Name: Het bouwen van Finite Element modellen te onderzoeken zebravis Jaw biomechanica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 11 s
Description: Verken eindige-elementenanalyse om de biomechanica van de ontwikkelende kaak van Danio rerio te simuleren. Deze methode onthult hoe mechanische belastingen celgedrag en skeletontwikkeling beïnvloeden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LHB werd gefinancierd door de Wellcome Trust Dynamic Cell PhD-programma; KAR werd gefinancierd door MRC projectsubsidie ​​MR / L002566 / 1 (toegekend aan EJR en CLH) CLH en werd gefinancierd door Aruk subsidie ​​19479. We willen ook graag de Wolfson Bio-imaging faciliteit voor de beeldvorming advies bedanken.

Alle stappen in het protocol te volgen van de Universiteit van Bristol dierverzorging en richtlijnen welzijn en die van het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken. 1. Visualisatie van spier-anatomie OPMERKING: Om de vorm van het skelet elementen zichtbaar te maken, om spieren te kwantificeren en om de exacte plaatsing van de aanhechtingen te identificeren, immunostain (paragraaf 1.1) vissen op de juiste leeftijd voor het skelet myosine (die spieren openbaart) en type II collageen (te visualiseren kraakbeen). Als alternatief, visualiseer het bewegingsapparaat anatomie met behulp van transgene fluorescerende reporter lijnen zoals de collageen a1 verslaggever COL2A1: mCherry 13,14 kraakbeen en de trage myosine zware keten reporter smyhc visualiseren: GFP 15 om de positie van spieraanhechtingen (punt 1.2) te visualiseren. Alternatieve lijnen die kraakbeen en spieren markeer evengoed werken. <ol><li> fluorescent Immunostaining <ol><li> Fix larve dan 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 1 uur. Wassen in PBS met 0,1% Tween 20 (PBT) en drogen in 50% methanol (MeOH) in PBT en 100% MeOH gedurende 5 min respectievelijk. Let op: PFA is giftig en dienen in overeenstemming met het materiaal veiligheidsinformatieblad worden behandeld. OPMERKING: Larve kunnen worden opgeslagen in 100% MeOH tot vereist. </li><li> Rehydrateren larve in 50% MeOH in PBT gedurende 5 min. Wassen in PBT gedurende 5 min. </li><li> Permeabilize larve in 0,25% trypsine in PBT op ijs voor 5-6 min. Wassen 4x PBT gedurende 5 minuten elk. </li><li> Blokkeer voor 2-3 uur in 5% serum in PBT. </li><li> Incubeer larve in de aanbevolen verdunning van konijn anti-type 2 collageen en muizen anti-myosine antilichamen in 5% serum in PBT gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. LET OP: De aanbevolen verdunning bereik is normaal gesproken op het antilichaam data sheet. Kies antilichamen die tegen verschillende soorten verhoogd tot elkaar en die ook diffeverhuren aan het weefsel. </li><li> Was larve 6x gedurende 15 minuten in PBT. </li><li> Blokkeer voor 1-2 uur in 5% serum in PBT. </li><li> Incubate in secundaire antilichamen in het donker. Gebruik fluorescent gelabelde anti-muis (550) en anti-konijn (488) secundaire antilichamen in een geschikte verdunning in 5% serum en PBT voor het specifieke antilichaam. </li><li> 6X wassen gedurende 10 minuten elk in PBT en beeld op een 10X confocale microscoop zo spoedig mogelijk. </li></ol></li><li> Imaging Musculoskeletal Geometry <ol><li> Monteer de larven ventraal op een dekglaasje in lauwe 0,3-0,5% laag smeltpunt (LMP) agarose in Danieau&#39;s oplossing 16. OPMERKING: transgene vissen moeten verdoofd in 0,02% MS222 (tricaïne methaansulfonaat, pH 7) voor montage en tijdens de beeldvorming. </li><li> Neem een ​​confocale beeld De stapel van de regio van belang met behulp van de 10x objectief en de ongeveer 2.5x digitale zoom. Bereid beelden van de groene en rode kanaal met behulp van de 488 nm en 561 nm lasers respectievelijk. Beeld bij een 512 x 512 pixel resolutie met een interval tussen z vliegtuigen van 1,3 micrometer en 3 lijn gemiddelden. De resulterende stapel zal bestaan ​​uit ongeveer 100 z segmenten. </li><li> Exporteer de gegevens als een tiff-serie. Maximum projecties van de spier en kraakbeen elementen uit een 5dpf zebravis larven zijn weergegeven in figuur 1. </li></ol></li></ol> 2. Het genereren van een 3D-oppervlak <ol style="margin-left: 40px;"><li> Kies een vertegenwoordiger gegevensset voor elk tijdpunt 3, 4 en 5 DPF (kiezen na zichtbaar maken van meerdere monsters). </li><li> Open 3-dimensionale tiff stack en selecteer alle kanalen in de analyse software. Klik met de rechtermuisknop op het kraakbeen kanaal en selecteer het filter en egaliseren: Gauss (Figuur 2B). </li><li> In het project view klik met de rechtermuisknop op de gefilterde afbeelding en selecteer &#39;imago segmentatie&#39; en vervolgens op &#39;nieuwe label bewerken&#39;. Maak een nieuw label voor elk materiaal, dat wil zeggen, kraakbeen en joint. Selecteer het kraakbeen gebied van de afbeelding (figuur 2C, wit signaal, paars overzicht) met de toverstaf. Gebruik het penseel om ruis te verwijderen uit de contouren. LET OP: Bij gebruik van toverstaf, klikt u op &#39;All slices&#39;. </li><li> Selecteer de gezamenlijke regio met de brush tool en toe te wijzen aan een gezamenlijke component (figuur 2C, blauw overzicht) </li><li> Smooth meerdere segmenten in een keer door het selecteren van segmentatie in het bovenste menu en glad labels. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en selecteer genereren oppervlak het produceren van een 3D-oppervlak renderen van de component (figuur 2D). </li><li> Klik op het oppervlak en de gegevens op te slaan als een hmascii bestand voor invoer in meshing software. </li></ol> 3. Het berekenen van de Muscle Forces om te worden gebruikt in de FE Model <ol style="margin-left: 40px;"><li> Tel het aantal spiervezels van confocale beelden van smyhc: GFP transgene zebravis (Figuur 1A, pijlpunt, 1C) en meet de diameter van de vezels hun dwarsdoorsnede berekenen (πr 2). </li><li> Identificeer geschikte kracht per oppervlakte-eenheid spier uit de literatuur. De maximale spierkracht gegenereerd per oppervlakte-eenheid voor larvale zebravis skeletspieren (40 nN / um 2) werden gebruikt 17. </li><li> Bereken de krachten voor elke anatomische spiergroep door het aantal vezels en het oppervlak te vermenigvuldigen met de kracht per oppervlakte-eenheid. Zie tabel 1. </li></ol> 4. Het genereren van een Mesh <ol style="margin-left: 40px;"><li> Importeer het 3D-model gegenereerd in deel 2 (boven) in een software-pakket in staat is het genereren van een eindige elementen mesh. </li><li> Genereer A2D mazen van het kraakbeen en gewrichtsoppervlakken met behulp van de krimpfolie gereedschap onder het menu 2D. Kies een passende omvang element. Opmerking: Gebruik een element grootte tussen 1,5-2,5. Indien nodig, het genereren van een reeks van verschillende grootte 2D-oppervlak mazen uit te voeren 3D mesh optimalisatie (Hoofdstuk 4.4). </li><li> Verricht mesh kwaliteitscontroles vinden onder de &#39;2D&gt; Extra&gt; Controleren elementen&#39; paneel om te controleren of gedupliceerde elementen, toevoegingen en doorvoeren in het gaas. Fix tweevlakshoeken via het tabblad nut in model boom. </li><li> Genereer een 3D-net van de 2D-oppervlak mazen van verschillende element grootte met behulp van de 3D&gt; Tetramesh deelpaneel. OPMERKING: Vergelijk de resultaten van verschillende maaswijdte en selecteer de FE-model met het laagste maaswijdte dat convergeert na verdere simulaties en heeft geen functie definitie in gevaar brengen. Het voorbeeld in Figuur 3 bevat 1.500.000 tetraedrische elementen voor de onderkaak kraakbeen en had een 2D element grootte van 2,0. </li><li> Transformeer het gaas zodat kaak model is op schaal als per confocale stack met behulp van de Geometry&gt; Distance deelpaneel. LET OP: Zorg ervoor dat het kraakbeen en de gezamenlijke onderdelen worden in het model met elkaar verbonden door het exporteren van een gefuseerde model of met behulp van banden. </li></ol> 5. Finite Element Model Construction <ol><li> Met behulp van commerciële eindige elementen (FE) software, maakt u een FE-model. Met behulp van de 3D-spieren en kraakbeen gelabeld confocale stapels gegenereerd in deel 1 als een gids, toewijzen knooppunten die overeenkomen met spieraanhechting punten. Een vector tussen twee knooppunten die de oorsprong en insertie van elke spier (figuur 3). </li><li> Maak een belasting collector van het type &#39;geschiedenis&#39; van een &#39;C load&#39; voor elke spier van toepassing. Geef de magnitude in Newton (berekend in stap 3.3) en de bijbehorende vector toegewezen. Figuur 3 toont de bevestigingspunten voor de adductor mandibulae (AM), gradenboog hyoideus (PH) en intermandibularis (IM). OPMERKING: Bij deze kaakspieren, wordt de maximale contractiele kracht verdeeld over de oorsprong en insertie zodat slechts 50% van elke lading wordt aangebracht op elke locatie. </li><li> geschikte isotrope elastische materiaaleigenschappen toekennen zoals bepaald door de literatuur. Young&#39;s modulus kraakbeenen de Interzone in dit model waren 1,1 MPa en 0,25 MPa respectievelijk verhouding Poisson was 0,25 voor zowel 18,19. </li><li> Maak een belasting collector van het type &#39;boundary&#39; om de eerste beperkingen toe te passen op het model. Ga naar het tabblad Analyse&gt; Beperkingen en in het creëren aansluitkast, pak de knooppunten van het model dat u wilt beperken. Selecteer het aantal vrijheidsgraden (DOF) die grens beweging van het model om de beste benadering van het natuurlijke verspreidingsgebied van de beweging. Opmerking: Het model in figuur 3 is beperkt in alle bewegingsassen (DOF: 1, 2, 3 representeren x, y en z respectievelijk) en ceratohyal te verankeren in de ruimte bij een middenstand van het model en de y en z-as op het punt waar de palatoquadrate verbindt met de rest van de zebravis schedel (figuur 3, Tabel 1). Het model moet worden beperkt in drie DOF in ten minste één knooppunt. </li><li> Maak een &#39;Load stap&#39;, voor elk type van de beweging die u wilt Simulaten (dat wil zeggen, het openen, sluiten), in het kader van de analyse en selecteer alle relevante belastingen (gemaakt in paragraaf 5.2) en beperkingen (gemaakt in paragraaf 5.4) om deze beweging te simuleren. Selecteer &#39;Static&#39; uit het drop down menu wanneer deze verschijnt. </li><li> Export model met inbegrip van de maas, belastingen, beperkingen en materiaaleigenschappen in een geschikt bestandsformaat, in dit geval &quot;.inp&quot; formaat. </li><li> Load model in de FE analyse software. Maken en uitvoeren van een taak voor het model met behulp van de Job-module. </li><li> Analyseer uitgang voor spanning, rek, verplaatsing, etc. in de resultaten tab en visualisatie menu (figuur 4 en 5). </li></ol> 6. Validatie van de Kaak Vervorming / Verplaatsing Afstanden <ol><li> Selecteer 3-6 Tg (Col2a1aBAC: mCherry) transgene zebravis. </li><li> Lichtjes verdoven de larven met 0,02% MS222 totdat zij ophouden te reageren op te raken, maar hun hart nog kloppen. </li><li> bergde larven lateraal (terwijl verdoofde) op dekglaasjes in lauw 1% LMP agarose (samengesteld in oplossing Danieau&#39;s). </li><li> Verwijder de agarose uit rond het hoofd en kaak met een pincet. </li><li> Spoel oplossing verse Danieau&#39;s (zonder MS222) over het hoofd van de larve tot anesthesie te verwijderen met behulp van een Pasteur pipet totdat de normale bewegingen van de mond te hervatten. </li><li> Gebruik movie capture software voor bright-field high-speed video&#39;s van bewegingen van de mond te nemen. Neem films van ongeveer een looptijd minuten op het hoogste frame rate, of die voldoende is om meerdere cycli van de kaak opening op te nemen. </li><li> Kies frames die de kaak open staat voor de maximale cilinderinhoud tonen. Meet de afstand tussen het voorste uiteinde van kraakbeen Meckel en de bovenkaak (punt van ethmoid plaat) in urn. </li><li> Bereken de gemiddelde verplaatsing van meerdere vislarven. </li><li> Uittreksel verplaatsing van gegevens uit het model. Gebruik de gemiddelde verplaatsing berekende 6,8 tot model verplaatsing gedrag te controleren ( <strong&gt; Figuur 4). Als het model afwijkt van de verwachting, gerund gevoeligheidsanalyse door het achtereenvolgens veranderen van eigenschappen van het materiaal en spieren belastingen. </li></ol>

<ol><li>Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finite+Element+Analysis+and+Understanding+the+Biomechanics+and+Evolution+of+Living+and+Fossil+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Earth+Planet.+Sci%22%5BJournal%5D)">Finite Element Analysis and Understanding the Biomechanics and Evolution of Living and Fossil Organisms.</a> Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 35, 541-576 (2007).</li>
<li>Rao, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRao%2C+SS+%22The+Finite+Element+Method+in+Engineering%3A+Fifth+Edition%22">The Finite Element Method in Engineering: Fifth Edition</a>. , (2010).</li>
<li>Taylor, M., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+decades+of+finite+element+analysis+of+orthopaedic+devices%3A+Where+are+we+now+and+what+are+the+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Four decades of finite element analysis of orthopaedic devices: Where are we now and what are the opportunities.</a> J Biomech. 48, 767-778 (2015).</li>
<li>Button, D. J., Rayfield, E. J., Barrett, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+biomechanics+underpins+high+sauropod+diversity+in+resource-poor+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Royal+Soc+London+B%3A+Biol+Sci.+281%22%5BJournal%5D)">Cranial biomechanics underpins high sauropod diversity in resource-poor environments.</a> Proc Royal Soc London B: Biol Sci. 281. 281, (2014).</li>
<li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+and+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology and developmental control.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 27-61 (2013).</li>
<li>Shwartz, Y., Farkas, Z., Stern, T., Aszodi, A., Zelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+contraction+controls+skeletal+morphogenesis+through+regulation+of+chondrocyte+convergent+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+biol%22%5BJournal%5D)">Muscle contraction controls skeletal morphogenesis through regulation of chondrocyte convergent extension.</a> Dev biol. 370, 154-163 (2012).</li>
<li>Rolfe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mechanosensitive+genes+during+skeletal+development%3A+alteration+of+genes+associated+with+cytoskeletal+rearrangement+and+cell+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of mechanosensitive genes during skeletal development: alteration of genes associated with cytoskeletal rearrangement and cell signalling pathways.</a> BMC genomics. 15, 48(2014).</li>
<li>Roddy, K. A., Kelly, G. M., van Es, M. H., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+patterns+of+mechanical+stimulation+co-localise+with+growth+and+cell+proliferation+during+morphogenesis+in+the+avian+embryonic+knee+joint%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Dynamic patterns of mechanical stimulation co-localise with growth and cell proliferation during morphogenesis in the avian embryonic knee joint.</a> J Biomech. 44, 143-149 (2011).</li>
<li>Haudenschild, D. R., Chen, J., Steklov, N., Lotz, M. K., D'Lima, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+chondrocyte+actin+cytoskeleton+in+living+three-dimensional+culture%3A+response+to+anabolic+and+catabolic+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+cell+biomech%22%5BJournal%5D)">Characterization of the chondrocyte actin cytoskeleton in living three-dimensional culture: response to anabolic and catabolic stimuli.</a> Mol cell biomech. 6, 135-144 (2009).</li>
<li>Nowlan, N. C., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+pattern+of+mechanical+stimulation+promotes+ossification+in+avian+embryonic+long+bones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">A dynamic pattern of mechanical stimulation promotes ossification in avian embryonic long bones.</a> J Biomech. 41, 249-258 (2008).</li>
<li>Giorgi, M., Carriero, A., Shefelbine, S. J., Nowlan, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiological+simulations+of+prenatal+joint+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Mechanobiological simulations of prenatal joint morphogenesis.</a> J Biomech. 47, 989-995 (2014).</li>
<li>Heegaard, J. H., Beaupre, G. S., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+modulated+cartilage+growth+may+regulate+joint+surface+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ortho+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanically modulated cartilage growth may regulate joint surface morphogenesis.</a> J Ortho Res. 17, 509-517 (1999).</li>
<li>Hammond, C. L., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+populations+of+endochondral+osteoblasts+with+differential+sensitivity+to+Hedgehog+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two populations of endochondral osteoblasts with differential sensitivity to Hedgehog signalling.</a> Development. 136, 3991-4000 (2009).</li>
<li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+cartilage+%2F+OARS%2C+Osteoarth+Res+Soc%22%5BJournal%5D)">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarth Res Soc. 21, 269-278 (2013).</li>
<li>Elworthy, S., Hargrave, M., Knight, R., Mebus, K., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+multiple+slow+myosin+heavy+chain+genes+reveals+a+diversity+of+zebrafish+slow+twitch+muscle+fibres+with+differing+requirements+for+Hedgehog+and+Prdm1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of multiple slow myosin heavy chain genes reveals a diversity of zebrafish slow twitch muscle fibres with differing requirements for Hedgehog and Prdm1 activity.</a> Development. 135, 2115-2126 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Danieau%27s+solution+%2830%C3%97%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Prot%22%5BJournal%5D)">Danieau's solution (30×).</a> Cold Spring Harb Prot. , pdb.rec12467 (2011).</li>
<li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+physiol%22%5BJournal%5D)">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> J Gen physiol. 137, 255-270 (2011).</li>
<li>Tanck, E., Blankevoort, L., Haaijman, A., Burger, E. H., Huiskes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+muscular+activity+on+local+mineralization+patterns+in+metatarsals+of+the+embryonic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ortho+Res%22%5BJournal%5D)">Influence of muscular activity on local mineralization patterns in metatarsals of the embryonic mouse.</a> J Ortho Res. 18, 613-619 (2000).</li>
<li>Tanck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+consequences+of+mineralization+in+embryonic+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The mechanical consequences of mineralization in embryonic bone.</a> Bone. 35, 186-190 (2004).</li>
<li>Brunt, L. H., Norton, J. L., Bright, J. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finite+element+modelling+predicts+changes+in+joint+shape+and+cell+behaviour+due+to+loss+of+muscle+strain+in+jaw+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Finite element modelling predicts changes in joint shape and cell behaviour due to loss of muscle strain in jaw development.</a> J Biomech. 48, 3112-3122 (2015).</li>
<li>Roddy, K. A., Prendergast, P. J., Murphy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+influences+on+morphogenesis+of+the+knee+joint+revealed+through+morphological%2C+molecular+and+computational+analysis+of+immobilised+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Mechanical influences on morphogenesis of the knee joint revealed through morphological, molecular and computational analysis of immobilised embryos.</a> PloS one. 6, e17526(2011).</li>
<li>Cuff, A. R., Bright, J. A., Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+experiments+on+finite+element+models+of+an+ostrich+%28Struthio+camelus%29+cranium%5BTitle%5D)+AND+%22Peer+J%22%5BJournal%5D)">Validation experiments on finite element models of an ostrich (Struthio camelus) cranium.</a> Peer J. 3, 1294(2015).</li>
<li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Musculoskeletal+patterning+in+the+pharyngeal+segments+of+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Musculoskeletal patterning in the pharyngeal segments of the zebrafish embryo.</a> Development. 124, 2945-2960 (1997).</li>
<li>Dowthwaite, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+underlying+the+movement+requirement+for+synovial+joint+cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+biol%22%5BJournal%5D)">A mechanism underlying the movement requirement for synovial joint cavitation.</a> Matrix biol. 22, 311-322 (2003).</li>
<li>Nia, H. T., Han, L., Li, Y., Ortiz, C., Grodzinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poroelasticity+of+cartilage+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Poroelasticity of cartilage at the nanoscale.</a> Biophys J. 101, 2304-2313 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen. Bepaalde gegevens in de figuren 3-5 is herdrukt van J.Biomech, 48 (12), Brunt et al., Eindige elementen modellering voorspelt veranderingen in gezamenlijke vorm en mobiele gedrag te wijten aan het verlies van spierspanning in de kaak ontwikkeling, 3112-22. 2015, met toestemming van Elsevier 15.

Eindige Elementen modellen werden gebruikt om de gebieden van skeletelementen die onder druk met de botvorming ondergaan 10 hebben betrekking, alsmede de onder druk kaart tijdens endochondrale ossificatie en gewrichtsmorfogenese 8,12,21. Andere studies hebben ook in staat om de theoretische groeimodellen toepassing op wijzigingen repliceren tijdens de gezamenlijke ontwikkeling 11,12 geweest. Hier laten we het protocol voor het bouwen FE modellen voor een relatief eenvoudig systeem, de zebravis kaak 20. In tegenstelling tot alternatieve methoden voor het verzamelen ruwe beelden voor het FE modellen, zoals CT scanning 22, confocale beeldvorming van transgene lijnen of immuno zebravis maakt meerdere weefsels te bestuderen. Het kan derhalve directe informatie over spieraanhechting punten in relatie tot kraakbeen. Onder gewervelde zebravis modellen zijn bijzonder vatbaar voor genetische en farmacologische manipulatie. Het genereren van FE modellen voor zebraviscraniofaciale kraakbeen opent nu de mogelijkheid van verdere studie van het samenspel tussen de biomechanica en de genetica in gewrichtsmorfogenese. Er zijn een aantal belangrijke stappen voor het maken van een model te; de eerste genereert een accurate driedimensionale voorstelling van het systeem. Dit vereist imaging bij hoog genoeg resolutie om grenzen duidelijk te definiëren. Merk op dat zelfs met een hoge resolutie imaging om een ​​goede ondergrond men kan hebben om glad te strijken sommige regio&#39;s. Een andere belangrijke stap is het definiëren van de juiste plaatsing van de lading en juiste randvoorwaarden. Een onvoldoende beperkt model zal falen op te lossen en onjuiste plaatsing van de belastingen zal abnormale beweging veroorzaken. Enkele bewerking van het onbewerkte data (figuur 2) dient als een oppervlak gegenereerd uit de ruwe gegevens moeilijk mesh (figuur 2B) zou zijn. We gefilterd de gegevens met behulp van een Gauss-filter (figuur 2C </strong&gt;) en voerden we een handleiding afvlakking van de bochten om een ​​aantal schone contouren die kan worden omgezet in een 3D-oppervlak te produceren. Te veel smoothing kunt een &quot;smolt&quot; oppervlak dat veel van de mogelijkheden heeft verloren te produceren. Het kiezen van de juiste afmeting element is een iteratief proces kiezen van een te kleine elementengrootte creëert te grote mazen die berekeningsintensief. Echter, het kiezen te grote elementengrootte een maas die niet de juiste vorm van de constructie recapituleren produceren. De juiste mesh had het kleinste element grootte die de juiste vorm van de kaak gevangen genomen en kwamen op een correcte oplossing, gecontroleerd met behulp van de kaak verplaatsing. Het kan ook nodig zijn om de materiaaleigenschappen of laden berekeningen passen beter emuleren de juiste verplaatsing als verschillende leeftijden en soorten aanzienlijk verschillende eigenschappen hebben. Het is belangrijk om te onthouden dat er altijd beperkingen aan een hypothetisch model en eenssumptions gedaan om FE-modellen lopen. Wanneer slechts modellering of een klein aantal monsters is het essentieel om te garanderen dat een representatief monster wordt gekozen als er waarschijnlijk kleine variaties tussen individuen. Aangezien slechts enkele van de bekelementen en spieren bevatten, het model is een vereenvoudigde versie van de zebravis craniofaciale bewegingsapparaat. Daarom moest beperkingen worden gepositioneerd om rekening te houden wanneer de gemodelleerde bekelementen zou verbinden met de rest van de schedel en het model werd kunstmatig beperkt in het voor de reparatie in &#39;ruimte&#39;. Deze kunstmatige beperking heeft geen invloed op de conclusies die uit de modellen als de ceratohyal zelf niet werd geanalyseerd interpretatie. Het opnemen van meer van het craniofaciale structuur zou vooral andere bekopening spieren zoals de sternohyals en de aangehechte kraakbeen 23, zijn toegevoegd aan het model, maar beperkingen omvatten het vermogen van grotere modellen om te draaien in de eindige elementen software. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Een andere beperking is dat we niet gemodelleerd ligament insertie, hoewel dit kan worden bereikt door het inbrengen van veren 8. Een andere veronderstelling in dit geval dat het model lineair zou gedragen. De grootten van spanningen op de modellen waren vergelijkbaar met die in de gepubliceerde modellen en toegepast in vitro cellen 10,24, met stammen die onder 3500 en hoger -5000 μɛ behalve dwang en spier bevestigingspunten. Daarom is de spanningen op de juiste plaatsen model geacht binnen een acceptabel voor een lineair model bereik. Kraakbeen niet geheel gedragen als een lineaire materiaal en vroeger gemodelleerd als poroelastic materiaal, dat analyse van het fluïdum gedrag in het model 25 ingeschakeld. Het verspreiden van de spier bevestigingspunten onder een cluster van lokale nodes zou de piek krachten te verdelen en nauwkeuriger vertegenwoordigen de spier inbrengen voor bepaalde spieren. ent &quot;&gt; Het gebruik van FE maakt een evaluatie van de stammen en de spanningen die op een structuur. Als een techniek die het vaak wordt gebruikt in vele bioscience disciplines, zoals orthopedie, paleontologie en meer recentelijk ontwikkelingsbiologie. Hier beschrijven we hoe te bouwen in Fes voor de zebravis onderkaak. in de toekomst deze modellen kunnen worden uitgebreid om te kijken naar de gehele kaak, waaronder het gehemelte. Soortgelijke technieken kunnen worden gebruikt om spinale biomechanica bij vissen, die tot dusver grotendeels bestudeerd door middel kinematische model.

Eindige Elementen (FE) modellering is een engineering techniek die computationeel kan berekenen en in kaart de omvang en locatie van de stammen die op een structuur 1. Het model bestaat uit de 3D-structuur, vertegenwoordigd door een netwerk van &quot;Eindige Elementen&quot;, en het resultaat van de analyse wordt geregeld door een aantal factoren, waaronder de structuur en het aantal elementen in het netwerk, de grootte en locatie van de mechanische belastingen en de materiaaleigenschappen. Materiaaleigenschappen beschrijven bepaalde aspecten van het gedrag van een materiaal onder een bepaalde soort lading; Young&#39;s modulus (E) beschrijft de elasticiteit van het materiaal terwijl Poisson beschrijft de evenredige afname van de breedte van een materiaal om zijn lengte wanneer een monster wordt uitgerekt. FE modellering kan worden gebruikt om een ​​verscheidenheid van variabelen, zoals verplaatsing, spanning, druk en spanning inwerkt op het model berekend door rekening te houden met de unieke invoergegevens over de structuur &#39;; S vorm, de locatie en de omvang van de lading en de specifieke eigenschappen van het materiaal. FE modellering wordt veel gebruikt in de engineering 2 en in toenemende mate voor orthopedische 3 en paleontologische toepassingen 4. In ontwikkeling biomechanische krachten bekend als stimulans in vele cellen celresponsen 5-8 activeren en het is nuttig om zowel de relatieve posities en grootten van mechanische stimuli in ontwikkelingslanden orgaansystemen voorspellen echter nog FE modellering is weinig gebruikt geweest voor de ontwikkeling van de zebravis. Zowel kraakbeen en bot is aangetoond dat mechanosensitieve materialen. Zo heeft in vitro compressie gebleken chondrogene paden activeren, terwijl spanning wordt aangetoond noodzakelijk botvorming 9 zijn. FE-analyse (FEA) is uitgebuit om spanningen te modelleren die op biologische monsters, met inbegrip van die inwerken op het skelet elementen tijdens bot formatie 10. Andere ontwikkeling wordt hier gebruik van om de vorm van een gemeenschappelijke voorspellen nadat deze theoretische biomechanische krachten 11,12 blootgesteld en het patroon van spanningen tijdens kuiken kniegewricht morfogenese 8 aanwezig vertonen. Dit protocol is voor het delen van de ervaring van het genereren van 3-dimensionale oppervlakken, mazen en eindige elementen model van confocale beelden met het oog op het begrijpen van het mechanisme van ontwikkelende weefsels. We tonen ook aan manieren om het valideren van de FE-modellen al het vastleggen van echte gezamenlijke verplaatsing informatie in vivo. Terwijl we de zebravis kaak als voorbeeld dezelfde technieken kunnen worden gebruikt op elke kleine biologisch systeem waarvoor 3D informatie over de structuur van het bewegingsapparaat kan worden verkregen door confocale beeldvorming of multifoton.

<table><tbody><tr><td>Coll2</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>Type II collagen antibody - stains all cartilage</td></tr><tr><td>A4.1025 / MF20</td><td>Developmental studies hybridoma bank</td><td>A4.1025</td><td>Skeletal mysoin antibody - marks all skeletal muscle&nbsp;</td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9414-5G</td><td>Voor het bevestigen van zebravissen</td></tr><tr><td>MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate )</td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>Om verdovingsmiddel te maken</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Fisher</td><td>T/3760/48</td><td>Staaldoorlaatbaarheid</td></tr><tr><td>Dylight 488 Mouse IgG</td><td>Thermofisher</td><td>35502</td><td>Secundaire antilichaam</td></tr><tr><td>Dylight 550 Rabbit IgG</td><td>Thermofisher&nbsp;</td><td>84541</td><td>Secundaire antilichaam</td></tr><tr><td>SP8/SP5 of SPE confocal</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>Voor beeldvorming&nbsp;</td></tr><tr><td>LAS Leica capture software</td><td>Leica</td><td></td><td>Beeldvormingssoftware</td></tr><tr><td>Aviso (versie 7.0.0)</td><td>FEI Visualization Science Group</td><td></td><td>3D beeldanalysesoftware (Sectie 2)</td></tr><tr><td>Hypermesh onderdeel van het Hyperworks-pakket (versie 10)</td><td>Altair Engineering</td><td></td><td>FE-model genererende software (Sectie 4-5)</td></tr><tr><td>Abaqus (versie 6.14)</td><td>SIMULIA</td><td></td><td>FE-analysesoftware (Sectie 5.7-5.8)</td></tr></tbody></table>

het bouwen van finite element modellen te onderzoeken zebravis jaw biomechanica

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Skeletmorfogenese vindt plaats door nauwkeurig gereguleerde celgedragingen tijdens de ontwikkeling; veel celtypen veranderen hun gedrag als reactie op mechanische spanning. Skelettakjes worden onderhevig aan dynamische mechanische belasting. Eindige-elementenanalyse (FEA) is een computationele methode, vaak gebruikt in de techniek, die kan voorspellen hoe een materiaal of structuur zal reageren op mechanische input. Door een geheel systeem (in dit geval het kaakskelet van de zebravis) op te delen in een netwerk van kleinere 'eindige elementen', kan FEA worden gebruikt om de mechanische reactie van de structuur op externe belastingen te berekenen. De resultaten kunnen op veel manieren worden gevisualiseerd, inclusief als een 'warmtekaart' die de positie van maximale en minimale hoofdspanningen toont (een positieve hoofdspanning geeft spanning aan, terwijl een negatieve compressie aangeeft. De maximum en minimum verwijzen naar de grootste en kleinste spanning). Deze kunnen worden gebruikt om te identificeren welke delen van de kaak en dus welke cellen waarschijnlijk onder bijzonder hoge spannings- of compressiebelastingen zijn tijdens kaakbewegingen en kunnen daarom worden gebruikt om relaties tussen mechanische spanning en celgedrag te identificeren. Dit protocol beschrijft de stappen om Eindige-Elementenmodellen te genereren uit confocale beeldgegevens over het bewegingsapparaat, met behulp van de onderkaak van de zebravis als praktisch voorbeeld. Het protocol leidt de lezer door een reeks stappen: 1) het kleuren van de bewegingsapparatuurcomponenten, 2) het beelden van de bewegingsapparatuurcomponenten, 3) het bouwen van een driedimensionaal (3D) oppervlak, 4) het genereren van een netwerk van Eindige Elementen, 5) het oplossen van de FEA en ten slotte 6) het valideren van de resultaten door vergelijking met werkelijke verplaatsingen gezien in bewegingen van de vissenkaak.

Immunokleuring voor spier (figuur 1A) en kraakbeen (Figuur 1B) of beeldvorming van transgene reporters (figuur 1C) kan de 3D-structuur van de kaak worden gevisualiseerd, alsook aan de spiermassa. Bij beeldvorming met hoge resolutie is het mogelijk om een model dat zowel de driedimensionale vorm van de kaak (figuur 2) en de locatie en plaatsing van lasten (figuur 3) vangt bouwen. Gebruik makend van in vivo verplaatsingen gezien door high speed video-opname (figuur 4) hebben we vastgesteld dat het bereik van de beweging in het model was binnen een realistische bandbreedte. De FE modellen eenmaal aanloop kan worden gebruikt om een reeks gegevens, zoals stress (Figuur 5A), minimum en maximum hoofdrek (figuur 5B - K) weer. Deze resultaten zijn drie-<html> ensional zodat het model kan worden vergroot fijne patronen van detail (figuur 5E, 5I) te zien gedraaid relevante standpunten (Figuur 5F, 5G, 5J, 5K) en digitaal deelbaar (figuur 5E &#39;, 5E&#39; &#39;, 5I&#39;, 5I verkrijgen &#39;&#39;) te laten zien hoe de patronen van spanning, rek of drukverandering gehele model. Het is ook mogelijk om kwantitatieve gegevens uit het model (niet getoond). Door verificatie het model en met de meest nauwkeurige materiaaleigenschappen, belastingen en mesh vorm van de FE-model kan worden gebruikt om de beste schatting van de mechanische omgeving wordt ervaren door cellen in het raam van de ontwikkeling verkennen. De resultaten van het model kan direct worden vergeleken met veranderingen in cellulair gedrag en 20 genexpressie. <html> re 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1:. Vertegenwoordiger beelden van het bewegingsapparaat elementen van de zebravis onderkaak op 5 dpf Vertegenwoordiger confocale stapels van de onderkaak van 5dpf larven al getoond met anterior naar boven (A) Immunokleuring voor A4.1025 waarin alle skelet myosine vlekken (B) immunokleuring voor type II collageen waarin alle kraakbeen (C) Stapel markeert van een live-larve de uiting van de transgene verslaggevers COL2A1: mCherry markering kraakbeen (rood) en smyhc: GFP langzame spier (groen). IA: intermandibularis anterior, PH: gradenboog hyoideus, AM: adductor mandibulae, HI: hyoideus inferior, HI: hyoideus superieur, CH: sternohyoideus, MC: Meckel&#39;s kraakbeen, PQ: Palatoquadrate, CH:. Ceratohyal <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om te zien een grotere versie van dit cijfer.</a> &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> Figuur 2: Ontwikkeling van een 3D-oppervlak van confocale data Beelden die de overgang van de confocale gegevens in een 3D-oppervlak voor de zebravis onderkaak met hogere vergroting van de gezamenlijke regio.. (A) Raw confocale gegevens; (B) Dataset na toepassing van een Gauss-filter; (C) Gefilterd overzicht; (D) 3D-oppervlak. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> Figuur 3: Representatieve mazen tonen beperkingen en kracht vectoren Vertegenwoordiger mazen voor een 5 DPF larve voor (A) de mond sluiten en.(B) mondopening. Witte stippen geven plaatsen waar het model beperkt en welke dimensies (bijvoorbeeld x en y of x, y en z). Witte lijnen duiden spier posities, met de vector van spierkracht aangegeven met witte pijlen. Rood geeft aan het kraakbeen en Geel de Interzone. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van aanvullend materiaal eerder gepubliceerd in Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> Figuur 4:. Gevoeligheid testen FE-model simuleert kaak verplaatsing in 5dpf zebravis voor verschillende kraakbeen en interzone Young&#39;s moduli. Kaak verplaatsing (open tot gesloten pm) wordt aangegeven op de kaak; opgenomen met de toets. Elk model (A - L) heeft een andere combinatie van kraakbeen (c = 1,1, 3,1 of 6,1 MPa) of interzone (i = 0,25, 0,5, 0,75 of 1 MPa) eigenschappen. Horizontale zwarte pijl wijst op de waarde van de kaak verplaatsing op het puntje van het kraakbeen van de Meckel (vertegenwoordigd door de verticale zwarte pijl). M en N stills uit video&#39;s van 5 DPF larven tonen minimum, dat wil zeggen, kaak gesloten (M) en het maximum, dat wil zeggen, kaak volledig open (N) met de twee boven elkaar (O) - witte lijn op O staat voor de verplaatsing (van 43 pm). In dit geval is de relatieve kraakbeen eigenschappen van 1,1 met een Interzone van 0,25 (A) passen aan de verplaatsingen gezien in levende vissen (O). Panels AL van dit cijfer zijn eerder gepubliceerd in Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere vers bekijken</a>ion van dit cijfer. <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> Figuur 5: representatieve gegevens uit de FE-modellen FE-model simulatie van alle spieren aangebracht in een 5 DPF larve (A - C).. (A) Von Mises (EMaxmin) (B) Minimum Principal stam (E Min. P, μɛ) (C) Maximale belangrijkste stam (E Max. P., μɛ). FE-model simulatie van maximale en minimale hoofdrekken tijdens bekopening. (D - K): Maximaal principal stam (. E Max P., μɛ) in (D) ventrale kaak uitzicht en (E) ventrale gezamenlijke visie (E) toont locatie van proximale-distale doorsneden door het kraakbeen van de Meckel&#39;s gewricht en de Interzone in (E) en (E &#39;&#39;), respectievelijk. (F): lateralekaak uitzicht. (G): laterale gezamenlijke visie. (H - K): Minimum Principal stam (. E Min P, μɛ) in (H) ventrale kaak uitzicht en (I) ventrale gezamenlijke visie. (I) geeft locatie van het proximale distale secties via Meckel kraakbeen gewricht en interzone in (I) en (I &#39;&#39;) respectievelijk (J): laterale kaak view. (K): laterale gezamenlijke visie. Dit cijfer is eerder gepubliceerd in Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Aantal spiervezels </td><td> Spiervezels gebied (um 2) </td><td> Spiergroep area (um2) </td><td> Kracht (N) </td></tr><tr><td> 5 DPF intermandibularis anterior </td><td> 5 </td><td> 23.8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 DPF gradenboog hyoideus </td><td> 6 </td><td> 23.8 </td><td> 142,8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 DPF adductor mandibulae </td><td> 9 </td><td> 23.8 </td><td> 214.2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> Tafel 1: Muscle kwantificering. Berekende gemiddelde spierkrachten voor de Intermandibularis Anterior, Adductor mandibulae en gradenboog Hyoideus op 5 dpf met behulp van 40 nN / um 2 (waarde per oppervlakte-eenheid uit referentiewerken 17). (Lorga et al., 2011) (n = 3).

Finite Element Analysis is een veelgebruikt hulpmiddel om de mechanische prestaties van structuren onder belasting te onderzoeken. Hier passen we het toe op het modelleren van de biomechanica van de bek van de zebravis.

Het bouwen van Finite Element modellen te onderzoeken zebravis Jaw biomechanica

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Het algemene doel van deze modelleringsmethode is om de mechanische omgeving te simuleren die ontwikkelende kaken van zebravissen ervaren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het musculoskeletale vakgebied, zoals: hoe veranderen patronen van mechanische belasting in de loop van de tijd? En hoe stimuleren deze belastingen het celgedrag?Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om patronen van genexpressie en veranderingen in het celgedrag te analyseren in de context van de mechanische omgeving. Deze methode kan inzicht bieden in de skeletontwikkeling. Het kan ook worden toegepast op elke andere biologische structuur die aan mechanische belasting wordt blootgesteld, zoals de skeletelementen bij hogere gewervelden of het cardiovasculaire systeem.Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn aan deze methode problemen ondervinden, omdat de terminologie en software uitgaan van een achtergrond in engineering. Om de vorm van de skeletelementen te visualiseren, de spiermassa te kwantificeren en de exacte positie van de spieraanhechtingen te identificeren, dient de vis op de juiste leeftijd te worden immunogekleurd voor skeletmyosine en type II collageen. Fixeer eerst een vislarve gedurende één uur in 4% paraformaldehyde en PBS.Was vervolgens het fixeermiddel af met twee PBT-wasbeurten. Dehydrateer daarna de larve gedurende vijf minuten in 50% methanol en PBT, gevolgd door vijf minuten in 100% methanol. De larven kunnen vervolgens worden bewaard in 100% methanol tot ze nodig zijn.Rehydrate de larve indien nodig gedurende vijf minuten in 50% methanol en PBT. Was de larve vervolgens vijf minuten in PBT. Permeabiliseer de larve daarna op ijs gedurende vijf tot zes minuten met 0,25% trypsine en PBT.Was het vervolgens gedurende vijf minuten in PBT en herhaal de PBT-wasstap nog drie keer. Voordat de antilichamen worden aangebracht, wordt de larve twee tot drie uur geblokkeerd in 5% serum en PBT. Incubeer de larve vervolgens in de aanbevolen verdunning van konijn anti-type II collageen en muis anti-myosine antilichamen met 5% serum en PBT.Voer deze incubatie gedurende één uur bij kamertemperatuur uit, of overnacht bij vier graden Celsius. Na het aanbrengen van de primaire antilichamen wordt de larve in totaal zes keer gewassen in PBT, gedurende 15 minuten per wasbeurt. Pas na de PBT-wasstappen een blokkeringsoplossing van 5% serum en PBT toe gedurende één of twee uur.Breng nu de secundaire antilichamen aan, waarbij de preparatie vanaf dit moment zoveel mogelijk in het donker wordt bewaard. Gebruik fluorescentie-gelabelde anti-muis en anti-konijn secundaire antilichamen in 5% serum en PBT. Was de larve na het aanbrengen van de secundaire antilichamen zes keer met PBT gedurende 10 minuten per wasbeurt.Elke larve die is gekleurd zoals beschreven, of fluorescerende tags tot expressie brengt, kan nu als volgt worden afgebeeld met een confocale microscoop. Maak een confocale beeldstack van het interessegebied met de 10x objectieflens met ongeveer 2,5x digitale zoom. Exciteer het groene en rode kanaal met een 488-nanometer laser en een 561-nanometer laser.Maak vervolgens afbeeldingen van 512 x 512 pixels met een z-vlakinterval van 1,3 microns en drie lijnmiddelingen. Ongeveer 100 z-secties zullen de stack vullen. Exporteer de gegevens als een TIFF-afbeeldingsstack.Open de TIFF-beeldstapel en bekijk alle kanalen in de geschikte software. Klik met de rechtermuisknop op het kraakbeenkanaal, selecteer orthoslice en klik op create. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op het kraakbeenkanaal, selecteer Image Processing, Smoothing And Denoising, kies het beeldfilter en schakel smoothing Gaussian in.Klik in de projectweergave met de rechtermuisknop op de gefilterde afbeelding en selecteer afbeeldingsegmentatie en kies vervolgens bewerk nieuw label. Maak voor elk materiaal, zoals kraakbeen en gewricht, een nieuw label aan. Selecteer vervolgens het kraakbeengebied van de afbeelding met de tool toverstaf terwijl de schakelaar voor alle plakjes (all slices) is ingeschakeld, en gebruik de penseeltool om ruis uit de contouren te verwijderen.Select vervolgens het gewrichtsgebied met de penseeltool, wijs dit toe aan异het gewrichtscomponent en herhaal deze handeling door het gehele gewricht. Om meerdere coupes tegelijk glad te maken, selecteert u Segmentatie in het bovenmenu en kiest u Gladmaken labels. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op de afbeelding en selecteer Oppervlak genereren om een 3D-oppervlakkerendering van het component te produceren.Klik nu op het gerenderde oppervlak en sla de gegevens op als een HMASCII-bestand voor de meshing-software. De generatie van het 3D-mesh is een cruciale stap bij het creëren van een goed model. Er moet een compromis worden gesloten tussen een mesh die de werkelijke vorm van de structuur die u modelleert representeert, zonder zoveel detail op te nemen dat er problematische elementen ontstaan, zoals elementen met een te kleine of te grote hoek.Om het maasnetwerk te genereren, importeert u het 3D-model in een geschikt softwarepakket. Gebruik de shrinkwrap-tool onder het 2D-menu om een tweedimensionaal maasnetwerk van het kraakbeen en de gewrichtsoppervlakken te genereren. Kies een elementgrootte tussen 1.5 en 2.5.Er kan een reeks oppervlakte-meshes van verschillende groottes worden gemaakt om 3D-mesh-optimalisatie uit te voeren. Om te garanderen dat de mesh continu is tussen de gewrichts- en kraakbeenoppervlakken, moeten alle elementen op de grens gemeenschappelijke knooppunten delen. Om dit te bereiken, verwijdert u het binnenste oppervlak van het gewricht, zodat er een holle buis overblijft.Gebruik de F2-functietoets voor de snelkoppeling naar het menu Elementen Verwijderen. Selecteer de elementen die verwijderd moeten worden. Pas de begrensknooppunten aan zodat deze overeenkomen met het kraakbeenoppervlak.Gebruik een combinatie van de functietoetsen F2, F3 en F6 om respectievelijk knooppunten te verwijderen, te verplaatsen en nieuwe elementen te maken. Dupliceer tenslotte het kraakbeenoppervlak bij het gewricht via het menu 'organize components' van de verzamelaar. Gebruik de functietoets F2 om alle elementen die geen deel uitmaken van het gewricht te verwijderen.Voer vervolgens kwaliteitscontroles uit door naar het paneel Check elements te gaan. Controleer het mesh op dubbele elementen, inserties en penetraties. Indien deze worden aangetroffen, bewerk ze dan via het tabblad Tools.Controleer de dihedrale hoeken via het tabblad 'utility' in de optie modelboom. Gebruik de Tetramesh-tool om een 3D-mesh te genereren vanuit de 2D-oppervlaktemeshes met verschillende elementgroottes. Vergelijk verschillende meshgroottes en selecteer het FE-model met de kleinste meshgrootte dat convergeert na verdere simulaties en waarbij de definitie van de kenmerken niet in het gedrang komt.Gebruik vervolgens de Distance-tool om de mesh te transformeren zodat het kaakmodel op schaal is. Zorg ervoor dat de kraakbeen- en gewrichtcomponenten in het model verbonden zijn door een samengevoegd model te exporteren of door ties te gebruiken. Pas vervolgens belastingen, randvoorwaarden en materiaaleigenschappen toe op het FE-model om de kaakfunctie te simuleren.Gebruik de gelabelde confocale stacks als leidraad om de spieren te definiëren. Wijs eerst knooppunten toe die overeenkomen met de aanhechtingspunten van de spieren. Creëer vervolgens vectoren tussen de knooppunten die de oorsprong en insertie van elke spier vertegenwoordigen.Nadat alle spieren zijn gedefinieerd, maakt u een geschiedenis-loadcollector aan en past u een Cload toe op elke spier. Specificeer de magnitude in newtons en wijs de bijbehorende vector toe. Wijs vervolgens de passende elastische isotrope materiaaleigenschappen toe, zoals bepaald in de literatuur.Maak vervolgens een boundary loadcollector aan en pas enkele initiële randvoorwaarden toe op het model. Selecteer de knopen die moeten worden beperkt en kies een factor voor de vrijheidsgraden die overeenkomt met het natuurlijke bewegingsbereik van de spier die door deze knopen wordt gedefinieerd. Maak nu voor elk type beweging dat gesimuleerd moet worden een load step aan.Select onder het analysemenu alle relevante belastingen en randvoorwaarden om de gespecificeerde beweging te simuleren. Selecteer vervolgens 'statisch' in het vervolgkeuzemenu. Exporteer het model vervolgens in een geschikt bestandsformaat, inclusief het netwerk (mesh), de belastingen, de randvoorwaarden en de materiaaleigenschappen.In dit geval wordt gekozen voor het INP-formaat. Laad vervolgens het model in de FE-analyse-software. Maak daar een taak voor het model aan en voer deze uit, en analyseer de output voor spanning, rek, verplaatsing en dergelijke.Selecteer drie tot zes transgene zebravislarven en anesthetiseer de larven licht met 0,02% MS-222 totdat ze niet meer reageren op aanraking, maar hun harten nog kloppen. Monteer de larven vervolgens zijdelings op dekglasplaatjes in lauwwarm, 1% laagsmeltende agarose in Danieau's oplossing. Verwijder daarna voorzichtig met een pincet de agarose rondom de kop en de kaak.Spoel vervolgens met een Pasteurpipet verse Danieau-oplossing over de kop van de larve om het anestheticum te verwijderen. Doe dit totdat de normale mondbewegingen hervatten. Gebruik nu movie-capture software om fluorescentie high-speed video's van de mondbewegingen op te nemen.Film met de hoogste framerate gedurende de benodigde tijd om meerdere cycli van het openen van de kaak vast te leggen. Analyseer vervolgens de maximale verplaatsing van de kaak. Selecteer de frames waarin de kaak het wijdst openstaat en meet de afstand tussen de voorzijde van het Meckel's kraakbeen en de bovenkaak.Het punt van de bovenkaak komt overeen met de punt van de zeefbeenplaat. Immunokleuring voor spieren en kraakbeen, of beeldvorming van transgene reporters, maakt het mogelijk om de 3D-structuur van de kaak te visualiseren, samen met de bijbehorende musculatuur. Door beeldvorming met een hoge resolutie was het mogelijk om een model te bouwen dat de driedimensionale vorm van de kaak vastlegt.Het model bevat belastingen waarvan de plaatsing en grootte zijn afgeleid van de confocale beelden van spier- en kraakbeen. Op basis van dit model is een reeks verschillende materiaaleigenschappen getest. Met behulp van in vivo verplaatsing, waargenomen via high-speed video-opnames, is één model geselecteerd dat deze bewegingsuitslag het beste reproduceert.Met behulp van de meest accurate materiaaleigenschappen, belastingen en maasvormgegevens werd het FE-model gebruikt om de beste schatting te maken van de mechanische omgeving tijdens dit tijdsbestek. Zo werden bijvoorbeeld de grootten van de spanning gemeten. Het model kan worden vergroot om de fijne details van het patroon te bekijken, waarna digitale doorsneden kunnen worden geanalyseerd om de details in alle dimensies te observeren.Na het bekijken van deze video heeft u een goed begrip van hoe u confocale beeldvorming kunt gebruiken om een fysiologisch accuraat 3D-model te bouwen van een biologische structuur die onder mechanische belasting staat. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat dit een lineair, elastisch model is en dat kraakbeen zich niet geheel als een lineair materiaal gedraagt. Andere materiaaleigenschappen, zoals permeabiliteit, kunnen worden geïncorporeerd, maar vereisen mogelijk verdere aanpassingen aan het mesh.

building-finite-element-models-to-investigate-zebrafish-jaw

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De zebravis bovenkaak barbeel is een integumentary zintuig met ectodermale, mesodermale en de neurale lijst derivaten. Belangrijker nog is dat de volwassen barbeel regenereren na proximale amputatie. Deze video introduceert maxillaire barbeel ontwikkeling en demonstreert een chirurgische protocol voor regeneratie te induceren, gevolgd door de collectie, inbedding en stroomafwaarts beeldvorming van barbeel exemplaren.

Methoden voor de Studie van de zebravis bovenkaak Barbel

Time-lapse confocale beeldvorming is een techniek nuttig voor het karakteriseren van embryonale ontwikkeling. Hier beschrijven we de methode karakteriseren craniofaciale morfogenese in wildtype en PDGFRA, Smad5 en SMO mutant embryo's.

Het analyseren Craniofacial Morphogenesis in zebravis behulp 4D confocale microscopie

De zebravis embryo is een uitstekend model voor ontwikkelingsbiologie onderzoek. Tijdens de embryogenese, zebravissen ontwikkelen met een dooier massa, die driedimensionale uitdagingen voor monster observatie en analyse presenteert. Dit protocol beschrijft hoe twee-dimensionale platte mount voorbereidingen van ganse berg in situ (WISH) gekleurd zebravis embryo exemplaren maken.

Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

De zebravis is een uitstekend modelsysteem voor genetische en ontwikkelingsstudies. Het implanteren van kralen is een waardevolle techniek voor weefselmanipulatie die kan worden gebruikt om ontwikkelingsmechanismen te onderzoeken door veranderingen in lokale cellulaire omgevingen te introduceren. Dit protocol beschrijft hoe microkralenimplantatie in de zebravis-embryo moet worden uitgevoerd.

Microkraal Implantatie in de zebravis embryo

Het doel van dit protocol is te wijzigen van de doordringendheid van dodelijke skelet mutant fenotypen in zebrafish door selectief fokken. Dodelijke mutanten naar volwassenheid kunnen niet worden gekweekt en zelf gefokt, dus dit protocol beschrijft een methode voor het bijhouden en selecteren doordringendheid door meerdere generaties nakomelingen testen.

Zebravis dodelijke skelet Mutant doordringendheid verschuiven door nakomelingen testen

Hier beschrijven we 3 volwassen zebrafish letsel modellen en hun gecombineerd gebruik met immunosuppressieve medicamenteuze behandeling. Wij bieden begeleiding over de beeldvorming van het herstel van de weefsels en bot mineralisatie daarin opsporen.

Volwassen Zebrafish letsel modellen te bestuderen van de effecten van prednisolon in het herstel van botweefsel

Dit protocol beschrijft het oogsten en visualiseren van elasmoid schubben van zebravissen tijdens in vivo regeneratie. Bovendien wordt de ex vivo cultuur van deze schubben tot 7 dagen na de oogst gepresenteerd.

Zebravis Scale Regeneratie In Toto en Ex Vivo Kweek van Schubben

Dit protocol biedt een methode om cellulaire dynamica te bestuderen met behulp van een eenvoudige in vitro kweektechniek. Het biedt zebravisonderzoekers en -opvoeders de mogelijkheid om cellulaire processen te bestuderen, zoals die gerelateerd aan bothomeostase en basale celbiologie, door fluorescerende kernen en apoptotische cellen binnen de schalen te visualiseren.

In vitro kweektechniek voor het bestuderen van cellulaire dynamica in zebravisschubben

Het hier beschreven protocol presenteert een eenvoudige en gemakkelijk te volgen procedure voor het kleuren en ontleden van craniofaciale kraakbeenderen in een 5 dagen oude zebravislarve. Het kan worden gebruikt om de anatomie, vorm en grootte van deze structuren onder verschillende ontwikkelingsomstandigheden te bestuderen.

Dissectie van Zebravis craniofaciale weefsels bij kleuring met Alcian Blue

Dit werk beschrijft een protocol voor het kwantificeren van de vorm van craniofaciaal kraakbeen met behulp van vrije software (tpsDigs2, MorphoJ en PAST) om veranderingen in gezichtsstructuur bij zebravislarven te meten.

Morfometrische analyses van vorm: De analysesoftware-toolbox voor craniofaciale vormkwantificatie bij zebravissen

Verken eindige-elementenanalyse om de biomechanica van de ontwikkelende kaak van Danio rerio te simuleren. Deze methode onthult hoe mechanische belastingen celgedrag en skeletontwikkeling beïnvloeden.

Het bouwen van Finite Element modellen te onderzoeken zebravis Jaw biomechanica

Meer video's verkennen