Name: Een methode voor het extraheren Pigmenten van Squid Doryteuthis pealeii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Leer een methode voor het extraheren van pigmenten uit chromatoforen van de inktvis Doryteuthis pealeii. Dit protocol helpt onderzoekers de nanoschaalmechanismen van kleurverandering in cephalopoden te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken de faciliteiten van de University of New Hampshire met inbegrip van het University Instrumentation Center. Dit werk werd ondersteund door de University of New Hampshire, Department of Chemistry.

Ongewervelde dieren studies hierin uitgevoerd worden niet geregeld in de Verenigde Staten; dus de Institutional Animal Care en gebruik Comite heeft geen bevoegdheid tot herziening van dergelijke protocollen. In plaats van deze die niet onder de jurisdictie van de regelgeving in de Verenigde Staten, de auteurs verklaar dat deze studies werden uitgevoerd met een oprechte poging in de richting van het ethisch gebruik, zorg en behandeling van deze dieren, het aantal personen dat werd geminimaliseerd en deze inspanningen zijn in overeenstemming met de Basel verklaring en de Internationale Raad voor Proefdierkunde (ICLAS) ethische richtlijnen. 1. Doryteuthis pealeii (D. pealeii) Dissection <ol><li> Aankoop onthoofd inktvis D. pealeii van de afdeling Marine Resources in het Marine Biological Laboratory in Woods Hole, MA of van een verse vismarkt. Niet specimens die zijn filets of eerder gewijzigd om deze procedure te gebruiken. Met name de chromatophore laag moet nog intact op het monster zijn. <ol><li> Wanneer de dieren niet direct worden gebruikt, bewaar ze bij -20 ° C tot gebruik. Om de monsters te ontdooien, plaats ze in water op kamertemperatuur gedurende 1 uur voorafgaand aan de dissectie. </li></ol></li><li> Gebruikt roestvrij stalen rechte puntig dissectie scharen, langs de postérieure zijde van het dier te snijden. Begint bij de basis van de ventrale mantel en sluit op de vin gebied. </li><li> Verwijder alle van de interne organen (maag, kieuw, inkt klier, voortplantingsorganen, systemische hart en arm hart) door ze te tillen met ontleden pincet en het afsnijden van hun bindweefsel met behulp van dissectie schaar. Gooi organen in een specimen zak. </li><li> Gebruik ontleden T-pinnen om de mantel pin (fin zijde naar boven) in een standaard 11-1 / 2 &quot;x 7-1 / 2&quot; x 1-1 / 2 &quot;aluminium dissectie pan met een flexibele dissectie pad. Dompel het weefsel in 250 ml van zeewater die door middel van een eenmalige polystyreen vacuümfiltratie systeem is gefilterdmet 0,2 urn poriën. </li><li> Verwijder voorzichtig de epidermale huidlaag (ondoorzichtige kleur) met ontleden tang, het bijhouden van de chromatophore bevattende huidlaag intact. Zodra de epidermale laag wordt verwijderd, gooi het in een monster zak. </li><li> Ontleden kleine (1 cm x 1 cm) delen van de chromatophore laag met een tang en dissectie schaar. Verzamel monsters in 1,5 ml micro-centrifugebuis (vul helft van elke holle buis met de ontleed weefsel). </li><li> Voeg 500 gl gefiltreerd zeewater aan het weefsel bevattende buizen. De monsters kunnen &#39;s nachts worden opgeslagen bij 4 ° C. </li></ol> 2. Isoleren Chromat pigmentkorrels <ol><li> tissue Spijsvertering <ol><li> Bereiding van Papaïne / collagenase <ol><li> Weeg 30 mg collagenase en 5 mg papaïne met een 4 &quot;x 4&quot; low stikstof wegen papier. Transfer deze in een 50 ml polypropyleen centrifugebuis met een schroefdop. </li><li> Meet 10 ml deionized water met behulp van een gegradueerde pipet. Voeg direct naar flacon met papaïne / collagenase. Vortex hoogste stand totdat de oplossing helder is. </li></ol></li><li> Het verwijderen van extracellulaire Tissue <ol><li> Centrifugeer de verzamelde chromatophore weefsel van stap 1,7 gedurende 5 minuten bij 14.000 x g. Gooi de bovenste laag van het zeewater in een plastic afval emmer. </li><li> Voeg 500 ul van de papaïne / collagenase-oplossing aan het weefsel via een P1000 variabel volume eenkanaals micropipet. Vortex elk monster gedurende 1-2 minuten op de hoogste stand. </li><li> Sonificeer de monsters gedurende 5 minuten bij een frequentie van 40 kHz tot cellen dissociëren uit het omringende weefsel. </li><li> Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 14.000 x g. Verwijder het supernatant in een plastic afval emmer. </li><li> Centrifugeer de verzamelde chromatophore weefsel gedurende 5 minuten bij 14.000 x g. Gooi de bovenste laag van het zeewater in een plastic afval emmer. Herhaal dit nogmaals. </li><li> Handmatig verwijderen van alle resterende grote weefsel secgen die niet verteren in dit proces met een tang voordat u verder gaat met de volgende stap. </li></ol></li></ol></li><li> Isoleren van de pigmentkorrels <ol><li> Bereiding van homogenisatiebuffer <ol><li> Weeg 2,38 g (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur) (HEPES, 100 mM), 0,095 g magnesiumchloride (10 mM), 0,856 g kalium-aspartaat (50 mM) en 0,015 g dithiotreïtol (1 mM). Over in een 150 ml polystyreen container met een schroefdop. Voeg een commerciële mini tablet proteaseremmer. </li><li> Meet 100 ml gedemineraliseerd water met een maatcilinder. Voeg direct bij de container met de homogenisering zouten. Vortex totdat de oplossing helder is. </li></ol></li><li> Homogenisering van pigmentkorrels <ol><li> Centrifugeren elk monster uit stap 2.1 bij 14.000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant in een plastic afval emmer. Dit monster moet leegte van extracellulaire weefsel. </li><li> Voeg 500 &amp;# 181; l van homogenisering buffer aan elke buis en vortex voor 1-2 minuten elk om grondig te mengen van de monsters. Sonificeer de monsters gedurende 30 min (~ 40 kHz) en volgen 5 min centrifugeren bij 14.000 x g. </li><li> Verwijder het supernatant in een plastic emmer, en herhaal de vorige stap 2-3 keer naar de volledige vertering van de chromatophore sacculus en eiwitten tethers waarborgen. De overgebleven oplossing een lichtgele bovenstaande vloeistof en een roodgekleurde pellet met de geïsoleerde pigmentkorrels bevatten. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Pigment Extraction <ol><li> Bereiding van Zure Methanol (HCl-MeOH) <ol><li> Voeg voorzichtig 25 pl geconcentreerde (36,5-38% (w / w)) zoutzuur (HCl) tot 5 ml methanol (MeOH). Bewaar de HCl-MeOH oplossing in een schroefdop glazen monsterflesje. Roer voorzichtig gelijkmatig de oplossing te mengen. OPMERKING: De zuurder de oplossing, hoe meer pigment in de fi extrahereneerste extractie. </li></ol></li><li> Extractie van Pigment <ol><li> Centrifugeer het pigment korrel suspensie (vanaf 2.2.2) gedurende 5 min bij 14.000 xg Verwijder de bovenstaande vloeistof in een plastic afval emmer. </li><li> Voeg 500 ul van het HCl-MeOH-oplossing en vortex elk monster gedurende ~ 3-4 min. Sonificeer de monsters gedurende 10 min (~ 40 kHz), centrifugeer 5 min bij 14.000 x g. </li><li> Met behulp van een overdracht pipet, het verzamelen van de bovenstaande vloeistof in een 1 dram schroef-top glazen flacon. De supernatant dient donkerrood van kleur zijn. </li><li> Herhaal de extractie stap 3.2.2 tot er geen kleur wordt onttrokken (~ 4-5 wasbeurten). OPMERKING: Elke extractie zal opleveren ~ 1,5 ml pigment. Het resterende kleurloze pellet is het pigment geëxtraheerde granules. OPMERKING: De kleurloze korrels en geëxtraheerd pigmenten kunnen worden bewaard in water bij 4 ° C tot verder gebruik. </li></ol></li></ol> 4. Karakterisering hele Extraction Process <ol><li> scanning Electron Microscopie <ol><li> Beeld de granules (ongereageerd uit stap 2.2.1 en pigment gewonnen uit stap 3.2.3) met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM) om de zuiverheid van het extractieproces te controleren. </li><li> Om korrel monsters voor te bereiden voor de beeldvorming, de eerste centrifuge zowel niet gereageerde korrels en pigment gewonnen granulaten voor 5 min bij 14.000 xg, en gooi de bovenstaande vloeistof in een plastic afval emmer. Resuspendeer deze in 1 ml ethanol en borg 2-3 druppels van de suspensie granule op aluminium SEM stubs met een transferpipet. </li><li> Na drogen van de monsters overnacht sputter coater met goud-platina coating gedurende 3 minuten een 15 nm coating te bereiken. </li><li> Afbeelding met behulp van een SEM met een Schottky emitter en een secundaire elektronen detector. Gebruik een 5-7 kV bundel spanning en een werkafstand tussen 8 en 9 mm op de foto om deze materialen. </li></ol></li><li> Ultraviolet-zichtbare (UV-vis) Fotometrische metingen <ol><li> Bewaken van de absorptie probestanden voor alle 3 voorwaarden (niet-omgezette korrel van 2.2.2, gewonnen pigment uit 3.2.3 en pigment gewonnen granulaat uit 3.2.4) met een dual beam spectrofotometer 200-800 nm. </li><li> Verzamel een blanco meting met gedeïoniseerd water in een 1 ml cuvette het ongereageerde granules en granules pigment geëxtraheerd. Verzamel UV-Vis absorptiespectra voor beide monsters. </li><li> Verzamel een blanco meting met de zure methanoloplossing in een 1 ml cuvette de opgezogen pigment. Verzamel UV-Vis absorptie spectrum voor monster. </li><li> Bepalen maximum golflengte van elk monster door het identificeren van de golflengte waarbij de absorptie piek van de maximale relatieve hoogte bereikt. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bell, G. R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatophore+radial+muscle+fibers+anchor+in+flexible+squid+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebr+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin.</a> Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).</li>
<li>Crookes, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflectins%3A+The+unusual+proteins+of+squid+reflective+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues.</a> Science. 303 (5655), 235-238 (2004).</li>
<li>Deravi, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure-function+relationships+of+a+natural+nanoscale+photonic+device+in+cuttlefish+chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).</li>
<li>Mäthger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+behavioural+functions+of+structural+coloration+in+cephalopods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods.</a> J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).</li>
<li>Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+basis+for+camouflaged+polarized+light+communication+in+squid%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Anatomical basis for camouflaged polarized light communication in squid.</a> Biol. Lett. 2 (4), 494-496 (2006).</li>
<li>Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malleable+skin+coloration+in+cephalopods%3A+selective+reflectance%2C+transmission+and+absorbance+of+light+by+chromatophores+and+iridophores%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Malleable skin coloration in cephalopods: selective reflectance, transmission and absorbance of light by chromatophores and iridophores.</a> Cell Tissue Res. 329 (1), 179-186 (2007).</li>
<li>Cloney, R. A., Brocco, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatophore+Organs%2C+Reflector+Cells%2C+Iridocytes+and+Leucophores+in+Cephalopods%5BTitle%5D)+AND+%22Amer.+Zool%22%5BJournal%5D)">Chromatophore Organs, Reflector Cells, Iridocytes and Leucophores in Cephalopods.</a> Amer. Zool. 23 (3), 581-592 (1983).</li>
<li>Hanlon, R. T., Messenger, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+coloration+in+young+cutttlefish+%28Sepia+officinalis+L%29-+The+morphology+and+development+of+body+patterns+and+their+relation+to+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Adaptive coloration in young cutttlefish (Sepia officinalis L)- The morphology and development of body patterns and their relation to behaviour.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 320 (1200), 437-487 (1988).</li>
<li>Sutherland, R. L., Mäthger, L. M., Hanlon, R. T., Urbas, A. M., Stone, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cephalopod+coloration+model.+II.+Multiple+layer+skin+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Cephalopod coloration model. II. Multiple layer skin effects.</a> J. Opt. Soc. Am. 25 (8), 2044-2054 (2008).</li>
<li>Florey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+function+of+cephalopod+chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22Amer.+Zool%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and function of cephalopod chromatophores.</a> Amer. Zool. 9 (2), 429-442 (1969).</li>
<li>Florey, E., Kriebel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+and+mechanical+responses+of+chromatophore+muscle+fibers+of+squid%2C+Loligo+opalescens%2C+to+nerve+stimulation+and+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Vergl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs.</a> Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).</li>
<li>Williams, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+Phenoxazone-Based+Pigments+to+the+Structure+and+Function+of+Nanostructured+Granules+in+Squid+Chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores.</a> Langmuir. , (2016).</li>
<li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ommochrome+pigmentation+of+the+linea+and+rosa+seasonal+forms+of+Precis+coenia+%28Lepidoptera%3A+Nymphalidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae).</a> Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).</li>
<li>Van Den Branden, C., Decleir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Study+of+the+Chromatophore+Pigments+in+the+Skin+of+the+Cephalopod+Sepia+Officinalis%5BTitle%5D)+AND+%22L.+Biol.+Jb.+Dodonaea%22%5BJournal%5D)">A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis.</a> L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).</li>
<li>Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Jumbo+Squid+Skin+Pigment+Extract+and+its+Antioxidant+Potential+ina+Marine+Oil+System%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Lipid+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System.</a> Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118 (0), (2016).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

We hebben een methode om pigmenten pijlinktvis chromatophore granules extract aangetoond. Door specifiek te richten op de korrels, ons doel is om hun rol in het bemiddelen van adaptieve kleur te bepalen. Deze methode verschilt van eerdere rapporten ontworpen om cephalopod pigmenten te karakteriseren met behulp van bulk weefselmonsters 14 of gevriesdroogd huid 15. Hoewel dit protocol is effectief bij het extraheren chromatophore pigmenten wordt beperkt tot kleine reactie...

Koppotigen zoals inktvis, inktvis en octopus hebben de mogelijkheid om hun uiterlijk te camoufleren en signalering dynamisch veranderen. 1-6 Deze mogelijkheid wordt mede ondersteund door de selectieve areal uitbreiding van gepigmenteerde organen bekend als chromatoforen. 4,7-9 chromatoforen zijn zachte actuatoren die een netwerk van nanogestructureerde pigmentkorrels voordoen binnen cytoelastic sacculus radiaal is verankerd door spiervezels bevatten. 1,3 Daar ze bediend, chromatoforen breiden met 500% in gepresenteerd oppervlak verspreiden van de granules gedurende het orgel. 3,7 , 10,11 Wanneer deze actie onderling over een aantal chromatoforen de totale kleur van het dier wordt gewijzigd. Hoewel bekend is dat de pigmentkorrels bijdragen kleurverandering, de samenstelling is onbekend. We beschrijven een werkwijze voor het isoleren en zuiveren chromatophore pigmenten die kunnen worden aangepast voor toekomstig compositiestudies. 3,12 Chromat die weefsel wordt geoogst door zorgvuldige uitroeiing van de inktvis. Een digestie en homogeniseren wordt vervolgens gebruikt om het omringende weefsel dissociëren en scheiden de chromatophore cellen. De nanostructuur korrels zijn vervolgens geïsoleerd en gezuiverd uit de resterende chromatoforen met behulp van herhaalde sonicatie en centrifugeren. Na zuivering, worden pigmenten gewonnen uit de korrels in een proces dat geschikt is bij de winning van zichtbare kleur van vlindervleugels middels zure methanoloplossingen. 13 Scanning elektronenmicroscopie (SEM) en spectrofotometrie worden gebruikt om te bevestigen dat de chromatophore pigmenten met succes worden geëxtraheerd door gebruik dit proces. Deze werkwijze beschrijft de isolatie van chromatophore granules die wordt gebruikt om de moleculaire bijdragen c staandoloration in koppotigen. 12 kleine molecule extracties van gehele dieren kan vaak een lang en moeizaam proces zijn. Het doel is om toekomstige onderzoekers van een effectieve en gemakkelijke protocol te informeren voor de verwerving van pigmenten uit de nanostructuur korrels in koppotigen.

<table><tbody><tr><td>Collagenase</td><td>Alfa Aesar</td><td>9001-12-1</td><td>Geen gevaar</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3482-12-3</td><td>Irritatie, acute toxiciteit</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td>Milde irritatie</td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>EMD Chemicals</td><td>7647-01-0</td><td>Corrosie</td></tr><tr><td>k-Aspartaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1115-63-5</td><td>Reageert hevig met oxidanten</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td>Milde oogirritatie</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>67-56-1</td><td>Zeer ontvlambaar</td></tr><tr><td>Mini tablet protease remmer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>469315-90-01</td><td>Corrosie voor metaal en huid</td></tr><tr><td>Papaïne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-73-4</td><td>Irritatie&nbsp;</td></tr></tbody></table>

een methode voor het extraheren pigmenten van squid<em&gt; doryteuthis pealeii</em

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

Cephalopoden kunnen snelle en adaptieve veranderingen in huidkleuring ondergaan voor doeleinden zoals waarneming, communicatie, verdediging en voortplanting. Deze vermogens worden gedeeltelijk ondersteund door de uitbreiding en inkrimping van pigmentorganen, bekend als chromatoforen. Hoewel bekend is dat de chromatoforen een verankerd netwerk van gepigmenteerde korrels bevatten, zijn hun structuur-functie-eigenschappen niet volledig beschreven. We beschrijven een methode voor het isoleren van de nanogestructureerde korrels in de chromatoforen van de inktvis Doryteuthis pealeii en laten zien hoe hun bijbehorende pigmenten kunnen worden geëxtraheerd in zure oplosmiddelen. Om dit te bereiken, wordt de chromatofoor bevattende huidlaag eerst handmatig geïsoleerd met behulp van een oppervlakkige dissectie, en worden de pigmentkorrels verwijderd door middel van sonicatie, centrifugatie en wascycli. Pigmenten die zich in de gezuiverde korrels bevinden, worden vervolgens geëxtraheerd via zure methanoloplossingen, waardoor nanostructuren met kleinere diameters overblijven die vrij zijn van zichtbare kleur. Deze extractieprocedure levert een opbrengst van 58% op van oplosbare pigmenten geïsoleerd uit korrels. Door deze methode te gebruiken, kan de samenstelling van de chromatofoorpigmenten worden bepaald en worden gebruikt om inzicht te geven in het mechanisme van adaptieve kleuring bij cephalopoden.

Chromatoforen worden ontleed uit de D. pealeii dorsale mantel (Figuur 1A, 1B). Zodra ze verwijderd worden chromatoforen gelyseerd en gezuiverd middels centrifugatie en wascycli te isoleren uit de gepigmenteerde granules (figuren 2A, 2B). Zure methanol oplossing (HCl-MeOH) worden gebruikt om het pigment van de korrels (figuur 2C) extract, waardoor een oplosbaar pigment extract en onoplosbare, kle...

Een protocol voor de extractie van de pigmenten uit de nanostructuur korrels in squid Doryteuthis pealeii chromatoforen wordt gepresenteerd.

Een methode voor het extraheren Pigmenten van Squid<em&gt; Doryteuthis pealeii</em

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities ...

Het algemene doel van deze procedure is het beschrijven van de extractie van pigmenten die zich bevinden in de nanogestructureerde granules van chromatoforen van vers gedissekeerde inktvissen, Doryteuthis pealeii. Cefalopoden zijn complexe zeedieren die snelle en adaptieve veranderingen in hun dermale kleur ondergaan.Er is echter nog steeds veel onbekend over de werking van deze systemen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het specifiek gericht is op de nanogestructureerde granules in het chromatofoororgaan. Dit zal onderzoekers in staat stellen om het mechanisme voor kleurverandering dat op nanoschaal ontstaat, te ontrafelen.Naast inzicht in de biologie van cephalopoden kan dit informatie bieden voor het ontwerp van synthetische systemen die zijn gebouwd om het dynamische bereik van adaptieve kleurverandering in cephalopoden na te bootsen met behulp van vooraf verpakte gepigmenteerde nanodeeltjes. Over het algemeen hebben personen die nieuw zijn met deze methode moeite omdat het verzamelen van puur chromatofoorweefsel lastig is vanwege de nabijheid van het omliggende weefsel. Onze methode is geoptimaliseerd om deze verontreinigingen te verminderen.Om met de dissectie te beginnen, giet eerst ongeveer 250 milliliters gefilterd zeewater in een dissectieschaal. Plaats een exemplaar in de schaal en knip met roestvrijstalen rechte fijne scharen vanaf de basis van de ventrale mantel langs de posterieure zijde van het dier, eindigend bij de vinnregio. Verwijder alle interne organen door ze voorzichtig met dissectiepincetten op te tillen en het bindweefsel met de schaar door te knippen.Gooi de organen weg in een monsterzak. Speld de mantel met de vinzijde naar boven in het dissectieblok met behulp van dissectie-T-spelden. Verwijder met een pincet voorzichtig de ondoorzichtige epidermale huidlaag, terwijl de huidlaag die chromatoforen bevat intact blijft.Gooi de epidermale laag weg in een monsterzak. Verwijder vervolgens de chromatophorelaag. Snijd het chromatophoreweefsel in kleine secties van één centimeter bij één centimeter.Plaats de secties in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis en vul elke buis voor de helft met gedissecteerd weefsel. Voeg ten slotte 500 microliters gefilterd zeewater toe aan de buizen. Om de pigmentkorrels te isoleren, worden de chromatofoorweefselsecties eerst vijf minuten gecentrifugeerd bij 14 000 x g.Verwijder de bovenste laag zeewater. Voeg 500 µL papaïne-collagenase-oplossing toe aan de monsters en vortex deze gedurende één tot twee minuten op de hoogste stand. Sonicate vervolgens de monsters gedurende vijf minuten bij 40 kHz om cellen van het omliggende weefsel te scheiden.Centrifuge gedurende nog eens vijf minuten bij 14, 000 x g en verwijder vervolgens het supernatant. Herhaal de centrifugatie nog twee keer, waarbij u elke keer het supernatant weggooit. Voeg daarna de resuspensie in collagenase toe.Gebruik een pincet om handmatig alle resterende grote weefselsecties die niet zijn verteerd te verwijderen voordat u verdergaat. De zuiverheid van de beginoplossing van de granules beïnvloedt de pigmentextractie. Daarom is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de startmaterialen van de chromatofoor volledig zijn verteerd.Wij hebben vastgesteld dat weefselsecties van ongeveer één centimeter optimaal zijn voor het verzamelen van de zuiverste populatie granules. Bereid de homogenisatierbuffer voor door een schroefdoppenbuis van 150 milliliter te nemen en de juiste hoeveelheid HEPES, magnesiumchloride, kaliumaspartaat en dithiothreïtol toe te voegen. Voeg één commerciële minitablet protease-remmer toe.Meet met een maatcilinder 100ml gedeïoniseerd water en voeg dit toe aan de buis met de homogenisatiezouten. Vortex de buis tot de oplossing helder is. Centrifugeer de weefselmonsters en verwijder vervolgens het supernatant.Voeg 500 microliters homogenisatiebuffer toe aan elke buis en vortex 2 minuten om grondig te mengen. Sonicate de monsters gedurende 30 minuten bij 40kHz. Centrifugeer ze vervolgens opnieuw.Gooi het supernatant weg en herhaal de toevoeging van homogenisatievloeistof, de sonicatie en de centrifugatie twee tot drie keer om een volledige digestie van het extracellulaire weefsel te garanderen. Uiteindelijk moet de buis een lichtgeel supernatant bevatten en een roodgekleurde pellet bestaande uit de geïsoleerde pigmentgranulen. Gooi het supernatant weg.Bereid eerst zuur methanol voor extractie in een glazen monsterbuisje met schroefdop door 5ml methanol en 25mcL geconcentreerd zoutzuur toe te voegen. Draai de oplossing voorzichtig om deze te mengen. Zet één monsterbuisje apart; dit wordt de behandeling voor de granules na reactie.Verwijder de homogenisatiebuffer uit een tweede buis met granulen. Voeg 500mcL van de zure methanoloplossing toe aan de resterende buizen en vortex deze gedurende drie tot vier minuten. Sonicate de monsters gedurende 10 minuten bij 40kHz en centrifugeer vervolgens vijf minuten bij 14000 x g.Verzamel het supernatant met een micropipet in een glazen schroefbuisje van één dram. Dit is het pigment en het zou donkerrood van kleur moeten zijn. Herhaal de stappen van toevoeging van zuur methanol, sonicatie en centrifugatie vier tot vijf keer en verzamel het supernatant totdat er geen verdere kleur meer wordt geëxtraheerd.Het resterende kleurloze pellet bestaat uit de pigmentgeëxtraheerde korrels. Om korrelmonsters voor beeldvorming voor te bereiden, worden eerst zowel het aliquot van de ongereageerde korrels als de pigmentgeëxtraheerde korrels gedurende vijf minuten gecentrifugeerd bij 14000 x g; verwijder het supernatant en resuspendeer vervolgens elk pellet in 1ml 95% ethanol. Breng met een transferpipet 2-3 druppels van elke korrelsuspensie aan op een aparte aluminium SEM-stub.Plaats de monsters in een desiccator om ze onder vacuüm een nacht te laten drogen. Sputtercoat de stubs gedurende 3 minuten met een goud-platina coating om een laag van 15 nanometer te verkrijgen. Beeld de monsters af met behulp van een scanning elektronenmicroscoop.Gebruik vervolgens een spectrofotometer om de absorptieprofielen van de ongereageerde korrels, de geëxtraheerde korrels en het geëxtraheerde pigment te bepalen. Voer voor de korrelmonsters een nulmeting uit door 1ml gedeïoniseerd water aan een schone cuvette toe te voegen. Gooi de nulmeting in een afvalbak.Voeg vervolgens de suspensie met de niet-gereageerde pigmentkorrels toe aan de cuvet. Verzamel de UV-vis absorptiespectra voor het korrelmonster. Voer een tweede blanco-meting uit voor het geëxtraheerde pigment met behulp van 1mL zuur methanol en een schone cuvet.Neem tot slot het UV-vis absorptiespectrum van het pigment en bepaal vervolgens de maximale golflengte van elk monster. Scanning elektronenmicroscopie onthulde dat het extractieproces van het pigment de gemiddelde diameter van de granules verlaagt. Voor extractie hebben de granules een gemiddelde diameter van 527.3nm.Na de procedure met zuur methanol neemt deze grootte aanzienlijk af tot ongeveer 202,6 nm. Deze afname wordt vermoedelijk veroorzaakt door de extractie van het pigment. Bij toevoeging van het zure methanol vermindert ook de kleur die geassocieerd wordt met de ongereageerde korrels zichtbaar.Bevestiging van deze hypothese werd verkregen met behulp van spectrophotometrie. Deze grafiek toont een breed absorptieprofiel voor de pre-geëxtraheerde granula en een soortgelijk breed, maar lager intensiteitsprofiel voor de post-geëxtraheerde granula. In tegenstelling hiermee vertoont het oplosbare geëxtraheerde pigment een lambda max rond 500nm en een duidelijke schouder rond 380nm.Collectief suggereren deze gegevens de succesvolle extractie van zichtbare kleur uit de granules. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer vier uur van begin tot eind worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden het weefsel volledig te verwijderen dat reflecterende eiwitplaatjes bevat, aangezien deze de extractie en analyse kunnen verstoren.Epidermale weefsels kunnen ook interfereren met de homogenisatiestappen en de pigmentextractie. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals dunlaagchromatografie en massaspectrometrie, worden gebruikt om de pigmenten verder te zuiveren en hun samenstelling te karakteriseren. Deze stappen kunnen helpen bij het verduidelijken van de moleculaire bijdragen aan de kleuring bij cefalopoden.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen voor marien biologen, chemici en ingenieurs, waaronder: Wat is de samenstelling van de pigmenten die worden gebruikt tijdens kleurverandering? En hoe dragen deze bij aan de functie en structuur van de nanogestructureerde korrels binnen de dermale chromatofoororganen? Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u pigment kunt extraheren uit chromatoforen van vers gedissekeerde inktvis, Doryteuthis pealeii.

a-method-for-extracting-pigments-from-squid-doryteuthis-pealeii

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video zal laten zien hoe je hemocytes (bloedcellen) te verkrijgen van de Hawaiiaanse Bobtail...

Het verkrijgen van Hemocytes van de Hawaiiaanse Bobtail Squid Euprymna scolopes En observatie van de Naleving van Symbiotische en niet-symbiotische bacteriën

Dit protocol beschrijft de reconstituurtie van licht-oogstcomplexen in vitro. Deze integrale membraaneiwitten coördineren chlorofylen en carotenoiden en zijn verantwoordelijk voor het oogsten van licht in hogere planten en groene algen.

In Vitro Reconstructie van Licht-oogsten Complexen van planten en groene algen

Dit artikel beschrijft het protocol voor de zuivering van fotoreceptorbuitensegmentfragmenten (POS) via ultracentrifugatie uit porcine/runderetinae met behulp van homogenisatie en sucrosegradiëntcentrifugatie. Dit protocol maakt de bereiding mogelijk van grote voorraden van POS-aliquots, gelabeld of ongelabeld, die vervolgens op -80 °C kunnen worden bewaard.

Grootschalige Zuivering van Varkens of Bovine Fotoreceptor Outer Segmenten voor Fagocytose Testen op retinale pigment epitheelcellen

Dit bioassay maakt gebruik van een model roofvissen aan de aanwezigheid van het voeden-afschrikmiddel metabolieten van organische extracten van de weefsels van mariene organismen in de natuurlijke concentraties met behulp van een qua voedingswaarde vergelijkbaar voedsel matrix beoordelen.

Een vis van borstvoeding Laboratory Bioassay de Antipredatory activiteit van secundaire metabolieten te beoordelen vanuit de weefsels van mariene organismen

Dit manuscript beschrijft een eenvoudige en high-throughput werkwijze voor het samenstellen in water oplosbare eiwitten met hydrofobe pigmenten die is gebaseerd op water-in-olie-emulsies. We tonen de effectiviteit van de werkwijze voor de assemblage van natieve chlorofyl vier varianten van recombinant water oplosbare chlorofyl-bindende eiwitten (WSCPs) van Brassica planten tot expressie gebracht in E. coli.

Water in olie emulsies: Een nieuw systeem voor het samenstellen van water-oplosbare-Chlorophyll bindende eiwitten met Pigmenten Hydrofobe

Dit werk biedt een methode om de abdominale pigmentatie van Drosophila melanogaster snel en nauwkeurig te kwantificeren met behulp van digitale beeldanalyse . Deze methode stroomlijnt de procedures tussen fenotype-acquisitie en data-analyse en omvat voorbeeldmontage, beeldverzameling, pixelwaarde-extractie en eigenschappen van eigenschappen.

Kwantificering van buikpigmentatie in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Hier presenteren we een protocol om te isoleren fucoxanthin chlorofyl a/c bindende proteïnen (FCP) van diatomeeën en in liposomen met natuurlijke lipide composities aan het bestuderen van excitatie energieoverdracht op ion samenstelling veranderingen te integreren.

Isoleren en de integratie van licht-oogst antennes van Diatomee Cyclotella Meneghiniana in liposomen met thylakoïde lipiden

Dolioliden, met inbegrip van de soort Dolioletta gegenbauri, zijn kleine gelatineuze mariene zoöplankton van ecologische betekenis gevonden op productieve Subcontinentale plank systemen wereldwijd. De moeilijkheid van het kweken van deze delicate organismen beperkt hun onderzoek. In deze studie beschrijven we de teelt benaderingen voor het verzamelen, fokken en onderhouden van de doliolid Dolioletta gegenbauri.

Teelt van de mariene pelagische Tunicate Dolioletta gegenbauri (uljanin 1884) voor experimentele studies

Regulatoren van melanocytenfuncties regelen zichtbare verschillen in de pigmentatie-uitkomst. Het ontcijferen van de moleculaire functie van het kandidaat-pigmentatiegen vormt een uitdaging. Hierin demonstreren we het gebruik van een zebravismodelsysteem om kandidaten te identificeren en in te delen in regulatoren van melaninegehalte en melanocytenaantal.

Omgekeerde genetische benadering om regulatoren van pigmentatie te identificeren met behulp van zebravissen

We presenteren een protocol om bi-stabiele fotopigmenten elektrofysiologisch te karakteriseren: (i) het benutten van de ladingsverplaatsingen binnen de fotopigmentmoleculen na fotonabsorptie en hun enorme hoeveelheid in de fotoreceptoren, en (ii) het benutten van de absorptie-spectraverschillen van rhodopsine en metarhodopsine fotopigmenttoestanden. Deze protocollen zijn nuttig om te screenen op mutaties die bi-stabiele fotopigmentsystemen beïnvloeden.

Elektrofysiologische methoden voor het meten van fotopigmentniveaus in Drosophila-fotoreceptoren

Hier beschrijven we verschillende protocollen die gericht zijn op een geïntegreerde valorisatie van Gracilaria gracilis: het oogsten van wilde soorten, in-house groei en extractie van bioactieve ingrediënten. De antioxiderende, antimicrobiële en cytotoxische effecten van de extracten worden geëvalueerd, samen met de voedings- en stabiliteitsbeoordeling van voedsel verrijkt met hele zeewierbiomassa en pigmenten.

Valorisatie van het rode zeewier Gracilaria gracilis door middel van een bioraffinage-aanpak

Leer een methode voor het extraheren van pigmenten uit chromatoforen van de inktvis Doryteuthis pealeii. Dit protocol helpt onderzoekers de nanoschaalmechanismen van kleurverandering in cephalopoden te begrijpen.

Een methode voor het extraheren Pigmenten van Squid

Meer video's verkennen