Name: Voorbereiding van de primaire Mixed glialculturen van volwassen muis Spinal Cord Tissue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Leer primaire gemengde gliacultuur opzetten uit volwassen muizenruggenmerg voor onderzoek naar neuropathische pijn en neurologische ziekten. Deze methode biedt een betrouwbaar in vitro systeem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gemengde culturen van volwassen ruggenmerg werden voor het eerst ontwikkeld met behulp van ratten met subsidieondersteuning van een NIH/NIDA R01-award (PI De Leo) en een NIH T32-trainingssubsidie (PI Green). Deze methoden werden verder aangepast voor muisruggerggen met ondersteuning van de volgende subsidies: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao) en NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). De auteurs willen ook Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, bedanken voor zijn technische hulp bij het verkrijgen van microglia-rijke gemengde gliacellen.

Het volgende protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van New England. Het volgende protocol is voor het bereiden van glialculturen van 4 volwassen muis ruggenmerg. 1. Voorbereiding van de Solutions in een cultuur van de Kap onder aseptische omstandigheden <ol><li> Bereid kweekmedia: compleet Dulbecco&#39;s modificatie van Eagle&#39;s medium (cDMEM) DMEM (met 4,5 g / l glucose), 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 IU / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine , 250 ng / mL Amfotericine B, en 50 uM 2-mercaptoethanol (2-ME, zie 1.1.1). Mix en filter steriliseren alle andere componenten en voeg vervolgens FBS. Bewaar het kweekmedium bij 4 o C. <ol><li> Bereid 50 mM 2-ME / fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voorraadoplossing: voeg 100 gl geconcentreerde 2-ME (14,3 M) in 28,6 ml 1x PBS en filter steriliseren (de oplossing is worden opgeslagen bij 4 ° C aantal maanden). Use 1 ml 2-ME voorraad oplossing voor elke 1.000 ml van de cultuur media. </li></ol></li><li> Bereiding van de dichtheidsgradiënt media <ol><li> Bereid een voorraad isotone dichtheidsgradiënt media-oplossing (bijvoorbeeld 100% Percoll) vanaf 1 deel 10x reguliere steriele PBS en 9 delen steriele voorraad dichtheidsgradiënt media (bijvoorbeeld Percoll). </li><li> Verdun de 100% dichtheidsgradiënt media (in 1.2.1) met regelmatige 1x steriele PBS tot een 20% dichtheidsgradiënt media (bijvoorbeeld 10 ml 100% dichtheidsgradiënt media met 40 ml 1x PBS) te maken en het op 4 o C. Breng de 20% dichtheidsgradiënt media op kamertemperatuur (KT) alvorens haar celkweek. </li></ol></li><li> Bereiding van oplossingen van het papaïne dissociatie systeem LET OP: De papaïne dissociatie systeem kan worden geïdentificeerd in het Materials tabel. Andere soortgelijke dissociatie kits (inclusief de aanwezigen in-house) kan ook worden gebruikt. alle componenten;NTS moeten steriel zijn. <ol><li> Voeg 32 ml Earle&#39;s Balanced Salt Solution (EBSS) aan de ovomucoïde remmermengsel (poeder). </li><li> Voeg 5 ml EBSS om een ​​papaïne flacon (poeder). Plaats de papaïne flacon in een 37 ° C waterbad gedurende 10 minuten of totdat de papaïne opgelost. </li><li> Voeg 500 ul van EBSS een DNase flacon (poeder). Meng voorzichtig. </li><li> Voeg 250 ul van de oplossing DNase (hierboven) om de papaïne flacon. </li><li> Bereken de totale hoeveelheid van de hierboven papaïne / DNase mengsel nodig (ongeveer 800 pl papaïne / DNase mengsel per muis ruggenmerg) en de benodigde mengsel over in een 50 ml buis weefsel digestie (stap 3,2). Bewaar de overgebleven in de oorspronkelijke flesje bij 4 ° C gedurende ten minste twee weken. </li><li> Houd alle onderdelen van de kits op ijs totdat het nodig is. </li></ol></li><li> Bereid ruggenmerg verzamelbuizen: een steriele 15 ml buis met 5 ml Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS, van het papaïne dissociatie systeem,0, voor het verzamelen van het ruggenmerg) en een steriele 15 ml buis met 1x PBS (voor het opvullen van de 5 ml spuit, zie stap 2.4). Bovendien, bereiden een steriele petrischaal (35 mm of 60 mm) met 5 ml HBSS en bewaar het in de cultuur kap. </li></ol> 2. Spinal Cord Collection OPMERKING: Alle apparatuur moet steriel zijn. Voer de collectie in een aangewezen gebied door de IACUC goedgekeurd. <ol><li> Vraag de volgende instrumenten voor het oogsten van de muis ruggenmerg: straight scherpe / stompe 18-cm chirurgische schaar, een 12-cm standaard scalpel (# 3 vast), carbon staal steriel scalpel mesjes # 10, een klein dier Decapitator, 12-cm standaard gebogen tang, en een steriele 20G naald bevestigd aan een 5-mL spuit. </li><li> Euthanaseren het dier met CO 2 en desinfecteren muis kop en het achtergebied met 70% ethanol (EtOH). </li><li> Onthoofden dier met de Decapitator. Maak een middelste longitudinale incisie op de onderrug naar de spierlaag bloot te leggen. Makeneen schone doorsnijding door de gewervelde kolom op heuphoogte (ook snijden door de spierlaag dat de gewervelde kolom covers) met de steriele rechte chirurgische schaar (18 cm). </li><li> Leg het dier op een vel van verse wegwerp vegen. Steek de 20 G naald (bevestigd aan een 5 ml injectiespuit gevuld met steriele 1x PBS (stap 1.4)) in de wervelkolom in de richting van de rostrale kant voorzichtig. Houd het dier af te strak en snel druk op de spuit. De hele ruggenmerg moeten komen uit de cervicale einde. Verzamel het ruggenmerg in de ml buis 15 met HBSS. </li><li> Herhaal stap 2.4 voor de rest van de muizen. Tussen elk dier, desinfecteer alle gebruikte instrumenten met 70% EtOH. LET OP: Meestal kan een enkele 12-well plaat worden vastgesteld voor elke 4 muis ruggenmerg (zie 4.3). </li></ol> 3. Voorbereiding van de Single Cell Suspension Opmerking: Voer stap 3 en 4 in een cultuur kap om alles steriel te houden. <ol><li> Breng alle ruggenmerg in de HBSS-bevattende petrischaal (stap 1.4). Snijd elk van de ruggenmerg in de vele mooie, kleine stukjes met een steriele schaar en pincet. Breng het ruggenmerg weefsel om de 50 ml conische buis met de bereide papaïne / DNase enzymmengsel (stap 1.3.5) met steriele pincet of een 10 ml pipet (niet te verhogen HBSS het enzymmengsel, zoals verder zal verdunnen de voorbereide enzymoplossing en kan leiden tot verminderde prestaties van het enzym). </li><li> Vortex de buis voorzichtig om te mengen. Incubeer de buis bij 37 ° C gedurende 1 uur in een incubator / schudinrichting met orbitaal schudden bij 150 rpm. </li><li> Vortex de buis steeds krachtig vermaal de enzymoplossing met het weefsel met een 5 ml pipet verder dissociatie bevorderen. </li><li> Breng de celsuspensie in een 15 ml buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Tijdens centrifugeren, meng 2,7 ml EBSS met 300 pi van gereconstitueerd albumine-ovomucoïd inhibitor oplossing (1.3.1) in een steriele buis. Voeg 150 ul van de oplossing DNase (stap 1.3.3). </li><li> Na het centrifugeren, verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet met de oplossing boven bereide (stap 3.5). Vortex goed aan de celpellet breken. </li><li> Voeg 3 mL gereconstitueerd albumine-ovomucoïd remmeroplossing (stap 1.4.1) aan de celsuspensie. Centrifugeer cellen bij 70 xg gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant (dat membraanfragmenten bevat). </li></ol> 4. Verdere Verwijdering van myeline van Single Cell Suspension <ol><li> Voeg 8 ml 20% dichtheidsgradiënt media (bereid in stap 1.2.2) in de buis met het celpellet, wervel voorzichtig om de pellet te verstoren, en centrifugeer de cellen bij 800 g gedurende 30 min bij kamertemperatuur zonder remmen. Verwijder voorzichtig de bovenste laag van puin (meestal myeline) en de bovenstaande, maar houd de korrel. </li><li> Om resten van de dichtheidsgradiënt te verwijderen, was de cellen door resuspending de celpellet met 8 ml van een verdunde cDMEM (1 deel cDMEM en 2 delen HBSS). Centrifugeer de cellen bij 400 g gedurende 10 min bij 4 ° C Verwijder de supernatant en was de cellen opnieuw met de verdunde cDMEM (boven) op dezelfde wijze. Houd de cellen op ijs tot hen zaaien. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de celpellet in kweekmedium (cDMEM geleverd met 2-ME (bereid in stap 1.1)). Voor een 12-well plaat gebruikt 3 ml x 4 (aantal gebruikte muizen) + 2 ml = 14 ml media. Dit zorgt ervoor dat er voldoende celsuspensie voor de gehele plaat (12 wells) en voorziet in extra putten die kunnen worden gebruikt om het gemiddelde aantal cellen per putje en microgliale inhoud van de kweek te bepalen. Als andere vormen van cultuur schepen zullen worden gebruikt, berekent het totale volume van de benodigde voedingsbodems proportioneel. </li><li> Voeg 1 ml van de celsuspensie in elk putje van een 12-wells plaat. </li><li> Incubeer de cellen bij 35,9 ° C met 5% CO2. </li><li&gt; Wijzig de media (verwijder de oude media via aspiratie) op D 1 en daarna elke 3-4 d daarna (meestal veranderen de media op D: 1, 4, 8 en 11, en gebruik vervolgens de cellen op dag 12). OPMERKING: Op dag 1, de kweek kunnen significante hoeveelheden afval door het residu myeline van het ruggenmerg weefsel bevatten; dus, het veranderen van de media op dag 1 wordt aanbevolen (zie de discussie voor meer informatie). Culturen zijn klaar voor behandeling van D 12 - 14. Cellen meestal 80% confluent bij D 12 en kan bijna 100% confluent bij D 14. Doorgaans op D 12, zijn er ongeveer 100.000 cellen per putje in een 12-well plaat . </li></ol><img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54801/54801fig4.jpg" /> Figuur 2:. Vertegenwoordiger beelden van gemengde gliacellen op verschillende tijdstippen na de oprichting van de gemengde glia cultuur Primaire ruggenmerg gemengde glia werden bereid uit volwassen C57BL / 6 muizen. representatieve beeldende voortgang van de gliale cultuur na plating. Op dag 1 worden sommige cellen aan de kweekplaat, maar ze zijn nog grotendeels round. Er zijn ook vele drijvende cellen en significant vuil. Op dag 4, de meerderheid van de cellen aan de kweekplaat. Cellen blijken vertakt met zichtbare processen. Cellen worden verdeeld en sporadisch culturen ongeveer 20-30% confluent op dit moment. Op dag 8, culturen zijn tussen de 50-60% confluent. Sommige delen van de culturen grote flarden van cellen. Andere gebieden van de culturen hebben schaarse groei van cellen. Sommige cellen binnen de patches te nemen op een &quot;vierkant-achtig &#39;uiterlijk. Op dag 12, culturen zijn op of boven 80% confluent (ongeveer 90% confluent in de hier getoonde afbeelding). Cel in de log-fase van de groei op dit moment en tussen dagen 12-14 is de optimale tijd voor het gebruik van de gliacellen voor experimenten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om te bekijken</a>grotere versie van dit cijfer. <ol start="7"><li> Onderzoek de microgliale inhoud waarbij cellen van de extra putjes (stap 4,3) via standaard fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) kleuringsprotocol 11 met de combinatie van anti-muizen-CD45 en anti-CD 11 b muizen monoklonale antilichamen. CD45 + CD11b + cellen worden geïdentificeerd als microglia. </li></ol>

<ol><li>Gaskin, D. J., Richard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economic+costs+of+pain+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pain%22%5BJournal%5D)">The economic costs of pain in the United States.</a> J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).</li>
<li>Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+and+pain%3A+Is+chronic+pain+a+gliopathy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy?</a> Pain. 154 (01), S10-S28 (2013).</li>
<li>Ni, M., Aschner, M., et al. Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNi%2C+M+%22Curr+Protoc+Toxicol%22">Curr Protoc Toxicol</a>. Maines, M. D., et al. , (2010).</li>
<li>Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+interleukin-1beta+by+interleukin-4+in+lipopolysaccharide-treated+mixed+glial+cultures%3A+microglial-dependent+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects.</a> J Neurochem. 102 (2), 408-419 (2007).</li>
<li>Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+calcitonin+gene-related+peptide+and+CCL2+production+in+CD40-mediated+behavioral+hypersensitivity+in+a+model+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+Glia+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain.</a> Neuron Glia Biol. 7 (2-4), 117-128 (2011).</li>
<li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf+%2F+v-myc+carrying+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus.</a> J Neuroimmunol. 27 (2), 229-237 (1990).</li>
<li>Bocchini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immortalized+cell+line+expresses+properties+of+activated+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells.</a> J Neurosci Res. 31 (4), 616-621 (1992).</li>
<li>Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spontaneously+immortalized+mouse+microglial+cell+line+expressing+CD4%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4.</a> Dev Brain Res. 95 (1), 140-143 (1996).</li>
<li>Alliot, F. O., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+cell+clones+derived+from+established+cultures+of+8-day+postnatal+mouse+cerebella%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella.</a> Brain Res. 306 (1-2), 283-291 (1984).</li>
<li>Malon, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+content-dependent+inhibitory+effects+of+calcitonin+gene-related+peptide+%28CGRP%29+on+murine+retroviral+infection+of+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells.</a> J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).</li>
<li>Cao, L., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+Infiltrating+CD4%28%2B%29+T+lymphocytes+Contribute+to+Murine+Spinal+Nerve+Transection-Induced+Neuropathic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain.</a> Eur J Immunol. 38 (2), 448-458 (2008).</li>
<li>Mayer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+short-term+in+vitro+exposure+to+the+marine+toxin+domoic+acid+on+viability%2C+tumor+necrosis+factor-alpha%2C+matrix+metalloproteinase-9+and+superoxide+anion+release+by+rat+neonatal+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia.</a> BMC Pharmacol. 1, 7(2001).</li>
<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li>
<li>Rock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Role of Microglia in Central Nervous System Infections.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).</li>
<li>Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Immunity+and+Glioma+Immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology.</a> J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het is cruciaal om alle stappen-met inbegrip van de media veranderen schema-op een consistente manier om reproduceerbare resultaten tussen de experimenten te verkrijgen uit te voeren. De volgende stappen zijn bijzonder kritisch bij het verkrijgen van een uitstekende kwaliteit voor volwassenen gemengde glia. De enzymatische afbraak is een belangrijk aspect van dit protocol. Het is cruciaal dat het weefsel stukken zijn goed verteerd om een ​​enkele celsuspensie te verkrijgen. Echter, over-de s...

Chronische pijn is een ernstig gezondheidsprobleem dat ongeveer 100 miljoen volwassenen in de Verenigde Staten beïnvloedt, met een geschatte jaarlijkse kosten van maximaal $ 635.000.000.000 1. Groeiend bewijs heeft een belangrijke bijdrage op spinale gliacellen in de ontwikkeling van neuropathische pijn, een van de meest verwoestende vormen van chronische pijn 2 aangegeven. Een goede in vitro kweeksysteem aanzienlijk zou helpen hun onderzoek naar de rol van gliacellen op cellulair en moleculair niveau. Momenteel is de in vitro gliale kweeksystemen gebruikt door onderzoekers behoren hoofdzakelijk gliale cellen afkomstig van corticale weefsels van neonatale muis of rat hersenen en gliale geïmmortaliseerde cellijnen afgeleid van neonatale muis of rat primaire gliale cellen. Neonatale cellen bevatten grote aantallen van ongedifferentieerde cellen die verder kunnen worden onderverdeeld in gliacellen (voornamelijk astrocyten en microglia), waardoor eenbundant cellen voor experimentele gebruik 3. Echter, onze vorige studie aangetoond dat neonatale hersenen gliacellen significant anders reageren van volwassen ruggenmerg gliacellen van lipopolysaccharide (LPS) stimulatie. Bijvoorbeeld interleukine (IL) -4 weergegeven versterkte remmende effecten op LPS-geïnduceerde stikstofoxide (NO) in volwassen rat ruggenmerg glia vergeleken hersenschade glia 4. De profielen van chemokine productie na stimulatie door een neuropeptide, calcitonine gen gerelateerd peptide (CGRP), zijn ontegenzeggelijk verschillend tussen neonatale muizenhersenen glia (werkwijzen beschreven Ref. 5) en volwassen muis ruggenmerg glia (figuur 1). Permanente cellijnen zijn gemakkelijk te gebruiken en te onderhouden en kan een groot aantal cellen in een korte tijdsperiode. In het algemeen geïmmortaliseerde cellijnen worden gegenereerd ofwel met een virus gemedieerde immortalisatie systeem (zoals de veel gebruikte microgliale cellijn BV2) 6, 7 of na the identificatie van spontane transformatie (zoals astrocyten cellijn C8-D1A en microgliale cellijn C8-B4) 8, 9 Cellijnen zijn uitstekend in het bestuderen van de moleculaire eigenschappen van astrocyten en microglia afzonderlijk.; Echter, de resultaten van cellijnen resultaten vereisen altijd verdere validatie in primaire cellen of in vivo omstandigheden. Ook moet worden opgemerkt dat er geen melding van een gliale cellijn die is afgeleid van een knaagdier ruggenmerg glia geweest. Om te onderzoeken de rol van ruggenmerg gliale cellen bij de ontwikkeling van neuropathische pijn, een teeltsysteem dat is afgeleid van de volwassen muis ruggenmerg is ontwikkeld door aanpassing van een eerder gerapporteerde methode gebruikt om volwassen rat gemengde gliale culturen 4 genereren 5 . De muis ruggenmerg gliale cultuur werd verder verfijnd onlangs 10 en is in meer detail beschreven in dit artikel. Volwassen ruggenmerg gemengd glialculturen ceen stand worden gebracht met een muis van geselecteerde stammen die passen bij de behoeften van de specifieke studie, en cellen kunnen in kweek worden gehandhaafd tot 21 d initiatie van de kweek te plaatsen. Deze methode kan worden gebruikt in studies neuropathische pijn, evenals bij onderzoeken van verschillende neurologische ziekten die pathologische veranderingen in het ruggenmerg, zoals amyotrofe laterale sclerose (ALS), humaan immunodeficiëntie virus (HIV) geassocieerde sensorische neuropathie en multiple betrekken sclerose (MS).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&rsquo;s modificatie van Eagle&rsquo;s media (DMEM) met 4,5 g/L glucose</td><td>Lonza</td><td>12-709F</td><td>Het cDMEM-medium is een standaard, veelgebruikt kweekmedium. Individuele onderzoekers kunnen beslissen waar ze het DMEM en alle andere componenten die worden gebruikt om cDMEM-medium te maken, kunnen kopen.</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x)</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td>De L-glutamine is een standaard, veelgebruikt onderdeel voor verschillende kweekmedia. Individuele onderzoekers kunnen beslissen waar ze L-glutamine kunnen kopen.</td></tr><tr><td>Antibioticum-Antimycotisch oplossing (100x)</td><td>Corning-Mediatech</td><td>30-004-CI</td><td>Dit is een combinatie van penicilline, streptomycine en Amphotericin geformuleerd om 10.000 eenheden/mL penicilline G, 10 mg/mL streptomycinesulfaat en 25 &micro;g/mL amfotericine B te bevatten. Individuele onderzoekers kunnen beslissen waar ze de afzonderlijke componenten kunnen kopen.</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol (2-ME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>Een BioReagent, geschikt voor celcultuur, moleculaire biologie en elektroforese.</td></tr><tr><td>Papaïne dissociatiesysteem</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>De individuele componenten van dit kit kunnen afzonderlijk worden gekocht.&nbsp;</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Health Care</td><td>17-0891-01</td><td>Percoll wordt verkocht als steriele oplossing. Onverdunde Percoll kan indien nodig opnieuw worden geautoclaveerd.</td></tr><tr><td>Lab-line incubator/schudder&nbsp;</td><td>Barstead/Lab-line</td><td>MaxQ4000&nbsp;</td><td>Dit is de incubator/schudder die we momenteel hebben. Andere soorten schudders kunnen in plaats daarvan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Lipopolysacchariden, Salmonella Minnesota Re595</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-9764</td><td>Andere stammen van LPS kunnen ook gliale reacties induceren. De omvang van de reacties kan echter variëren.</td></tr><tr><td>Mouse IL-6 DuoSet ELISA&nbsp;</td><td>R&amp;D Systems</td><td>DY406</td><td>Elke individuele onderzoeker kan de ELISA-kit kiezen die hij of zij het liefst gebruikt.</td></tr><tr><td>Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA</td><td>R&amp;D Systems</td><td>DY410</td><td>Elke individuele onderzoeker kan de ELISA-kit kiezen die hij of zij het liefst gebruikt.</td></tr><tr><td>Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA</td><td>R&amp;D Systems</td><td>DY466</td><td>Elke individuele onderzoeker kan de ELISA-kit kiezen die hij of zij het liefst gebruikt.</td></tr><tr><td>Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set</td><td>BD Biosciences</td><td>555260</td><td>Elke individuele onderzoeker kan de ELISA-kit kiezen die hij of zij het liefst gebruikt.</td></tr><tr><td>Mouse chemokine Q-Plex</td><td>Quansys Biosciences</td><td>120251MS</td><td>Dit product was op het moment niet beschikbaar voor in-house analyse. In plaats daarvan hebben we monsters naar de fabrikant gestuurd voor analyse.</td></tr><tr><td>APC-anti-muis-CD45 (kloon 30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>17-0451</td><td>Antilichaam van dezelfde kloon maar van andere leveranciers kan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>FITC-anti-muis-CD11b (kloon M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>11-0112</td><td>Antilichaam van dezelfde kloon maar van andere leveranciers kan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Accuri C6 flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD Accuri C6&nbsp;</td><td>Elke individuele onderzoeker kan elke flow cytometer gebruiken die hij of zij het liefst gebruikt.</td></tr><tr><td>FlowJo software</td><td>Tree Star, Inc.</td><td>FlowJo7.6.5</td><td>Elke individuele onderzoeker kan elke analysesoftware gebruiken die hij of zij het liefst gebruikt.</td></tr></tbody></table>

voorbereiding van de primaire mixed glialculturen van volwassen muis spinal cord tissue

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Het is goed aanvaard dat ruggenmerg gliale respons aanzienlijk bijdragen tot de ontwikkeling van neuropathische pijn. Enorme informatie betreffende gliale activiteiten op cellulair en moleculair niveau is verkregen door middel van in vitro celkweek systemen. De in vitro-systemen gebruikt, die voornamelijk bestaan uit primaire glia afgeleid van neonatale hersenen corticale weefsel en onsterfelijk cellijnen. Echter kunnen deze systemen niet de kenmerken van ruggenmerg gliale cellen in vivo. Om de rol van ruggenmerg gliacellen in de ontwikkeling van perifere zenuw-verwonding geïnduceerde neuropathische pijn verder te onderzoeken met behulp van een kweeksysteem dat beter de in vivo toestand, heeft ons laboratorium een methode primaire ruggenmerg gemengde gliale culturen van ontwikkelde volwassen muizen. In het kort worden ruggenmerg van volwassen muizen verzameld en verwerkt door middel van papaïne digestie gevolgd door myeline verwijderen met een holenity-gradiënt medium. Enkele cel suspensies worden gekweekt in compleet Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle medium (cDMEM) aangevuld met 2-mercaptoethanol (2-ME) en 35,9 oC Deze kweekomstandigheden werden specifiek geoptimaliseerd voor de groei van gemengde gliale cellen. Onder deze omstandigheden zijn de cellen klaar voor gebruik voor experimenten tussen 12 - 14 d (cellen meestal logfase gedurende deze tijd) na de oprichting van de kweek (D 0) en kunnen in kweekcondities gehouden tot D 21. het kweeksysteem kan worden gebruikt om de reacties van ruggenmerg gliacellen na stimulatie met diverse stoffen en agentia te onderzoeken. Naast neuropathische pijn, kan dit systeem worden gebruikt om gliale reacties in andere ziekten die pathologische veranderingen op spinale gliacellen omvatten bestuderen.

Deze methode kan worden gebruikt om gemengde gliale cellen te bereiden uit zowel muizen als ratten. De gemiddelde totale aantal cellen per putje in een 12-well plaat op D 12 na initiatie van de kweek moet betrekkelijk stabiel zijn, ongeveer 100.000 cellen per putje wanneer cellen afkomstig uit muizen ruggenmerg. Gliale cellen verkregen uit deze werkwijze kan worden gebruikt in experimenten die zijn ontworpen om volwassen ruggenmerg gliale responsen na toediening van stoffen en agentia va...

De ontwikkeling van neuropatische pijn omvat pathologische veranderingen van het ruggenmerg gliacellen. Een betrouwbare gliale kweeksysteem afgeleid van volwassen ruggenmerg weefsel en is ontworpen voor het bestuderen van deze cellen in vitro ontbreekt. Daarom zien we hier hoe je primaire gemengde gliale culturen van volwassen muis ruggenmerg weefsel vast te stellen.

Voorbereiding van de primaire Mixed glialculturen van volwassen muis Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Het algemene doel van dit protocol is het vestigen van primaire gemengde gliale culturen uit ruggenmergen van volwassen muizen voor in vitro studies. Deze methode biedt ons een in vitro systeem om de rol van gliale cellen te onderzoeken bij neurologische ziekten die gepaard gaan met pathologische veranderingen in het ruggenmerg, zoals neuropathische pijn en multiple sclerose. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de gliale culturen worden voorbereid uit het ruggenmerg van volwassen muizen, waardoor een systeem ontstaat dat de in vivo condities nauwkeuriger weerspiegelt.Jennifer Malon, een technicus uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Breng in een weefselkweekkap vier ruggenmergen van muizen over naar een petrischaal met HBSS. Gebruik steriele scharen en pincetten om elk van de ruggenmergen in kleine stukjes te snijden.Breng vervolgens de stukjes over naar een conische buis van 50 millimeter die Papain DNAse-enzymmengsel bevat. Vermijd het overbrengen van HBSS naar het enzymmengsel, aangezien dit kan leiden tot een verminderde werking van het enzym. Het is cruciaal dat de weefselstukjes volledig worden verteerd om een enkelcellige suspensie te verkrij

preparation-primary-mixed-glial-cultures-from-adult-mouse-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft de afleiding van gliale Beperkte Voorlopers uit foetaal ruggenmerg en onderhouden in vitro hetzij voor transplantatie of voor de studie van oligodendrocytic afstamming.

Afleiding van gliale Beperkte Voorlopers van de E13 muizen

Het isoleren van primaire microglia van de cellulaire heterogeniteit van de hersenen is essentieel om hun rol te onderzoeken in zowel fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit protocol beschrijft een mechanische isolatie en gemengde celkweek techniek die hoge opbrengst en een hoge zuiverheid, levensvatbare primaire microgliale cellen...

Primaire Microglia Isolatie van Mixed gliale celculturen van neonatale rat hersenweefsel

This video demonstrates a detailed protocol for isolating the lateral ventricle walls from the adult mouse brain and performing enzymatic tissue dissociation to obtain single cells. These cells are then subjected to specific culture conditions that selectively enhance the proliferation of neural stem cells and promote their differentiation into co-cultures of oligodendrocytes and astrocytes.

Obtaining a Mixed Oligodendrocyte and Astrocyte Culture From Adult Mouse Neural Stem Cells

The video demonstrated the method of isolating and culturing cells from a neonatal mouse brain. It involved enzymatic and mechanical dissociation of the brain, followed by culturing in growth media lacking neuronal growth factor to obtain a mixed glial population.

Obtaining a Mixed Glial Cell Culture from a Neonatal Mouse Brain

This video demonstrates a technique for isolating and culturing primary mixed glial cells from adult mouse spinal cord tissue. The protocol involves enzymatic digestion of the tissue, followed by the removal of broken cell membranes and myelin debris to obtain a single-cell population. The cells are then cultured in media optimized for mixed glial cell growth.

Establishing Primary Mixed Glial Cell Cultures from a Mouse Spinal Cord

Schetsen we methoden voor de efficiënte en snelle isolatie / cultuur van levensvatbare microglia uit de neonatale cerebrale cortex en volwassen ruggenmerg. De dissectie en beplating van corticale microglia kan worden bereikt binnen 90 minuten, met de daaropvolgende microglia oogst plaatsvindt ~ 10 dagen na de eerste dissectie.

Kweken Microglia van de neonatale en volwassen centrale zenuwstelsel

Hier presenteren we een protocol voor in vitro isolatie van meerdere gliacelpopulaties van een muis CNS. Deze methode maakt de segregatie van regionale microglia, oligodendrocytenvoorlopercellen en astrocyten mogelijk om de fenotypen van elk in verschillende cultuursystemen te bestuderen.

Dissectie en isolatie van Murine Glia uit meerdere regio's van het centrale zenuwstelsel

Van vet afgeleide mesenchymale stromale cellen (AdMSC's) hebben krachtige immunomodulerende eigenschappen die nuttig zijn voor de behandeling van ziekten die verband houden met ontstekingen. We demonstreren hoe AdMSC's van muizen en primaire gemengde glia kunnen worden geïsoleerd en gekweekt, AdMSC's kunnen worden gestimuleerd om ontstekingsremmende genen en groeifactoren te reguleren, migratie van AdMSC's kunnen worden beoordeeld en AdMSC's kunnen worden gekweekt met primaire gemengde...

Van vet afgeleide mesenchymale stromale cellen in co-cultuur met primaire gemengde glia om door prionen geïnduceerde ontsteking te verminderen

Dit protocol schetst de isolatie van gezuiverde astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen, waardoor latere toepassingen zoals RNA-analyse en celkweek worden vergemakkelijkt. Het bevat gedetailleerde methoden en procedures voor celdissociatie die zijn ontworpen om zowel de kwaliteit als de opbrengst van geïsoleerde cellen te verbeteren.

Isolatie van pure astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen voor in-vitrotests en transcriptomische onderzoeken

Dit protocol beschrijft een microglia-neuronale co-cultuur die is opgezet uit primaire neuronale cellen geïsoleerd uit muizenembryo's op embryonale dagen 15-16 en primaire microglia gegenereerd uit de hersenen van neonatale muizen op postnatale dagen 1-2.

Genereren en co-cultureren van primaire microglia en corticale neuronen van muizen

Leer primaire gemengde gliacultuur opzetten uit volwassen muizenruggenmerg voor onderzoek naar neuropathische pijn en neurologische ziekten. Deze methode biedt een betrouwbaar in vitro systeem.

Voorbereiding van de primaire Mixed glialculturen van volwassen muis Spinal Cord Tissue

Meer video's verkennen