Het visualiseren van de effecten van het sputum op biofilm ontwikkeling met behulp van een chambered dekglaasje Model
December 14th, 2016
Dit protocol beschrijft de visualisatie van de ontwikkeling van biofilms na blootstelling aan gastfactoren met behulp van een glijkamermodel. Dit model maakt directe visualisatie van de ontwikkeling van biofilms mogelijk, evenals analyse van biofilmparameters met behulp van computersoftwareprogramma's.
Het algemene doel van deze procedure is om veranderingen in biofilms te visualiseren en te kwantificeren als reactie op sputum en antibiotica. Deze methode kan worden gebruikt door onderzoekers om belangrijke vragen te begrijpen, zoals hoe de werkzaamheid van verschillende antibiotica tegen bacteriële biofilms kan worden beïnvloed door de aanwezigheid van sputum. Het grote voordeel van deze methodologie is dat het individuen in staat stelt veranderingen in biofilms te zien als reactie op verschillende factoren.
Om het experiment te beginnen, noteer het volume van de eerder verkregen sputummonster. Voeg fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS toe, tweemaal het volume van het monster. Gebruik vervolgens een overdrachtpijpje om het monster grondig te mengen.
Vortex het monster op de hoogste instelling gedurende één minuut om het volledig te mengen. Pipetteer een milliliter van het mengsel in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes. Draai vervolgens de buisjes neer.
Na centrifugatie, bewaar het supernatant en gooi de pellet weg. Filter steriliseer het supernatant door een 0,22 micron filter en verzamel het in een schone microcentrifugebuis. Bewaar het sputumsupernatant bij 80 graden Celsius voor toekomstig gebruik.
Plaats 40 microliters van eerder bereidde cultuur in vier milliliter verse Luria bouillon, of LB media, en laat de bacteriën groeien om een cultuur te verkrijgen met een optische dichtheid van 0,55 bij 600 nanometer. Verdun vervolgens 100 microliters van 0,5 OD cultuur in 400 microliters van bereide 10% sputumfiltraten in LB. Gebruik 200 microliters van de verdunning om de putjes van de glijbaankamers te zaaien. Laat de bacteriën vier uur bij 37 graden Celsius hechten zonder te schudden.
Na vier uur, verwijder het medium en was de biofilm voorzichtig met 1X verse LB. Vervang het resterende medium met 200 microliters verse LB. Laat de biofilms groeien bij 37 graden Celsius zonder te schudden. Vervang het medium elke 12 uur zonder te wassen totdat de biofilm klaar is voor microscopie. Het is erg belangrijk om de dia's voorzichtig te wassen om geen aangehechte bacteriën te verstoren.
Na de groei, verwijder het medium uit de kamerputjes en was elke kamer twee keer voorzichtig met 300 microliters steriele PBS. Vervolgens, om de biofilmkleuringsmix voor te bereiden, voeg een microliter van elke kleurstof toe die in de levensvatbaarheidskit is geleverd aan elke milliliter van de benodigde oplossing en meng de oplossing. De optimale hoeveelheid kleurstof en kleuringstijd wordt empirisch bepaald voor elk organisme.
Voeg 200 microliters van de kleuringsmix toe aan elk putje van de kamerdekglas. Incubeer het dekglas. Verwijder na de incubatie de kleuringsmix uit de kamers en was elk putje met 300 microliters steriele PBS.
Vervang de PBS door vers medium. Ten slotte, ga door met visualisatie via confocale microscopie. Representatieve beelden van Burkholderia cepacia complex, of BCC klinische isolaten, na 48 uur groei in kamerdekglas met alleen medium of in aanwezigheid van 10% sputumfiltraten, tonen aan dat hun aanwezigheid de architectuur van de biofilm kan veranderen.
De beelden werden geanalyseerd met Comstat-software om belangrijke biofilmparameters te verkrijgen, inclusief de gemiddelde dikte van de biofilm, die werd verhoogd bij behandeling met 10% sputum. Om de effecten van verschillende factoren op biofilmgroei te waarderen, werden klinische isolaten gekweekt in alleen medium of met sputum en beide werden behandeld met of zonder antibioticum. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u biofilms op kamerdekglas kunt vormen en behandelen en ze kunt voorbereiden voor kleuring en confocale analyse.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft de visualisatie en kwantificering van biofilmontwikkeling als reactie op sputum en antibiotica met behulp van een slide chamber model. Dit model maakt directe observatie van biofilmveranderingen mogelijk en staat gedetailleerde analyse toe met behulp van computersoftware.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Biofilmonderzoek
- Antibiotica-effectiviteit
Achtergrond
- Biofilms zijn complexe gemeenschappen van micro-organismen.
- Inzicht in de reactie van biofilms op antibiotica is cruciaal voor behandelingsstrategieën.
- Sputum kan de effectiviteit van antibiotica tegen biofilms beïnvloeden.
- Deze studie is erop gericht deze interacties effectief te visualiseren.
Doel van het onderzoek
- Om veranderingen in biofilms als gevolg van sputum en blootstelling aan antibiotica te visualiseren.
- Om de impact van hostfactoren op biofilmontwikkeling te kwantificeren.
- Om het begrip van de effectiviteit van antibiotica tegen biofilms te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Verzameling van sputummonsters.
- Verdunning van sputum met fosfaat-gebufferd zout (PBS).
- Mengen van monsters voor uniformiteit.
- Visualisatie van biofilmontwikkeling met behulp van een slide chamber model.
Belangrijkste resultaten
- Directe visualisatie van biofilmveranderingen als reactie op antibiotica.
- Kwantitatieve analyse van biofilmparameters.
- Inzichten in de interactie tussen sputum en biofilmreactie.
- Demonstratie van de effectiviteit van verschillende antibiotica.
Conclusies
- Het slide chamber model is effectief voor het bestuderen van biofilmdynamiek.
- Hostfactoren zoals sputum hebben significante invloed op het gedrag van biofilms.
- Deze methodologie kan toekomstige antibioticabehandelingsstrategieën informeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative visualization of biofilm development in the presence of host-derived sputum and antibiotics addresses a critical challenge in anti-infective discovery and translational model fidelity. This approach enables mechanistic de-risking by revealing how host factors modulate antibiotic efficacy and biofilm architecture, informing early-stage target validation and screening strategies. The method supports predictive confidence for portfolio decisions in infectious disease R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding host factor influence on biofilm resilience.
- Supports biological de-risking by quantifying biofilm response to antibiotics in disease-relevant matrices.
- Facilitates functional target validation by measuring biofilm viability and architecture under defined conditions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biofilm systems for downstream compound screening in the presence of clinically relevant factors.
- Standardizes assay conditions for reproducibility and quantitative comparison across experimental arms.
- Generates robust, quantitative outputs such as biofilm thickness and viability for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro biofilm models with disease-relevant host environments, enhancing translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by revealing antibiotic performance in complex biological matrices.
- Provides mechanistic insight into host-pathogen-drug interactions for predictive de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
This chambered coverglass model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of antibiotic efficacy in host-mimetic biofilm systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on host factor impact and pathway clarification in biofilm development.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound prioritization in biofilm contexts.
- Analytics: Provides image-based measurements and statistical outputs for cross-condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by incorporating disease-relevant matrices.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for repeated evaluation of anti-biofilm strategies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in anti-infective R&D.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of biofilm assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by revealing context-dependent drug efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on performance in host-mimetic systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biofilm culture, confocal microscopy, and quantitative image analysis.
- Needs access to chambered coverglass systems, viability staining kits, and analytical software such as Comstat.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- May require adaptation for different bacterial species or host-derived matrices.
- Dependent on empirical optimization of staining and imaging parameters for each organism.
