruik de oplossingen binnen een week. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Volumes toevoegen van elke component (ml) </td></tr><tr><td> DTTC uiteindelijke concentratie (mm) </td><td> DTTC werkende oplossing (200 mm) </td><td> AuNP </td><td> Water </td></tr><tr><td> 0.2 </td&gt; <td> 0.1 </td><td> 20 </td><td> 79.9 </td></tr><tr><td> 0.6 </td><td> 0.3 </td><td> 20 </td><td> 79.7 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.5 </td><td> 20 </td><td> 79.5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1.0 </td><td> 20 </td><td> 79 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 2.5 </td><td> 20 </td><td> 77.5 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 3.5 </td><td> 20 </td><td> 76.5 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 5.0 </td><td> 20 </td><td> 75 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. DTTC verdunning voorbeeld. Verschillende verdunningen van DTTC en de bijbehorende volumes voorraad DTTC, gouden nanodeeltjes oplossing en water. 3. Immunoassay Plate Voorbereiding <ol><li> Binden gewenst antigeen aan de immunoassay plaat. <ol><li> Bereid voldoende verdund antigeen (50 ug / ml) aan de putjes polystyreen vullen. Vortex de oplossing,en meteen de oplossing toe te voegen aan de putjes. Laat het antigen te binden aan de platen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li></ol></li><li> Afwassen ongebonden antigenen. <ol><li> Verwijder de overtollige antigeen oplossing door storten oplossing in een afvalcontainer en het raken van de plaat tegen een papieren handdoek bedekte tafelblad. </li><li> TBST toevoegen aan de putjes aan het oppervlak te wassen verwijdert de was op dezelfde wijze als eerder vermeld. Herhaal deze stap nog twee keer. </li></ol></li><li> Resterende blok bindingsplaatsen op de plaat om niet-specifieke binding te voorkomen. <ol><li> Voeg 70 ul van HSA blokkerende oplossing aan elk putje van de plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Verwijderen en spoel de plaat volgens dezelfde procedure als beschreven in stap 3.2. Bedek de plaat en opslag droog bij 4 ° C tot klaar voor verder gebruik. </li></ol></li><li> Functionaliseren immunoassay plaat. <ol><li> Voeg 70 gl tHij sonde nanodeeltjes bereid in deel 2 naar de eerste kolom van een 96-putjesplaat en verdund daaropvolgende kolommen onder toepassing van een 1: 2 seriële verdunning. Laat de plaat geïncubeerd gedurende ten minste 1 uur. Een voorbeeld van hoe de immunoassay plaat prepare wordt gegeven in figuur 3. </li><li> Was de plaat met TBST vijf keer zoals beschreven in de stappen 3.2, zorg ervoor te ontdoen van de AuNPs gepast. Na de laatste wasbeurt, voeg 70 pl 1x PBS aan elk putje en afdekken met een plaat afdichting. NB: De controlemonsters moet helder zijn. Als niet-specifieke binding is opgetreden, zal de controlemonsters dezelfde kleur als de analysemonsters. </li></ol></li><li> Test assay gevoeligheid door UV-Vis en Raman spectroscopie. <ol><li> Voor elk putje, meet het UV-Vis spectrum tussen 400 en 700 nm met behulp van een plaat lezen UV-Vis spectrofotometer. </li><li> Middels een omgekeerde Raman microscoop, richten de doelstelling op het oppervlak van de put dat de AuNP probes heeft. obTain een Raman spectra van de put. Verzamel een spectrum variërend van 1800 cm-1 tot 400 cm -1. Herhaal deze stap voor alle putjes. </li><li> Behulp van een geschikte spectrale software voert een 11 Ode orde polynoom basislijncorrectie de Raman spectra en een 3e orde polynoom van de UV-Vis spectra. </li><li> Behulp van een geschikte spectrale software, normaliseren de Raman en UV-Vis spectra. Stel de maximumwaarde 1 en dienovereenkomstig schaal alle andere waarden. De Raman spectra normaliseren, selecteer een unieke polystyreen piek en zet deze gelijk aan 1 en dienovereenkomstig schaal alle andere waarden. </li><li> Met behulp van een geschikte spectrale software, het uitvoeren van peak-integratie voor elk spectrum. Voor Raman spectra, moet de piek die de Raman reporter in een gebied afwezig polystyreen pieken. Piek integratie uit te voeren, geeft u de integrale grenzen voor de gewenste piek en de gewenste piekoppervlak voor alle monsters, met inbegrip van de controles op te nemen. </li><li> plot de gemiddelde piekoppervlak van belang als een functie van de log van de concentratie AuNP foutbalken voor elk punt aangeven bijbehorende standaarddeviatie. Breng deze kalibratiepunten een 4-parameter logistische curve. </li><li> Bepaal de gemiddelde waarde van de blanco door het gemiddelde gebied van de piek van belang voor een blanco monster. Bepaal de standaardafwijking van deze gebieden; Dit is de standaarddeviatie van de blanco. </li><li> Om dezelfde piek in de vorige stap geanalyseerd, vindt de standaardafwijking van die piekoppervlak voor de laagste concentratie. </li><li> Bereken de grens van het onbewerkte en onderste detectielimiet zoals gespecificeerd in de sectie Representatieve resultaten. Gebruik deze waarden met de 4PL kalibratiecurven de LLOD te bepalen in termen van AuNP concentratie. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIsraelsen%2C+ND+%22Sci.+World+J%22">Sci. World J</a>. , e124582(2015).</li>
<li>Wang, Y., Schlücker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+and+synthesis+of+SERS+labels%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Rational design and synthesis of SERS labels.</a> Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Yan, B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERS+tags%3A+novel+optical+nanoprobes+for+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis.</a> Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Immunoassay+Handbook%3A+Theory+and+applications+of+ligand+binding%2C+ELISA+and+related+techniques%22">The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques</a>. , Elsevier Science: Oxford. Waltham, MA. (2013).</li>
<li>Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCox%2C+KL+%22Assay+Guid.+Man%22">Assay Guid. Man</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="
	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/
	">
	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/
	</a> (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ELISA+development+guide%22">ELISA development guide</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf">https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf</a> (2016).</li>
<li>Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+Raman-labeled+nanoparticles+for+a+dual-modality%2C+light+scattering+immunoassay+on+a+polystyrene+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate.</a> J. Biol. Eng. 10, (2016).</li>
<li>Menges, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMenges%2C+F+%22Spekwin32+-+optical+spectroscopy+software.+Version+1.72.1%22">Spekwin32 - optical spectroscopy software. Version 1.72.1</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="http://www.effemm2.de/spekwin/">http://www.effemm2.de/spekwin/</a> (2016).</li>
<li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li>
<li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+Antibody+Binding+on+Protein+Microarrays+using+Microarray+Nonlinear+Calibration%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration.</a> BioTechniques. 54, 257-264 (2013).</li>
<li>Armbruster, D. A., Pry, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limit+of+blank%2C+limit+of+detection+and+limit+of+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Biochem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation.</a> Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EP17-A2%3A+Evaluation+of+Detection+Capability+for+Clinical+Laboratory+Measurement+Procedures%3B+Approved+Guideline%22">EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline</a>. 32. No 8, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, 19087, USA. 
 <a target="_blank" href="http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html">http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html</a> (2012).</li>
<li>Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+assessing+the+reliability+of+molecular+diagnostics+based+on+multiplexed+SERS-coded+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles.</a> Plos One. 8 (4), e62084(2013).</li>
<li>Sinha, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+binding+potential+of+cell-surface+receptors+in+fresh+excised+specimens+via+dual-probe+modeling+of+SERS+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles.</a> Sci. Rep. 5, 8582(2015).</li>
<li>Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+cells+using+targeted+surface-enhanced+Raman+scattering+nanoparticles+and+magnetic+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment.</a> J. Biomed. Opt. 19, 056014(2014).</li>
<li>Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silica-coated+dimers+of+silver+nanospheres+as+surface-enhanced+Raman+scattering+tags+for+imaging+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells.</a> Interface Focus. 3 (3), 20120092(2013).</li>
<li>McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+surface-enhanced+Raman+tags%3A+individual+nanorods+for+measurements+from+the+visible+to+the+infrared+%28514-1064+nm%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Nano%22%5BJournal%5D)">Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm).</a> Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

In de gedetailleerde protocol, zijn er verschillende kritische punten aan te pakken. Een probleem is de keuze van Raman reporter en gouden nanodeeltjes. Hoewel het protocol worden aangepast voor individueel gebruik werd geschreven, werd het Raman reporter DTTC als voorbeeld. DTTC is een positief geladen reporter en bindt aan negatief geladen oppervlakken zoals citraat bedekte AuNPs. Dit protocol kan worden aangepast voor negatief geladen reporters met gouden nanodeeltjes met een positieve oppervlaktelading. Bijvoorbeeld...

Typische sandwich immunoassays indirect detecteren van de aanwezigheid van een antigeen met twee antilichamen. De capture-antilichaam wordt gebonden aan een vast oppervlak en vormt een antilichaam-antigeen complex als in de nabijheid van een geschikt antigeen. Een detectie antilichaam wordt vervolgens ingebracht en bindt aan het antigen. Na wassen wordt het antilichaam / antigeen / antilichaamcomplex overblijfselen en gedetecteerd door het gelabelde detectie antilichaam zoals getoond in Figuur 1A. Typische detectie wordt uitgevoerd door een fluorescente of colorimetrische detector, multiplexing beperkt tot 10 analyten door brede spectrale pieken 2,3. Daarentegen Raman-gebaseerde systemen veel smallere emissiepieken waardoor er betere mogelijkheden met multiplexing bronnen beweren gelijktijdige detectie tot 100 analyten 2,3. Vele literatuurbronnen beschikbaar die belangrijke aspecten omvatten immunoassays 4-6 als de stap-voor-stapDetails om gepersonaliseerde ELISA-kits te creëren. Helaas, deze protocollen zijn voor fluorescerende of colorimetrische detectie, het beperken van multiplexing vermogen van op maat gemaakte immunoassays. Om hieraan te voldoen, presenteren wij een gedetailleerde procedure voor de UV-Vis / Raman immunoassay eerder gepubliceerd 7 een directe immunoassay zoals in figuur 1B fabriceren. Dit protocol omvat de fabricage van gefunctionaliseerde goud-nanodeeltjes probes, geïllustreerd in figuur 2. De procedure voor de Raman / UV-Vis probes maken begint door binding Raman reporters aan het oppervlak van goud nanodeeltjes (AuNPs). De AuNPs worden vervolgens gefunctionaliseerd met antilichamen die zijn gekoppeld aan polyethyleenglycol (PEG). Resterende bindingsplaatsen op de AuNPs worden geblokkeerd door binding methoxypolyethyleenglycol thiol (mPEG-SH) naar AuNPs daaropvolgende niet-specifieke binding tijdens de analyse te voorkomen. De bereide AuNP probes getest door binding aan antigenenbevestigd aan de putjes van een polystyreen plaat zoals getoond in figuur 1B. Na wassen van de plaat, worden de AuNP probes gedetecteerd met UV-Vis-spectroscopie en de daarmee samenhangende Raman reporters worden gedetecteerd met Raman spectroscopie. De combinatie van UV-Vis en Raman spectrale gegevens op twee manieren van analyses, het verbeteren van de mogelijkheden van deze immunoassay.

<table><tbody><tr><td>60 nm Gold Nanoparticle</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15708-6</td><td>Dit zijn met citraat beklede goudnanodeeltjes. Zie Discussie voor de relatie tussen Raman-reporter en AuNP-oppervlaktelading en de betekenis ervan voor de juiste selectie van AuNP en/of Raman-reporter.</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339000000</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline (10x) pH 7.5</td><td>Scy Tek</td><td>TBD999</td><td></td></tr><tr><td>Bottle Top Filtration Unit</td><td>VWR</td><td>97066-202</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polysorbaat 20)</td><td>Scy Tek</td><td>TWN500</td><td>Wordt gebruikt als emulgerend middel voor wasstappen.</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zout 10x-concentraat, pH 7,4</td><td>Scy Tek</td><td>PBD999</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Tube 2,0&nbsp;ml</td><td>Eppendorf Tubes</td><td>22431102</td><td>LoBind-buizen voorkomen binding van eiwitten en AuNP's aan de oppervlakken van de buizen.</td></tr><tr><td>Protein LoBind Tube 0,5&nbsp;ml</td><td>Eppendorf Tubes</td><td>22431064</td><td>LoBind-buizen voorkomen binding van eiwitten en AuNP's aan de oppervlakken van de buizen.</td></tr><tr><td>Microplate Devices UniSeal</td><td>GE Healthcare</td><td>7704-0001</td><td>Wordt gebruikt voor het afdichten en opslaan van gefunctionaliseerde platen.</td></tr><tr><td>Assay Plate, met deksel met lage verdamping, 96-well platte bodem</td><td>Costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-kwaliteit water</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-4L</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Diethylthiatricarbocyaninejodide (DTTC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>381306-250MG</td><td>Raman-reporter</td></tr><tr><td>mPEG-Thiol, MW 5.000 - 1 gram</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td>MPEG-SH-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>OPSS-PEG-SVA, MW 5.000 - 1&nbsp;gram</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td>OPSS-PEG-SVA-5000-1g</td><td>OPSS-PEG-SVA heeft een NHS-uiteinde.</td></tr><tr><td>Muis IgG, hele molecuul Controle</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31903</td><td>Antigeen</td></tr><tr><td>Geit anti-muis IgG (H+L) Kruis Geadsorbeerd Secundair Antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31164</td><td>Antilichaam</td></tr><tr><td>Menselijke Serum Albumine Blocking Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1887-1G</td><td>Rundserumalbumine kan in plaats daarvan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Mini Centrifuge</td><td>Fisher Schientific</td><td>12-006-900</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis Spectrofotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis Spectrofotometer</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>Desalting Columns</td><td>Thermor Scientific</td><td>87766</td><td></td></tr><tr><td>In-house gebouwde 785&nbsp;nm omgekeerde Raman-microscoop-eenheid</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Een omgekeerde Raman-microscoop is het beste voor het correct focussen op het oppervlak van de welp. Anders zal een zeer lage vergroting worden gebruikt vanwege de hoogte van de 96-wellplaat. Een in-house gebouwd systeem werd gebruikt omdat het goedkoper was dan kopen bij een leverancier. Echter, elk commercieel verkrijgbaar omgekeerde Raman-microscoopsysteem kan worden gebruikt.</td></tr></tbody></table>

het vervaardigen van een uv-vis en raman spectroscopie immunoassay platform

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

Immunoassays worden gebruikt om eiwitten op basis van de aanwezigheid van bijbehorende antilichamen. Door hun grote gebruik in onderzoek en klinische settings, kan een grote infrastructuur van immunoassay instrumenten en materialen te vinden. Bijvoorbeeld, 96- en 384-well polystyreen platen zijn in de handel verkrijgbaar en hebben een standaard ontwerp aan ultraviolet-zichtbare (UV-Vis) spectroscopie machines van verschillende fabrikanten tegemoet te komen. Daarnaast is een grote verscheidenheid aan immunoglobulinen, detectie labels en blokkeringsmiddelen voor aangepaste ontwerpen immunoassay zoals enzymgekoppelde immunosorbent assays (ELISA) zijn beschikbaar. Ondanks de bestaande infrastructuur, hoeft standaard ELISA-kits niet voldoen aan alle behoeften aan onderzoek, waarvoor geïndividualiseerde immuno-ontwikkeling, die duur en tijdrovend kan zijn. Bijvoorbeeld, ELISA kits lage multiplexing (detectie van meer dan één analyt tegelijkertijd) kunnen leveren als gewoonlijk afhankelijk fluorescentie of colorimetric methoden voor detectie. Colorimetrische en fluorescerende gebaseerde analyses hebben beperkte multiplexing mogelijkheden als gevolg van brede spectrale pieken. Daarentegen Raman-spectroscopie gebaseerde werkwijzen hebben een veel grotere capaciteit voor multiplexen door smalle piekt. Een ander voordeel van Raman spectroscopie is dat Raman verslaggevers ervaren aanzienlijk minder fotobleken dan TL-tags 1. Ondanks de voordelen die Raman verslaggevers hebben meer dan fluorescerende en colorimetrische labels, protocollen te fabriceren Raman-gebaseerde immunoassays zijn beperkt. Het doel van dit document is een protocol gefunctionaliseerde probes te bereiden voor gebruik in combinatie met polystyreen platen voor directe detectie van analyten door UV-Vis analyse en Raman spectroscopie bieden. Dit protocol zal toelaten onderzoekers om een ​​doe-het-zelf-aanpak voor de toekomstige multi-analytdetectiezone terwijl het benutten van vooraf vastgestelde infrastructuur.

In deze studie werden 60 nm gouddeeltjes gebruikt voor UV-Vis spectroscopie. UV-Vis absorptiespectra 400-700 nm werden verzameld en het piekoppervlak voor elke AuNP concentratie werd bepaald met behulp van een open source spectrale analyse software 8. Voorafgaand aan de integratie van de piek, de verzamelde spectra onderging basislijn correctie met behulp van een driepunts polynoom fit. Piekoppervlakken werden gebruikt om een logaritmische kalibratiecurve gegenereerd zoals aangetoond in figuur 4.</str...

Nanodeeltje-gebaseerde optische sondes zijn ontworpen als een voertuig voor het detecteren van antigenen met behulp van Raman en UV-Vis spectroscopie. Hier beschrijven we een protocol voor het voorbereiden van dergelijke sondes voor een UV-Vis/Raman spectroscopie immunoassay op een manier die toekomstige multiplexing mogelijkheden kan integreren.

Het vervaardigen van een UV-Vis en Raman spectroscopie Immunoassay Platform

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

Het algemene doel van dit protocol is om de ontwikkeling van een aanpasbare immunoassay op basis van goudnanodeeltjes te demonstreren, die geanalyseerd kan worden met behulp van UV-visuele en Raman-spectroscopie. Het gebruik van twee optische methoden zorgt voor interne validatie van de assay en vergroot de flexibiliteit ervan. Deze methode beantwoordt kernvragen betreffende de ontwikkeling van een immunoassay op basis van goudnanodeeltjes.En legt uit hoe de functionalisering van het nanodeeltje in deze assay de optische absorptie en lichtverstrooiing beïnvloedt. Dit protocol is uniek omdat het materialen bevat die in typische onderzoekslaboratoria te vinden zijn om een immunoassay-platform te vervaardigen dat kan worden aangepast aan individuele onderzoeksbehoeften. De immunoassay is gebaseerd op UV-Vis- en Raman-spectroscopie.Het gebruik van Raman-spectroscopie is superieur aan fluorescentie- of colorimetrische methoden, omdat het smallere bandbreedtes heeft waardoor meerdere biomarkers gelijktijdig gedetecteerd kunnen worden. Hydrateer ter beginbehandeling het bifunctionele crosslinking-middel of de pyridyl-disulfide PEG-NHS in 100 mL natriumbicarbonaat. Het ortho-pyridyleinde z

fabricating-a-uv-vis-and-raman-spectroscopy-immunoassay-platform

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Kwantitatieve, high-throughput, real-time, en label-free biomoleculaire detectie (DNA, eiwitten, enz.) op...

Biomoleculaire Detectie gebruik de interferometrische reflectie Imaging Sensor (IRIS)

In this video, we describe the Raman spectroscopy-based direct immunoassay method for detecting specific target antigens. The antibodies, which are adsorbed onto the surface of gold nanoparticles attached to Raman probes, interact with target antigens and produce a specific Raman spectrum, which is subsequently detected.

A Raman Spectroscopy-Based Direct Immunoassay to Detect a Specific Antigen

We beschrijven de fabricage en karakterisering van nanobiologische systemen die geïnterfacede nanogestructureerde substraten met geïmmobiliseerde eiwitten en aptameren. De relevante experimentele stappen met betrekking tot lithographische fabricage van nanogestructureerde substraten, bio-functionalisering en karakterisering met behulp van oppervlakte-versterkte Raman-spectroscopie (SERS) worden gerapporteerd. SERS-detectie van op het oppervlak geïmmobiliseerde eiwitten en het onderzoek van...

Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detectie van biomoleculen met behulp van EBL Fabricated Nanostructured Substrates

Een werkwijze voor de productie en het uitvoeren van het filter gebaseerde Raman spectroscopische (SERS) assay voor de detectie van chemische verontreinigingen (bijvoorbeeld pesticiden ferbam en antibioticum ampicilline) behandeld.

A-filter op basis Surface Enhanced Raman spectroscopische test voor snelle opsporing van chemische verontreinigingen

We detail een werkwijze driedimensionale papieren microfluïdische inrichtingen te vervaardigen voor gebruik bij de ontwikkeling van immunoassays. Onze benadering inrichtingsamenstel is een type van gelaagde, additive manufacturing. We tonen een sandwich immunoassay representatieve resultaten voor deze soorten papier gebaseerde apparaten verschaffen.

Fabricage van Driedimensionale Paper-based microfluïdische apparaten voor een immunoassay

Dit protocol beschrijft de fabricage van een kleine, kant-en-klare cassette die kan worden toegepast voor visuele detectie van meerdere nucleic zuren in een enkele, test die is eenvoudig te bedienen. In deze benadering werd een capillaire matrix gebruikt voor multiplex en zeer efficiënte opsporing van GGO-doelstellingen.

Visuele detectie van meerdere Nucleic Acids in een capillaire matrix

Huidige multiplexed diagnostiek te detecteren Zika, chikungunya, dengue virussen vereisen complexe monstervoorbereiding en dure instrumentatie en moeilijk te gebruiken in omgevingen met lage resource. Laten we een diagnose die gebruikmaakt van isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte strand verschuifbare sondes op te sporen en deze virussen onderscheiden met hoge gevoeligheid en specificiteit.

Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

Dit protocol presenteert een geïntegreerde Ramanspectroscopie-massaspectrometrie (MS) platform dat is geschikt voor het bereiken van één-cel resolutie. Raman-spectroscopie kan worden gebruikt om cellulaire reactie op drugs te bestuderen, terwijl MS kan worden gebruikt voor gerichte en kwantitatieve analyse van de opname van geneesmiddelen en metabolisme.

Een geïntegreerde Raman-spectroscopie en massaspectrometrie platform voor het bestuderen van de opname van één cel drug, metabolisme, en effecten

Elektrowetting-gebaseerde digitale microfluidic is een techniek die gebruik maakt van een spanning-gedreven verandering in de schijnbare contacthoek van een microliter-volume druppel om de manipulatie te vergemakkelijken. Door dit te combineren met gefunctionaliseerde magnetische kralen, kunnen meerdere laboratoriumeenheden worden ingebracht voor monstervoorbereiding en identificatie van ziekteverwekkers met behulp van immunosorbent Assay (ELISA) met enzymgebonden immunosorbent assay.

Elektrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Dit artikel stelt een nieuwe generatie multiparametrische analytische platforms voor met een verhoogde doorvoer voor de karakterisering van extracellulaire vesikelsubsets. De methode is gebaseerd op een combinatie van multiplexed biosensing-methoden met metrologische en morfomechanische analyses door atomaire krachtmicroscopie, gekoppeld aan Raman-spectroscopie, om vesiculaire doelen te kwalificeren die vastzitten op een microarray-biochip.

Multimodaal analytisch platform op een multiplexed surface plasmon resonance imaging chip voor de analyse van extracellulaire vesikel subsets

Hier presenteren we een protocol om individuele kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) te analyseren met labelvrije oppervlakte-versterkte Raman-spectroscopie (SERS), waardoor minimaal invasieve ziektediagnostiek en beoordeling van sEV's als therapeutische toedieningsmiddelen mogelijk worden.

Onderzoek naar de toepassing van oppervlakteversterkte Raman Scattering-gebaseerde biosensing van individuele sEV's in ziektediagnose en therapieën

Leer een aanpasbaar immunoassay-platform ontwikkelen met gouden nanopartikels en UV-Vis/Raman-spectroscopie voor betrouwbare optische detectie van biomarkers.

Het vervaardigen van een UV-Vis en Raman spectroscopie Immunoassay Platform

Meer video's verkennen