Het visualiseren van de effecten van het sputum op biofilm ontwikkeling met behulp van een chambered dekglaasje Model

Het algemene doel van deze procedure is om veranderingen in biofilms te visualiseren en te kwantificeren als reactie op sputum en antibiotica. Deze methode kan worden gebruikt door onderzoekers om belangrijke vragen te begrijpen, zoals hoe de werkzaamheid van verschillende antibiotica tegen bacteriële biofilms kan worden beïnvloed door de aanwezigheid van sputum. Het grote voordeel van deze methodologie is dat het individuen in staat stelt veranderingen in biofilms te zien als reactie op verschillende factoren.

Om het experiment te beginnen, noteer het volume van de eerder verkregen sputummonster. Voeg fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS toe, tweemaal het volume van het monster. Gebruik vervolgens een overdrachtpijpje om het monster grondig te mengen.

Vortex het monster op de hoogste instelling gedurende één minuut om het volledig te mengen. Pipetteer een milliliter van het mengsel in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Draai vervolgens de buisjes neer.

Na centrifugatie, bewaar het supernatant en gooi de pellet weg. Filter steriliseer het supernatant door een 0,22 micron filter en verzamel het in een schone microcentrifugebuis. Bewaar het sputumsupernatant bij 80 graden Celsius voor toekomstig gebruik.

Plaats 40 microliters van eerder bereidde cultuur in vier milliliter verse Luria bouillon, of LB media, en laat de bacteriën groeien om een cultuur te verkrijgen met een optische dichtheid van 0,55 bij 600 nanometer. Verdun vervolgens 100 microliters van 0,5 OD cultuur in 400 microliters van bereide 10% sputumfiltraten in LB. Gebruik 200 microliters van de verdunning om de putjes van de glijbaankamers te zaaien. Laat de bacteriën vier uur bij 37 graden Celsius hechten zonder te schudden.

Na vier uur, verwijder het medium en was de biofilm voorzichtig met 1X verse LB. Vervang het resterende medium met 200 microliters verse LB. Laat de biofilms groeien bij 37 graden Celsius zonder te schudden. Vervang het medium elke 12 uur zonder te wassen totdat de biofilm klaar is voor microscopie. Het is erg belangrijk om de dia's voorzichtig te wassen om geen aangehechte bacteriën te verstoren.

Na de groei, verwijder het medium uit de kamerputjes en was elke kamer twee keer voorzichtig met 300 microliters steriele PBS. Vervolgens, om de biofilmkleuringsmix voor te bereiden, voeg een microliter van elke kleurstof toe die in de levensvatbaarheidskit is geleverd aan elke milliliter van de benodigde oplossing en meng de oplossing. De optimale hoeveelheid kleurstof en kleuringstijd wordt empirisch bepaald voor elk organisme.

Voeg 200 microliters van de kleuringsmix toe aan elk putje van de kamerdekglas. Incubeer het dekglas. Verwijder na de incubatie de kleuringsmix uit de kamers en was elk putje met 300 microliters steriele PBS.

Vervang de PBS door vers medium. Ten slotte, ga door met visualisatie via confocale microscopie. Representatieve beelden van Burkholderia cepacia complex, of BCC klinische isolaten, na 48 uur groei in kamerdekglas met alleen medium of in aanwezigheid van 10% sputumfiltraten, tonen aan dat hun aanwezigheid de architectuur van de biofilm kan veranderen.

De beelden werden geanalyseerd met Comstat-software om belangrijke biofilmparameters te verkrijgen, inclusief de gemiddelde dikte van de biofilm, die werd verhoogd bij behandeling met 10% sputum. Om de effecten van verschillende factoren op biofilmgroei te waarderen, werden klinische isolaten gekweekt in alleen medium of met sputum en beide werden behandeld met of zonder antibioticum. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u biofilms op kamerdekglas kunt vormen en behandelen en ze kunt voorbereiden voor kleuring en confocale analyse.