SILAC Based Proteoom karakterisatie van exosomen van HIV-1 geïnfecteerde cellen

Het algemene doel van deze procedure is om het exosomale proteoom van HIV-1 geïnfecteerde cellen te karakteriseren. Deze methode kan helpen om de belangrijke vraag in het veld van exosome biologie te beantwoorden, zoals het effect van externe stress op de samenstelling van het exosome proteoom. Het grote voordeel van deze techniek is dat het kan worden geleerd, zelfs met een beperkte achtergrond in proteomics en exosome biologie.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in HIV-infectie, kan het ook worden toegepast op andere ziektestudies zoals bacteriële infecties. De H9-cellijn wordt in dit experiment gebruikt, hoewel verschillende cellijnen kunnen worden gebruikt, zolang ze zich in een actief proliferarende fase bevinden en vatbaar zijn voor de testconditie van keuze. Zaai twee keer 10 tot de zesde fase negen cellen in elk van de twee celcultuurkolven.

Laat een populatie groeien in 10 milliliter gelabeld medium dat 10% gestileerd FBS, 100 milligram per liter C13-gelabelde L-lysine en 100 milligram per liter C13 en N15-gelabelde L-arginine bevat. Laat de andere populatie groeien in 10 milliliter ongelabeld medium met 10% gestileerd FBS, L-lysine en L-arginine. Laat de cellen groeien gedurende zes verdubbelingstijden, waarbij de eiwitten van de cellen in het gelabelde medium meer dan 99% gelabeld zijn met zware aminozuren.

Voeg op regelmatige tijdsintervallen vers medium toe of ververs het medium, afhankelijk van het type cellen. Aan het einde van de labeling, verhoog het cultuurvolume tot 30 milliliter om de groei van meer cellen te accommoderen. Infecteer de gelabelde cellen met de NL4-3-stam van HIV-1 met behulp van een standaard HIV-1 infectieprotocol.

Voeg een geschikte hoeveelheid virus toe aan de cellen en incubeer gedurende 48 uur terwijl de ongelabelde cellen verder groeien in ongelabeld medium zonder HIV-1 infectie. Aan het einde van de HIV-1 infectie worden de supernatanten van beide celpopulaties geoogst voor exosome isolatie. Verzamel de supernatanten van de culturen in 50-milliliter conische buizen, waarbij de cellen worden vermeden.

Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 keer g en vier graden Celsius om resterende cellen te verwijderen. Verzamel de supernatanten in nieuwe 50-milliliter conische buizen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 2.000 keer g om dode cellen te verwijderen. Breng de resulterende supernatanten over naar commerciële rotor-compatibele buizen die bestand zijn tegen ultracentrifugering.

Zorg ervoor dat de ultracentrifugebuizen in balans zijn. Centrifugeer de buizen gedurende 30 minuten bij 10.000 keer g om cellulaire debris te verwijderen. Verzamel de supernatanten in nieuwe ultracentrifugebuizen.

Centrifugeer gedurende 70 minuten bij 100.000 keer g. Gooi het supernatant weg. Resuspendeer elk exosome-rijk pellet in vijf milliliter vers PBS en breng de oplossing over naar een verse ultracentrifugebuis.

Centrifugeer opnieuw gedurende 70 minuten bij 100.000 keer g. Gooi na de laatste centrifugatie het supernatant weg. De cellenpellets zijn nu klaar voor eiwitextractie.

Om deze procedure te beginnen, lost u elk geïsoleerd exosomale pellet op in 100 tot 200 microliter fer-pa-lai-ses en extractiebuffer met toegevoegde proteaseremmers die een volledig bereik van proteasen kunnen remmen. Centrifugeer de opgeloste oplossingen gedurende 10 minuten bij 13.000 keer g en vier graden Celsius. Breng de opgehelderde supernatanten over naar nieuwe 1,5-milliliter microcentrifugebuisjes.

Nadat u de eiwitconcentratie van elk monster hebt gekwantificeerd door middel van standaardtesten, mengt u gelijke hoeveelheden eiwitten uit de gelabelde en ongelabelde monsters. Laat het gelijke mengsel 30 minuten lopen op een vier tot 20% SDS-PAGE-gel. Verf de gel met Coomassie-blauw en ontvlek daarna.

Snijd met behulp van een scheermes de steekproefstrook van de gel en snijd vervolgens de gelbaan in 10 tot 15 gelijke stukken. Doe elk stuk in een verse 1,5-milliliter microcentrifugebuis voor een totaal van 10 tot 15 buisjes en ga door met de eiwitextractieprocedure zoals beschreven in het tekstprotocol. De procedures voor proteomische gegevensanalyse worden niet gedemonstreerd, maar worden samengevat in deze stroomdiagram.

De geëxtraheerde eiwitten worden eerst geanalyseerd door middel van vloeistofchromatografie, tandem massaspectrometrie en de kwaliteit van de gegevens wordt beoordeeld. Vervolgens worden de gegevens voorbehandeld door eiwitten te verwijderen die minder dan twee gekwantificeerde peptiden hebben. Aanzienlijk opgereguleerde en downgereguleerde eiwitten worden vervolgens geïdentificeerd.

Ten slotte worden de replica's van de significante kandidaten vergeleken om consistentie te bereiken en worden de gegevens van alle replica's samengevoegd. Gebruik voor het begin van de karakterisering van de geïdentificeerde eiwitten hun GenBank-toegangsnummers of UniProt-ID's om te zoeken in huidige exosome databases. ExoCarta wordt in deze demonstratie gebruikt.

Klik op zoeken en voer de naam van het gen of eiwit of het toegangsnummer in. Elk bewijs in exosomen bevestigt dat de kandidaat-eiwitten eerder in exosomen zijn gevonden en voegt een laag van vertrouwen toe dat de kandidaten inderdaad in exosomen zijn. Zoek vervolgens de kandidaten in de HIV-1 en humane eiwitinteractiedatabase.

Voer bij de invoer van de naam van het eiwitdomein de namen of toegangsnummers van de kandidaat in en klik op zoeken. De zoekresultaten kunnen inzicht geven in de interacties tussen HIV-1 en de eiwitkandidaten en suggereren welke van de kandidaten mogelijk echt HIV-1-gerelateerd zijn. De derde stap is om wereldwijd inzicht te krijgen in de kandidaten met behulp van een genontologie of GO-analysesoftware zoals fun-brich.

Klik onder verrijkingsanalyse op toegevoegd dataset en upload de GenBank-toegangsnummers of UniProt-ID's van de kandidaten, selecteer vervolgens het grafiektype om de GO-analyse te visualiseren. GO-analyseresultaten worden gevisualiseerd in de vorm van taartdiagrammen die informatie