Een methode voor het extraheren Pigmenten van Squid Doryteuthis pealeii

Het algemene doel van deze procedure is om te beschrijven hoe pigmenten die zich in de nano-gestructureerde korrels van vers gedissekteerde pijlinktvissen, Doryteuthis pealeii chromatoforen, bevinden, kunnen worden geëxtraheerd. Koppotigen zijn complexe zeedieren die snelle en adaptieve veranderingen in hun huidskleur ondergaan. en adaptieve veranderingen in hun huidskleur.

Er is echter nog veel onbekend over hoe deze systemen werken. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze specifiek gericht is op de nano-gestructureerde korrels in het chromatofoororgaan. Dit zal onderzoekers in staat stellen om het mechanisme voor kleurverandering dat op de nanoschaal ontstaat, te verduidelijken.

Naast inzicht in de biologie van koppotigen, kan het de ontwerp van synthetische systemen informeren die zijn gebouwd om het dynamische bereik van adaptieve kleur die in koppotigen wordt weergegeven, na te bootsen met voorverpakte gepigmenteerde nanodeeltjes. Over het algemeen worstelen personen die nieuw zijn met deze methode omdat het verzamelen van puur chromatofoorweefsel moeilijk is vanwege de nabijheid met het omringende weefsel. Onze methode is geoptimaliseerd om deze verontreinigingen te verminderen.

Om de dissectie te beginnen, giet eerst ongeveer 250 milliliter gefilterd zeewater in een dissectiepan. Plaats een exemplaar in de pan en snijd met rechte, fijne puntenroestvrijstalen scharen vanaf de basis van de ventrale mantel langs de achterste kant van het dier, eindigend bij de vinnen. Verwijder alle interne organen door ze voorzichtig op te tillen met dissectiestangen en het bindweefsel door te snijden met de scharen.

Gooi de organen in een monsterstuk. Gebruik dissectiespelden om de mantel met de vinnen naar boven in de dissectiepad te spelden. Verwijder met behulp van tang voorzichtig de ondoorzichtige epidermale huidlaag, waarbij de chromatofoorbevattende huidlaag intact blijft.

Gooi de epidermale laag in een monsterstuk. Verwijder vervolgens de chromatofoorlaag. Snijd het chromatofoorweefsel in kleine secties van één centimeter bij één centimeter.

Plaats de secties in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en vul elke buis voor de helft met gedissecteerd weefsel. Voeg vervolgens 500 microliter gefilterd zeewater toe aan de buizen. Om de pigmentkorrels te isoleren, centrifugeert u de chromatofoorweefselsecties eerst vijf minuten bij 14.000 x g.

Gooi de bovenste laag zeewater weg. Voeg 500 microliter papaïne-collageenase-oplossing toe aan de monsters en klop gedurende één tot twee minuten op de hoogste instelling. Soniceer vervolgens de monsters gedurende vijf minuten bij 40 kHz om cellen van het omringende weefsel te scheiden.

Centrifugeer vervolgens nog eens vijf minuten bij 14.000 x g en gooi vervolgens het supernatant weg. Herhaal de centrifugatie nog twee keer en gooi elke keer het supernatant weg. Voeg vervolgens de resuspendering in collageenase toe.

Gebruik tang om handmatig eventuele resterende grote weefselsecties te verwijderen die niet zijn verteerd voordat u verdergaat. De zuiverheid van de startgranulatoplossing beïnvloedt de pigmentextractie. Het is dus belangrijk om ervoor te zorgen dat de startchromatofoormaterialen volledig zijn verteerd.

We vinden dat weefselsecties van ongeveer één centimeter optimaal zijn voor het verzamelen van de zuiverste populatie korrels. Bereid de homogenisatiebuffer voor door een schroefdopbuis van 150 milliliter te nemen en de juiste hoeveelheid HEPES, magnesiumchloride, kaliumaspartaat en dithiothreitol toe te voegen. Voeg een commerciële minitablet proteaseremmer toe.

Gebruik een gradueercilinder om 100 ml gedeïoniseerd water te meten en voeg het toe aan de buis met de homogenisatiezouten. Klop de buis om te mengen totdat de oplossing helder wordt. Centrifugeer de weefselmonsters en gooi vervolgens het supernatant weg.

Voeg 500 microliter homogenisatiebuffer toe aan elke buis en klop gedurende 2 minuten om grondig te mengen. Soniceer de monsters gedurende 30 minuten bij 40 kHz. En centrifugeer ze vervolgens opnieuw.

Na het weggooien van het supernatant, herhaal de homogenisatie, sonicatie en centrifugatie twee tot drie keer om een volledige vertering van het extracellulaire weefsel te garanderen. Ten slotte zou de buis een lichtgele supernatant en een rood gekleurde pellet moeten bevatten die bestaat uit de geïsoleerde pigmentkorrels. Gooi het supernatant weg.

Bereid eerst zuur methanol voor extractie in een glazen monsterbuis met schroefdop door 5 ml methanol en 25 mcL geconcentreerd zoutzuur toe te voegen. Draai voorzichtig om de oplossing te mengen. Zet een monsterbuis opzij, dit zal de behandeling van de uiteindelijke granulaatreactie zijn.

Verwijder het homogenisatiebuffer van een tweede buis met korrels. Voeg 500 mcL van de zure methanoloplossing toe aan de overige buizen en klop gedurende drie tot vier minuten. Soniceer de monsters gedurende 10 minuten bij 40 kHz en centrifugeer vervolgens gedurende vijf minuten bij 14.000 x g.

Gebruik een micropipet om het supernatant in een glazen schroefdopbuis van één dram te verzamelen. Dit is het pigment en het zou donkerrood van kleur moeten zijn. Herhaal de toevoeging van zuur methanol, sonicatie en centrifugatie vier tot vijf keer en verzamel het supernatant totdat er geen kleur meer wordt geëxtraheerd.

De resterende kleurloze pellet is de geëxtraheerde pigmentkorrels. Om granulaatmonsters voor beeldvorming voor te bereiden, centrifugeert u eerst zowel de niet-gereageerde granulaat-aliquot als de geëxtraheerde pigmentkorrels gedurende vijf minuten bij 14.000 x g, gooit het supernatant weg en resuspendeert u vervolgens elk pellet in 1 ml 95% ethanol. Gebruik een transferpipet om 2-3 druppels van elke granulaatsuspensie op een apart aluminium SEM-stub te plaatsen.

Plaats de monsters in een droogkast om 's nachts onder vacuüm te drogen. Spuit de stubs 3 minuten lang met goud-platinacoating om een coating van 15 nanometer te bereiken. Beeld de monsters af met behulp van een rasterelektronenmicrosco