Name: Het visualiseren van de Interrenal steroïdogene Tissue en haar Vasculaire Microenvironment in zebravis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Leer een snelle enzymatische kleuring om interrenale steroïdogene cellen in Danio rerio te detecteren. Deze methode ondersteunt genetische en chemische screenings voor endocriene ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Prof. Christoph Englert en Prof. Didier Stainier voor gifting de Tg (wt1b: GFP) LI1 en Tg (kdrl: EGFP) s843 stammen, respectievelijk, en de Taiwan zebravis Core Faciliteit voor het verstrekken van Tg (kdrl: mCherry) CI5. Deze studie werd ondersteund door subsidies van het ministerie van Wetenschap en Technologie (96-2628-B-029-002-my3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-my3 Taiwan, 102- 2321-B-400-018).

Ethiek Verklaring: Alle experimentele procedures op zebravis werden door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van Tunghai University goedgekeurd (IRB Goedkeuring NO 101-12.) En in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen uitgevoerd. 1. Voorraadoplossingen voor 3β-Hsd Enzymatische Activiteit Kleuring <ol><li> Bereid trans-dehydroandrosterone [10 mg / ml in dimethylsulfoxide (DMSO)]. </li><li> Bereid β-nicotinamide adenine dinucleotide hydraat (1,2 mg / ml in 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,2). </li><li> Bereid nicotinamide (vitamine B3, 50 mg / ml in H 2 O). </li><li> Bereid 4-nitro blue tetrazolium (50 mg / ml in 70% dimethylformamide). </li><li> Aliquot al deze componenten in microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C. LET OP: In onze ervaring, herhaalde invriezen en ontdooien van de monsters van alle bovengenoemde oplossingen niet van invloed op de intensiteit van de 3β-Hsd activiteit kleuring. </li></ol> 2. whole-mount 3β-Hsd Activity kleuring OPMERKING: De 3β-Hsd enzymatische activiteit detecteerbaar in zebravisembryo al 28 uur na de bevruchting (HPF) wanneer gekweekt bij 28,5 ° C, wat overeenkomt met het begin van mRNA expressie van hsd3b1 2,7. Het gehele mount 3β-Hsd activiteit kleuringsprotocol in deze studie is gebaseerd op een eerder beschreven werkwijze en 8 werd bepaald tot 7 dagen na de bevruchting 9 succesvol in de zebravisembryo zijn. Voor het analyseren van de vasculaire micromilieu van de interrenal steroidogene weefsel geheel gemonteerde 3β-Hsd activiteit kleuring moet worden toegepast om transgene lijnen tot expressie endotheel-specifieke fluorescentie, zoals Tg (kdrl: EGFP) s843 14 en Tg (kdrl: mCherry) CI5 15 . Om de interrenal steroidogenic weefsel overweegt ontwikkeling van de zebravis nier te analyseren, kan 3β-Hsd activiteit kleuring toepas zijned aan de Tg (wt1b: GFP) LI1 vis 16, waarbij de vorming van de glomerulus en pronephric buisjes wordt afgebakend. <ol><li> Behandel het zebravisembryo door ze te incuberen in 0,03% fenylthioureum in ei water (0,06 mg / l rif zout in gedeïoniseerd water), uitgaande van een fase tussen 12 en 24 HPF, pigment te remmen. </li><li> Fix dechorionated embryo&#39;s of larven in (A) 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 0,1% Tween 20 (PFAT) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (KT) of (B) 2% PFAT overnacht bij 4 ° C of gedurende 2 uur bij 4 ° C, gevolgd door 4 uur bij KT. Let op: PFA is giftig bij inademing en bij contact met de huid. Het is vernietigend voor de huid, slijmvliezen, de ogen, en de bovenste luchtwegen. </li><li> Was de embryo 4x gedurende 10 min met PBS aangevuld met 0,1% Tween 20 (PBST) bij kamertemperatuur. LET OP: Het is cruciaal om niet de monsters te drogen tijdens het verwisselen van de wasoplossingen. </li><li> Vers de voorbereiding van de staining oplossing voor de reacties (tabel 1). Bereid, draaikolk, en centrifuge onderdelen A en B in aparte buizen. LET OP: Het toevoegen van alle onderdelen rechtstreeks in één enkele buis zou ernstige neerslag veroorzaken. </li><li> Voeg de volledige oplossing van deel A om de volledige oplossing van deel B, goed mengen met de kleuring te bereiden, en meteen distribueren 1 ml in elk microfugebuis met vaste en gewassen embryo&#39;s. </li><li> Wikkel microfuge buizen met aluminiumfolie om ze te beschermen tegen licht en leg ze op ofwel een rotator of een schommelende platform voor zacht schudden bij kamertemperatuur. </li><li> Empirisch de reactietijd door het monitoren van chromogene signalen via microscopie bepalen. Lichte neerslag zal ontwikkelen in de tijd; echter zullen ze niet interfereren met de reactiewerkwijze. OPMERKING: Bij embryo&#39;s bij 28 HPF, kleuring voor 4 uur gefixeerd bij 25 ° C levert een duidelijk signaal aan de interrenal weefsel. </li><li> Stop de reactie door het wassen 4x gedurende 10 min in PBST. ikf aanvulling immunohistochemische analyse (IHC) vereist post-fix de gekleurde embryo&#39;s met 4% PFAT gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Anders, bewaar het embryo gewassen bij 4 ° C tot verder gebruik. </li><li> Voor de hele-mount microscopie, schakelt de gekleurde, post-gefixeerd en gewassen embryo&#39;s met 50% glycerol in PBS, oriënteren ze met de dorsale zijde naar boven op een dia, en observeer het gebruik van een rechtopstaande microscoop onder helderveld verlichting. LET OP: Om een ​​hoge-resolutie afbeelding van de interrenal weefsel morfologie, een flatscreen-mount analyse van de 3β-Hsd activiteit gekleurd en deyolked embryo wordt aanbevolen. Zoals de interrenal steroidogenic weefsel wordt geplaatst precies boven de dooierzak, een ventrale flat-mount analyse van de interrenal weefsel zorgt voor een directe en duidelijke observatie van de interrenal morfologie 17. </li></ol> 3. IHC Analyse van 3β-Hsd-activiteit gekleurd Embryo&#39;s NB: Voor het analyseren van de vasculaire micro-omgeving van de steroidogenic weefsel, de 3β-Hsd-activiteit gekleurd embryo&#39;s met een transgeen endotheel-specifieke tl-reporter worden onderworpen aan vibratome snijden en de daaropvolgende IHC analyse 12,18 dwars. <ol><li> Post-fixatie <ol><li> Post-fix de 3β-Hsd activiteit gekleurd en gewassen embryo&#39;s met 2% PFA aangevuld met 1% Triton X-100 gedurende 1 uur bij 4 ° C en wassen 4x gedurende 10 min in PBS bevattende 1% Triton X-100 (PBSTx) bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Inbedding <ol><li> Bereid 4% laagsmeltende agarose door oplossen van de agarose in PBS bij 95 ° C, aliquot in microfuge buizen en bewaar bij 4-8 ° C. </li><li> Smelt een hoeveelheid van 4% laagsmeltende agarose bij 70 ° C gedurende 10 min, dan zelf het monster bij 47 ° C. Insluiten elk embryo in gesmolten 4% laagsmeltende agarose in een vrijstaande dop van een 1,5 ml microfuge buis die dient als een matrijs, en laat afkoelen tot vaste stof. </li></ol></li><li> vibratome-Sectie <ol><li> Plak een stuk papier tape om de droge platform van de vibratome. </li><li> Verwijder de uitgeharde agarose blok uit de vorm van een scheermesje. Solliciteer superlijm aan het papier tape op het platform, en bevestig de agarose blok op het papier tape, met de voorste zijde van het monster naar boven. Trim de agarose blok een trapeziumvormige prisma vorm met circa 4 mm en 8 mm aan elke kant van de bovenste en onderste vlakken, respectievelijk. </li><li> Spoel het monster bevattende agarose blok met koude PBS aangevuld met 0,5% Triton X-100 (0,5% PBSTx) met behulp van een druppelaar. </li><li> Snijd de agarose blok in 100 micrometer secties volgens de handleiding van de vibratome. Voortdurend spoel de agarose blok om uitdroging te voorkomen. Zoals elke plak wordt gesneden, haal hem uit de vibratome met behulp van een 26 G injectienaald, en over te brengen naar een plek plaat met koude 0,5% PBSTx (500 ul / putje). </li><li> Verzamel de 3β-Hsd activiteit positieve weefselcoupes door het controleren van onder een dissectie microscoop, en de onderdelen over te dragen door een piPette tip met een afsluiting aan het einde (ongeveer 1 mm binnendiameter aan de opening) in een 96-well plaat met koude 0,5% PBSTx (150 gl / putje). De weefselmonsters meestal distantiëren van de agarose blok na deze stap. </li></ol></li><li> Permeabilisatie en Wassen <ol><li> Was de plakjes 6x gedurende 15 min in 0,5% PBSTx bij kamertemperatuur, 10 min in PBS en 4x gedurende 10 min in PBS aangevuld met 1% runderserumalbumine / 1% DMSO / 0,1% Triton X-100 (PBDTx). </li></ol></li><li> Het blokkeren <ol><li> Incubeer de plakken voor 1 uur in 2% foetaal kalfsserum (FCS) in PBDTx bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Primary Antibody Reaction <ol><li> Incubeer de plakjes van 1,5 dagen PBDTx met een primair antilichaam (bijvoorbeeld konijn polyklonaal anti-humaan fibronectine en muis anti-humaan focal adhesion kinase) bij 4 ° C. </li></ol></li><li> het wassen <ol><li> Was de plakjes 6x gedurende 10 min in PBDTx bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Het blokkeren <ol><li> Incubeer de plakken voor 1 uur in 2% FCS in PBDTx bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Secundair antilichaam Reaction <ol><li> Incubeer de plakjes van 1,5 dagen PBDTx met een secundair antilichaam (fluorofoor geconjugeerd geit anti-konijn of anti-muis IgG) bij 4 ° C. </li></ol></li><li> het wassen <ol><li> Was de plakjes 6x gedurende 10 min in PBDTx bij kamertemperatuur en 4x gedurende 10 min in PBST bij kamertemperatuur. NB: Voor confocale microscopische analyse, de monsters te wissen met 50% glycerol in PBS. </li></ol></li></ol> 4. Confocale Analyse <ol><li> Let op de hele berg embryo en de sectie door een confocale microscoop uitgerust met een 10x / 0,5 en 20X / 0.75 objectief. </li><li> Voor gelijktijdige detectie van de fluorescentie en 3β-Hsd kleuring, stel de multitrack functie als volgt: 488 nm argon laser en 505-530 nm banddoorlaatfilter voor de detectie van GFP; 543 nm Helium-Neon laser en 560-615 nm banddoorlaatfilter voor de opsporing van mCherry; en doorvallend licht kanaal voor de detectie van 3β-Hsd kleuring.De pinhole grootte is 1 Airey-eenheid, en de resolutie is 1024 x 1024 pixel. </li><li> Monteer de z-stacks (met 6 micrometer interval) als een 3D-projectie, en het samenvoegen van de projectie en de heldere veld, met behulp van de ingebouwde confocale software. </li></ol>

<ol><li>Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+early+development+of+zebrafish+interrenal+glands+and+pronephros%3A+differential+control+by+wt1+and+ff1b%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b.</a> Development. 130, 2107-2116 (2003).</li>
<li>To, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary-interrenal+interaction+in+zebrafish+interrenal+organ+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development.</a> Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).</li>
<li>Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrenal+organogenesis+in+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Interrenal organogenesis in the zebrafish model.</a> Organogenesis. 3, 44-48 (2007).</li>
<li>Cravioto, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+inherited+variant+of+the+3+beta-hydroxysteroid+dehydrogenase-isomerase+deficiency+syndrome%3A+evidence+for+the+existence+of+two+isoenzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes.</a> J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).</li>
<li>Lachance, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+3+beta-hydroxysteroid+dehydrogenase%2Fdelta+5-delta+4-isomerase+gene+and+its+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells.</a> J Biol Chem. 267, 3551(1992).</li>
<li>Simard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+the+3beta-hydroxysteroid+dehydrogenase%2Fdelta5-delta4+isomerase+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family.</a> Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).</li>
<li>Lin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+zebrafish+hsd3b+genes+are+distinct+in+function%2C+expression%2C+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution.</a> Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).</li>
<li>Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenocortical+and+adrenomedullary+homologs+in+eight+species+of+adult+and+developing+teleosts%3A+morphology%2C+histology%2C+and+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry.</a> Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).</li>
<li>Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ff1b+is+required+for+the+development+of+steroidogenic+component+of+the+zebrafish+interrenal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ.</a> Dev Biol. 260, 226-244 (2003).</li>
<li>Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prox1+is+a+novel+coregulator+of+Ff1b+and+is+involved+in+the+embryonic+development+of+the+zebra+fish+interrenal+primordium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium.</a> Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).</li>
<li>Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ff1b+is+required+for+the+development+of+steroidogenic+component+of+the+zebrafish+interrenal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ.</a> Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).</li>
<li>Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hemodynamically-regulated+vascular+microenvironment+promotes+migration+of+the+steroidogenic+tissue+during+its+interaction+with+chromaffin+cells+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo.</a> PLoS One. 9, e107997(2014).</li>
<li>Liu, Y. W., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium+is+required+for+the+promotion+of+interrenal+morphogenetic+movement+during+early+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development.</a> Dev Biol. 297, 44-58 (2006).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li>
<li>Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+vasculature+in+zebrafish+forms+by+angioblast+cluster-derived+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis.</a> Dev Biol. 348, 34-46 (2010).</li>
<li>Perner, B., Englert, C., Bollig, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wilms+tumor+genes+wt1a+and+wt1b+control+different+steps+during+formation+of+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros.</a> Dev Biol. 309, 87-96 (2007).</li>
<li>Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+mediates+correct+positioning+of+the+interrenal+organ+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish.</a> Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).</li>
<li>Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+fibronectin+signaling+requirements+of+the+zebrafish+interrenal+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel.</a> PLoS One. 7, e43040(2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen te declareren.

De signaalsterkte van de 3β-Hsd activiteit verhoogd in de loop van de reactie. Duidelijke signalen van de 3β-Hsd activiteit werden gedetecteerd na 4 uur reactie voor de fasen van 28 HPF verder. De reactieduur vereist empirisch bepalen, afhankelijk van het doel van de test. Indien de kleuring vereist nachts verwerking, een licht blauwachtige achtergrond ontwikkelt zich meestal op de monsters. Dit probleem kan worden ondervangen door de tijdsduur fixatie (bijvoorbeeld 4 uur in 4% PFAT bij KT) vóór de verhoging 3β...

De bijnier, een cruciaal onderdeel van de hypothalamus-hypofyse-bijnier as, scheidt steroïden en coördineert steroïde homeostase en de lichamelijke reactie op stress. De bijnier omvat de buitenste cortex, die steroïden scheidt in een zone-specifieke wijze en binnenste medulla, die catecholamines synthetiseert. De interrenal klier in teleosten is de tegenhanger van de bijnier bij zoogdieren en is samengesteld uit steroidogenic interrenal en chromaffiene cellen, die functionele equivalenten van de bijnierschors en merg, respectievelijk 1-3 zijn. Studies uitgevoerd met het zebravismodel hebben gemeld dat zowel steroidogenic en chromaffine cellijnen gevormd door moleculaire en cellulaire mechanismen die sterk lijken op die bij zoogdieren 1,2. Daarom is de zebravis is een potentieel krachtig model voor het bestuderen van genetische aandoeningen, neuro-endocriene controle en systeembiologie van de hypothalamus-hypofyse-bijnier (interrenal) as. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; In de bijnier, 3β-Hsd katalyseert de omzetting van progesteron uit pregnenolon, 17α-hydroxyprogesteron van 17α-hydroxypregnelolone en androstenedione uit dehydroepiandrosterone 4,5. 3β-Hsd is essentieel voor de biosynthese van alle klassen van hormonale steroïden, namelijk progesteron, glucocorticoïden, mineralocorticoïden, androgenen en oestrogenen. De twee menselijke 3β-Hsd isozymen HSD3B1 en HSD3B2 zijn differentieel tot expressie 6. HSD3B1 wordt uitgedrukt in de placenta en perifere weefsels, terwijl HSD3B2 uitgedrukt in de bijnierschors en de geslachtsklieren. Human HSD3B1 en HSD3B2 zijn co-orthologen van zebravis hsd3b1, die wordt uitgedrukt in het interrenal weefsel en volwassen geslachtsklieren; zebravis hsd3b2 is een voor het moederdier uitgedrukt gen waarvan de transcripten verdwijnen voordat organogenese 7. Het protocol van de hele-mount 3β-Hsd enzymatische activiteit test voor zebravis ontwikkeld door aanpassing Levy methode, eens beschreven door Milano et al. Op vriescoupes acht teleost species 8. Door het weefsel permeabiliteit en optische transparantie van het zebravisembryo, whole-mount 3β-Hsd histochemie succes kan worden gebruikt voor de vaste zebravis embryo&#39;s en larven en specifiek toespitsen op het gedifferentieerde interrenal weefsels. Deze gevoelige en snelle test is toegepast op verschillende mutanten en morphants tonen verschillende interrenal dysmorfogenese. De interrenal 3β-Hsd activiteit afwezig is in het embryo, waar specificatie van de interrenal weefsel wordt verstoord door een specifieke knockdown van de Ff1b transcriptiefactor en daalt als de interrenal differentiatie wordt beïnvloed door een knockdown van de Ff1b coregulator Prox-1 9,10. Met name kan de 3β-Hsd-activiteit worden gedetecteerd in mutanten met ernstige vroeg gebreken zoals eenogige pinhead en turen, waarbij de 3β-Hsd histochemie schetst hoe de interrenal celmigratie wordt aangetast 11. De differentiatie van de interrenal weefsel wordt niet aangetast, zelfs in de volledige afwezigheid van bloed en vaatstelsel. Daarom, hoe-endotheel afgeleide signalen geven vorm aan de ontwikkeling van interrenal orgaan kan worden bepaald 12,13. Kortom, deze histochemische assay is met succes gebruikt voor het bestuderen van de specificatie, differentiatie en migratie van steroidogenic cellen in de zebravis model. Daarom moet een efficiënt en betrouwbaar middel voor genetische of chemische screens gericht bijnieren interrenal orgaan stoornissen.

<table><tbody><tr><td>Confocal microscope</td><td>Carl Zeiss&nbsp;</td><td>LSM510&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>USB</td><td>US16374</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Calf Serum&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30073</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate</td><td>Sigma</td><td>N1636</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitro blue tetrazolium</td><td>Promega</td><td>S380C</td><td></td></tr><tr><td>Nusieve GTG</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Phenylthiourea</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>P4417-100Tab</td><td></td></tr><tr><td>PYREX Spot Plate</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Reef Salt</td><td>AZOO</td><td>AZ28001</td><td></td></tr><tr><td>trans-Dehydroandrosterone</td><td>Sigma</td><td>D4000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000M</td><td></td></tr></tbody></table>

het visualiseren van de interrenal steroïdogene tissue en haar vasculaire microenvironment in zebravis

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

Dit protocol introduceert hoe gedifferentieerde interrenale steroidogene cellen kunnen worden gedetecteerd door middel van een eenvoudige enzymatische activiteitstest voor volledige montage. Het identificeren van gedifferentieerde steroidogene weefsels door middel van chromogene histochemische kleuring van 3-β-Hydroxysteroïde dehydrogenase /Δ5-4 isomerase (3β-Hsd) activiteit-positieve cellen is cruciaal voor het monitoren van de morfologie en differentiatie van bijnierschors en interrenale weefsels bij respectievelijk zoogdieren en beenvissen. In het zebravismodel zorgen de optische transparantie en weefselpermeabiliteit van de zich ontwikkelende embryo's en larven voor volledige montagekleuring van 3β-Hsd activiteit. Dit kleuringsprotocol, zoals uitgevoerd op transgene fluorescente reporterlijnen die de zich ontwikkelende pronieren en endotheelcellen markeren, maakt de detectie mogelijk van het steroidogene interrenale weefsel naast de nier en het aangrenzende vaatstelsel. In combinatie met vibratome-sneden, immunohistochemie en confocale microscopie kunnen we het vasculaire micro-omgeving van interrenale steroidogene weefsels visualiseren en testen. De 3β-Hsd activiteitstest is essentieel voor het bestuderen van de celbiologie van de interrenale klier van de zebravis, omdat tot op heden geen geschikt antilichaam beschikbaar is voor het labelen van zebravis steroidogene cellen. Verder is deze test snel en eenvoudig, waardoor het een krachtig hulpmiddel is voor mutantenscreenings die zich richten op bijnier (interrenale) genetische aandoeningen, evenals voor het bepalen van de verstoringseffecten van chemicaliën op steroidogenese in farmaceutische of toxicologische studies.

Om te bepalen hoe de steroidogenic interrenal weefsel codevelops met de pronephric nier glomerulus en de ontluikende vaatstelsel, de 3β-Hsd enzymatische activiteit test werd uitgevoerd op de dubbele transgene Tg (wt1b: GFP) LI1; Tg (kdrl: mCherry) CI5 embryo op 34 HPF (Figuur 1). In dit stadium is het 3β-Hsd activiteit-positieve steroidogenic weefsel ligt direct aan de middellijn en meteen caudaal van de pronephric nier glomerulus, terwijl ...

De interrenal klier in de zebravis is de teleostean tegenhanger van de zoogdieren bijnier. Dit protocol wordt beschreven hoe de 3-β-hydroxysteroïdedehydrogenase (Δ 5-4 isomerase, 3β-Hsd) verricht enzymatische activiteit test, die gedifferentieerde steroïdogene cellen in zebravisembryo detecteert.

Het visualiseren van de Interrenal steroïdogene Tissue en haar Vasculaire Microenvironment in zebravis

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van gedifferentieerde interrenale steroidogene cellen in de ontwikkelende zebravis via een eenvoudige enzymatische activiteitsassay op het gehele preparaat. Deze kleuringsprocedure kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de moleculaire en cellulaire mechanismen van de vorming en misvorming van de interrenale klier. Het belangrijkste voordeel van deze kleuringsassay is dat deze snel, eenvoudig en betrouwbaar is, waardoor het een krachtig instrument is voor genetische of chemische screenings in zebravissen.Deze procedure kan worden uitgevoerd op transgene fluorescente reporterlijnen, waarbij de nier en de bloedvaten worden gemarkeerd zodat meerdere weefsels in hetzelfde embryo kunnen worden geanalyseerd. In combinatie met vibratoom-coupes, immunohistochemie en confocale microscopie kan ook de vasculaire micro-omgeving van het interrenale weefsel worden gevisualiseerd. Nadat de stamoplossingen voor drie beta-Hsd-activiteitskleuringen zijn bereid volgens het tekstprotocol, worden de ontwikkelende zebravissenembryo's in 0,03% PTU in eierwater geplaatst om pigmentvorming te remmen.Fixeer gedechoreoneerde embryo's, of larv

visualizing-interrenal-steroidogenic-tissue-its-vascular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier laten we zien hoe retro-orbitale injectie te doen in volwassen zebravissen.

Retro-orbitale injectie in Adult zebravis

De zebravis nier is de thuisbasis van zowel de nier-en hematopoietische volwassen stamcellen / progenitorcellen, en vormt een uitstekende gelegenheid om deze celtypen en hun nakomelingen studie in een gewerveld modelorganisme. Hier tonen we een gedetailleerde dissectie procedure die de onderzoeker in staat stelt te identificeren en chirurgisch te verwijderen van de volwassen zebravissen nieren, die kunnen worden gebruikt voor toepassingen zoals celisolatie, transplantatie, en expressie studies...

Dissectie van de Adult zebravis Kidney

Beeldvorming van cerebrovasculaire ontwikkeling in larvale zebravis wordt beschreven. Technieken om 3D-beeldvorming te vergemakkelijken en het gebruik van chemische behandelingen cerebrovasculaire ontwikkeling passen zijn ook aanwezig.

Imaging en 3D Reconstructie van cerebrovasculair Structuren in embryonale zebravis

De zebravis embryo is een uitstekend model voor ontwikkelingsbiologie onderzoek. Tijdens de embryogenese, zebravissen ontwikkelen met een dooier massa, die driedimensionale uitdagingen voor monster observatie en analyse presenteert. Dit protocol beschrijft hoe twee-dimensionale platte mount voorbereidingen van ganse berg in situ (WISH) gekleurd zebravis embryo exemplaren maken.

Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

De hier beschreven methode maakt time-lapse analyse van orgaanontwikkeling in zebravisembryo's met behulp van een fluorescentie microscoop ontleden kan uitvoeren optische sectie en simpele strategieën afstelling van focale vlak drift corrigeren.

Analyse van de zebravis Kidney Development met Time-lapse Imaging Met behulp van een dissectie microscoop Uitgerust voor Optische-Sectie

Dit protocol toont een fluorescentie gebaseerde methode om de vasculatuur te visualiseren en de complexiteit ervan te kwantificeren in Xenopus tropicalis . Bloedvaten kunnen na de injectie van een fluorescerende kleurstof in het kloppende hart van een embryo worden gedetecteerd na genetische en / of farmacologische manipulaties om in vivo cardiovasculaire ontwikkeling te bestuderen.

Visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Cilia ontwikkeling is essentieel voor goede organogenese. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te etiketteren en ciliated cellen van de zebravis visualiseren.

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

Hier bespreken we een methode-protocol waarmee een gemakkelijke analyse van de volwassen tg(fli:EGFP) zebrafish retinale therapieën als een snel uitlezing in instellingen van lange termijn vasculaire pathologieën gekoppeld aan neoangiogenesis en structurele veranderingen.

Bestuderen van Diabetes door de ogen van een vis: Microdissection, visualisatie en analyse van de volwassen tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal therapieën

Hier beschrijven we 3 volwassen zebrafish letsel modellen en hun gecombineerd gebruik met immunosuppressieve medicamenteuze behandeling. Wij bieden begeleiding over de beeldvorming van het herstel van de weefsels en bot mineralisatie daarin opsporen.

Volwassen Zebrafish letsel modellen te bestuderen van de effecten van prednisolon in het herstel van botweefsel

Hier demonstreren we een methode voor het kwantificeren van levergrootte bij larve zebravissen, die een manier bieden om de effecten van genetische en farmacologische manipulaties op levergroei en ontwikkeling te beoordelen.

Kwantificerende levergrootte bij larvale zebravissen met behulp van Brightfield Microscopie

Leer een snelle enzymatische kleuring om interrenale steroïdogene cellen in Danio rerio te detecteren. Deze methode ondersteunt genetische en chemische screenings voor endocriene ontwikkeling.

Het visualiseren van de Interrenal steroïdogene Tissue en haar Vasculaire Microenvironment in zebravis

Meer video's verkennen