Optogenetische willekeurige mutagenese met behulp van histon-miniSOG in C. elegans
14 november 2016
Genetisch gecodeerde histon-miniSOG induceert genoom-brede erfelijke mutaties in een blauw licht-afhankelijke manier. Dit mutagenese methode is eenvoudig, snel, vrij van giftige chemicaliën, en zeer geschikt voor forward genetische screening en transgene integratie.
Het algemene doel van dit mutageneseprotocol is om een eenvoudige LED-opstelling te gebruiken om het genomische DNA van C.elegans te mutageren dat blauw lichtafhankelijke, reactieve zuurstofgeneratoreiwitten tot expressie brengt. De twee belangrijkste voordelen van deze techniek zijn één, het mutageneseprotocol is zeer eenvoudig en vereist geen giftige chemicaliën. En twee, de mutagenesegenerator bewijst na een lange mutatie.
Ik had eerst het idee voor deze methode, en ik realiseerde me dat ROS-genererende eiwitten nog nooit zijn gebruikt om erfelijke mutaties te induceren. Verbind voor dit experiment de controller van de LED-verlichtingseenheid met een digitale functiegenerator via een BNC-kabel. Gebruik een aangepaste houder om de LED-lampjes 10 centimeter boven het podium te bevestigen.
Bedek nu gedeeltelijk de opstelling om de blootstelling van het blauwe licht aan de omgeving te beperken, maar niet zodanig dat warmte zich op het podium zal ophopen. Hier wordt een zelfgemaakte, harde kunststof deksel met een open boven- en onderkant gebruikt. Draag tijdens de werking van de LED altijd laserbeschermende bril of zonnebril, omdat het licht erg fel is.
Schakel nu de hendel van de LED-controller naar intern en stel deze in op 65% van het maximale vermogen. Gebruik een fotometer om het lichtvermogen indien nodig aan te passen, zodat het op het podium 2,0 milliwatt per vierkante millimeter is tijdens continue verlichting. Houd voor dit protocol de lichtgevoelige stam in het donker onder standaardcondities.
Onnodige blootstelling aan licht moet worden vermeden, maar routinematig gebruik van een halogeenlamp voor passage leidt niet tot mutaties. Omdat onbedoelde mutatie een zorg is, bevriest u aliquots van de stam wanneer ze voor het eerst worden verkregen. Bereid voor de mutagenese een filterpapier voor om op een 60 millimeter plaat te passen met een vierkant gat van ongeveer 25 millimeter in het midden en plaats het op een niet-gezaaide plaat.
Verdeel vervolgens 100 microliter 100 millimolair koperchloride gelijkmatig over het filterpapier om te voorkomen dat de wormen het vierkante gat verlaten. Neem nu van een plaat wormen, die ongeveer 12 uur na hun L4-stadium zijn, de zwangere, jonge volwassen hermafrodieten en plaats ze in het middenvierkant op de plaat. Schakel vervolgens de LED en de functiegenerator in.
Schakel vervolgens de LED-controller naar extern om deze met de functiegenerator te besturen en stel het vermogen geschikt in. Produceer vanuit de functiegenerator een sinusgolf bij 4 hertz. Breng nu de plaat over naar het podium en belicht de wormen gedurende 30 minuten met blauw licht.
Overbreng onmiddellijk na de behandeling alle gezond uitziende wormen naar een gezaaide plaat. Deze wormen zullen na de lichtbehandeling oncoördineerde lijken, maar ze zullen zich herstellen. Houd de met licht behandelde wormen in het donker.
Controleer later op abnormale morfologieën of gedragingen in de volwassen F2-nakomelingen. Een voorwaartse genetische screening werd uitgevoerd met behulp van de beschreven techniek voor 60 F1-platen, wat overeenkomt met 120 gemutageneerde haploïde genomen. Acht van de 60 F1-platen met F2-wormen vertoonden zichtbare fenotypes, zoals een dumpy lichaamsvorm, oncoördineerde beweging of dodelijkheid bij volwassenen.
De nakomelingen van deze F2-wormen behielden deze waarneembare fenotypes. Het aantal zichtbare mutanten uit deze screening suggereert dat de stam en de opstelling goed werken voor optogenetische mutagenese. De mutageneseprocedure kan binnen een uur worden uitgevoerd.
Geniet van de snelle en veilige mutagenesemethode.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een mutagenese-protocol waarbij gebruik wordt gemaakt van genetisch gecodeerd histone-miniSOG om genoombrede erfelijk overdraagbare mutaties te induceren op een blauw licht-afhankelijke manier. De methode is eenvoudig, snel en vrij van toxische chemicaliën, waardoor deze ideaal is voor forward genetische screening en transgene integratie.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschapsgebied
- Genetica
- Neurowetenschappen
- Mutagenese
Achtergrond
- Genetisch gecodeerde eiwitten kunnen reactieve zuurstofspecies (ROS) genereren.
- Eerdere methoden voor het induceren van mutaties maken vaak gebruik van toxische chemicaliën.
- Deze studie onderzoekt een nieuwe benadering voor erfelijke mutagenese.
- C. elegans dient als modelorganisme voor dit protocol.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een eenvoudig mutagenese-protocol met behulp van blauw licht.
- Het aantonen van de effectiviteit van ROS-genererende eiwitten bij het induceren van mutaties.
- Het faciliteren van forward genetische screening en transgen-integratie.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een eenvoudige LED-opstelling voor mutagenese.
- Verbinding van de LED-verlichting met een digitale functiegenerator.
- Bevestiging van de LED-lampen boven het plateau met behulp van een aangepaste houder.
- Observatie van mutagenese-effecten in C. elegans.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle inductie van genoombrede overerfbare mutaties.
- Demonstratie van een niet-toxische mutagenesemethode.
- Validatie van de techniek voor forward genetische screening.
- Potentieel voor transgeen-integratie met behulp van deze methode.
Conclusies
- Het protocol biedt een eenvoudige en effectieve benadering voor mutagenese.
- Blauw licht-afhankelijke mutagenese is een veelbelovende techniek voor genetische studies.
- Deze methode kan het onderzoek in de genetica en moleculaire biologie bevorderen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Optogenetische random mutagenese met behulp van histone-miniSOG in C. elegans maakt snelle, overerfbare genoommodificatie mogelijk zonder gevaarlijke chemicaliën, waardoor workflows voor vroege ontdekkingen worden gestroomlijnd. Deze aanpak ondersteunt high-throughput genetische screening en transgeen-integratie, wat operationele barrières vermindert en de flexibiliteit van de portfolio vergroot. De veiligheid en eenvoud maken het tot een schaalbare tool voor functionele genomica en targetvalidatie in preklinisch onderzoek.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt systematische ondervraging van genfuncties mogelijk via forward genetische screening.
- Faciliteert de identificatie van nieuwe pathways en genetische modifiers die relevant zijn voor ziektemodellen.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door het genereren van diverse allelische varianten voor mechanistische studies.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets door onbevooroordeelde mutagenese mogelijk te maken.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt een gevalideerd, reproduceerbaar systeem voor het genereren van mutante bibliotheken in C. elegans.
- Elimineert chemische gevaren, waardoor assay-standaardisatie en laboratoriumnaleving worden vereenvoudigd.
- Maakt snelle preparatie van genetisch diverse populaties mogelijk voor downstream fenotypische screens.
- Ondersteunt schaalbare, platform-klare workflows voor compound-evaluaties en studies naar genetische interacties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij de ontwikkeling van ziekterelevante modellen door gerichte mutagenese en transgeen-integratie mogelijk te maken.
- Faciliteert continuïteit van genetische ontdekking naar preklinische validatie in modelorganismen.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door robuuste genetische instrumenten te bieden voor mechanistische risicoreductie.
Integratie van Pipeline en Workflow
Deze optogenetische mutagenesemethode wordt geïntegreerd in de vroege fasen van ontdekking en doelwitvalidatie, ter ondersteuning van de identificatie van lead-verbindingen en de ontwikkeling van preklinische modellen.
- Discovery Biology: Versnelt hypothesetoetsing en pathway-elucidatie via onbevooroordeelde mutagenese.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor mutantselectie en fenotypische analyse.
- Analytics: Maakt statistische vergelijking van mutantfenotypen en de efficiëntie van transgeen-integratie mogelijk.
- Translationeel onderzoek: Slaat de brug tussen genetische ontdekkingen en de optimalisatie van preklinische modellen in C. elegans.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar, niet-toxisch platform voor voortdurende genetische screening en tool-ontwikkeling.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en de validatie van targets door brede mutagenese mogelijk te maken zonder chemische storende factoren.
- Operationele waarde: Verhoogt de laboratoriumveiligheid, standaardisatie en doorvoer door het elimineren van gevaarlijke reagentia.
- Strategische waarde: Ondersteunt efficiënte go/no-go-beslissingen en vermindert biologische risico's in een laat stadium door middel van robuuste genetische tools.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en flexibele voortgang van genetische ontdekkingsprogramma's mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in C. elegans genetica en het opzetten van optogenetische systemen.
- Vereist een infrastructuur voor LED-verlichting en basisprotocollen voor laboratoriumveiligheid bij blootstelling aan licht.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van gegevens.
- Aanpasbaar aan andere modelsystemen met compatibele optogenetische constructen.
- Afhankelijk van zorgvuldige hantering om onbedoelde licht-geïnduceerde mutaties te voorkomen.
