Het visualiseren van de Interrenal steroïdogene Tissue en haar Vasculaire Microenvironment in zebravis
December 21st, 2016
De interrenal klier in de zebravis is de teleostean tegenhanger van de zoogdieren bijnier. Dit protocol wordt beschreven hoe de 3-β-hydroxysteroïdedehydrogenase (Δ 5-4 isomerase, 3β-Hsd) verricht enzymatische activiteit test, die gedifferentieerde steroïdogene cellen in zebravisembryo detecteert.
Het algemene doel van deze procedure is om gedifferentieerde interrenale steroïdogenese cellen in de zich ontwikkelende zebravis te detecteren door middel van een eenvoudige volledige enzymatische activiteitstest. Deze kleuringsprocedure kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de moleculaire en cellulaire mechanismen van interrenale kliervorming en misvorming. Het grote voordeel van deze kleuringstest is dat deze snel, eenvoudig en betrouwbaar is, waardoor het een krachtig hulpmiddel is voor genetische of chemische screenings in zebravissen.
Deze procedure kan worden uitgevoerd op transgenische fluorescente reporterlijnen, die de nier en de bloedvaten markeren, zodat meerdere weefsels in hetzelfde embryo kunnen worden geanalyseerd. In combinatie met vibratome-sectio's, immunohistochemie en confocale microscopie kan ook het vasculaire micro-omgeving van het interrenale weefsel worden gevisualiseerd. Na het bereiden van stockoplossingen voor drie beta-Hsd-activiteitskleuring volgens het tekstprotocol, plaatst u zich ontwikkelende zebravis-embryo's in 0,03%PTU in eivormingswater om pigmentvorming te remmen.
Fixeer gedechorioneerde embryo's of larven in 2% of 4%PFA in PBS met 0,1%Tween 20, of PFAT. Was de embryo's vier keer gedurende 10 minuten met PBST, en zorg ervoor dat de monsters niet uitdrogen tussen de wasbeurten. Voorafgaand aan de kleuringsreacties, bereidt u deel A en B vers in afzonderlijke buizen, en draait u vervolgens de oplossingen door elkaar en centrifugeert u deze.
Het is essentieel om deel A en B in afzonderlijke buizen te bereiden. Het toevoegen van alle componenten direct in één enkele buis zal direct tot ernstige precipitatie leiden. Voeg de volledige buis met deel A toe aan de volledige buis met deel B. Meng goed en verdeel onmiddellijk één milliliter in elke microfugebuis met gefixeerde en gewassen embryo's.
Gebruik aluminiumfolie om de buizen in te pakken, en plaats ze op kamertemperatuur op een roterende of slingerende tafel met zachtjes schommelen. Bepaal empirisch de reactietijd door een microscoop te gebruiken om chromogene signalen te monitoren. Gedurende de tijd zullen zich lichte precipitaties ontwikkelen die de reactie niet zullen verstoren.
Stop de reactie door de embryo's vier keer gedurende 10 minuten met PBST te wassen, en fixeer de gekleurde embryo's vervolgens met 4%PFAT bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten. Gebruik voor volledige microscopie 50% glycerol in PBS om de embryo's te verduidelijken. Observeer vervolgens de monsters met een rechtopstaande microscoop onder helder veldverlichting nadat u ze hebt georiënteerd met de dorsale zijde naar boven.
Verwijder de dooier van het embryo en gebruik het om een platte montage te maken. Neem vervolgens een hoogwaardige afbeelding van de morfologie van het interrenale weefsel. Om het vasculaire micro-omgeving van het steroïdogenese weefsel te analyseren, fixeert u de gekleurde embryo's met 2%PFA.
Supplementeren met 1%Triton X-100 bij vier graden Celsius gedurende één uur, en gebruik PBST-X om de embryo's bij kamertemperatuur vier keer gedurende 10 minuten te wassen. Om de embryo's in te bedden, bereid 4% lage smeltpunt agarose door agarose op te lossen in PBS bij 95 graden Celsius. Verdeel vervolgens in microcentrifugebuizen en bewaar bij vier tot acht graden Celsius.
Smelt een aliquot van 4% lage smeltpunt agarose gedurende 10 minuten bij 70 graden Celsius, en bewaar het aliquot bij 47 graden Celsius. Gebruik een losgekoppelde dop van een 1,5% milliliter microcentrifugebuis als mal om een embryo in gesmolten agarose in te bedden en laat het afkoelen tot het stevig is. Gebruik een stuk plakband om een stuk papiertape op het droge platform van de vibratome te plakken om vibratome-sectio's uit te voeren.
Gebruik vervolgens een scheermes om de verharde agarose-blok uit de mal te verwijderen. Breng superlijm aan op de papiertape op het platform en bevestig de agarose-blok op de papiertape met de voorkant van het monster naar boven. Trim vervolgens het agarose-blok tot een trapeziumvormige prisma-vorm met ongeveer vier tot acht millimeter aan elke zijde van de boven- en onderkant respectievelijk.
Gebruik een druppelpijp gevuld met koud PBS met 0,5%Trident X-100 om het agarose-blok te spoelen. Gebruik vervolgens een vibratome volgens de instructies van de fabrikant om 100 micrometer secties voor te bereiden. Verwijder de gesneden secties van de vibratome met een 26-gauge naald en breng ze over naar een spotplaat met 500 microliters koud 0,5%PBST-X per putje.
Verzamel de drie beta-Hsd-activiteit positieve weefselsecties door te controleren onder een dissectiescoop, en gebruik een pipettetip om de secties over te brengen naar een 96-wellsplaat met koud 0,5%PBST-X. Vervolgens kleurt u de secties verder en maakt u een afbeelding volgens het tekstprotocol. Om te bepalen hoe steroïdogenese interrenale weefsel samen ontwikkelt met de pronefrische nierglomerulus en zijn beginnende vaatwerk, werd de drie beta-Hsd enzymatische activiteitstest uitgevoerd op een dubbel transgenisch zebravis embryo, dat zowel nierspecifieke als endotheelspecifieke fluorescentie toont.
Zoals hier getoond, bevindt zich het drie beta-Hsd-positieve steroïdogenese weefsel rechts van de middellijn en onmiddellijk naast de pronefrische nierglomerulus. Sommige steroïdogenese cellen beginnen ook over de middellijn te migreren. Deze vibratome-secties van transgenische embryo's die endotheel GFP tonen en aan de drie beta-Hsd-test zijn onderworpen, werden geanalyseerd door immunohistochemie om fibronectine en zijn downstream effector, gefosforyleerde focale adhesie kinase te detecteren.
De peri-dorsale aorta depositie van fibronectine is essentieel voor het ondersteunen van de groei van interrenale bloedvaten. Voor het visembryo of larve kan de volledige histochemische kleuring binnen een dag worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Hoewel deze kleuringsmethode eenvoudig en snel is, is het belangrijk om te onthouden dat deze slechts één enkele enzym van de steroï
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om gedifferentieerde interrenale steroïdogenese cellen in zich ontwikkelende zebravissen te detecteren met behulp van een enzymatische activiteitstest van volledige montage. Deze techniek is waardevol voor het bestuderen van de vorming en misvorming van de interrenale klier.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Endocrinologie
Achtergrond
- De interrenale klier in zebravissen is analoog aan de bijnaderklieren van zoogdieren.
- Het begrijpen van de interrenale klier is cruciaal voor inzichten in steroïdogenese.
- Deze test maakt de visualisatie van steroïdogenese cellen tijdens de ontwikkeling mogelijk.
- Het kan worden toegepast op transgene lijnen voor verbeterde analyse.
Doel van het onderzoek
- Om gedifferentieerde steroïdogenese cellen in zebravissen te detecteren.
- Om de moleculaire mechanismen van interrenale klierontwikkeling te onderzoeken.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor genetisch en chemisch screening.
Gebruikte methoden
- Enzymatische activiteitstest van volledige montage voor 3-β-hydroxysteroïde dehydrogenase.
- Gebruik van 0,03% PTU om pigmentvorming in embryo's te remmen.
- Combinatie met vibratome-sectie en immunohistochemie.
- Visualisatie van de vasculaire micro-omgeving met behulp van confocale microscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle detectie van gedifferentieerde interrenale steroïdogenese cellen.
- Rapide en betrouwbare kleuringsprocedure gedemonstreerd.
- Mogelijkheid om meerdere weefsels in hetzelfde embryo te analyseren.
- Inzichten in de vasculaire micro-omgeving van het interrenale weefsel.
Conclusies
- De test is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de ontwikkeling van de interrenale klier.
- Het vergemakkelijkt de exploratie van genetische en chemische invloeden op steroïdogenese.
- Deze methode verbetert ons begrip van de vorming van het endocriene systeem bij gewervelden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This enzymatic activity assay enables rapid visualization of steroidogenic tissue in zebrafish embryos, supporting early-stage target validation in endocrine pathway research. By detecting 3β-Hsd activity without reliance on antibodies, the method provides a reliable readout for mechanistic de-risking of compounds affecting steroidogenesis. Its compatibility with transgenic reporter lines and vascular microenvironment analysis enhances predictive confidence in preclinical safety assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of steroidogenic tissue differentiation through direct enzyme activity detection.
- Operational Value: Provides antibody-independent readout for target engagement in zebrafish-based mutant or chemical screens.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of genetic or chemical disruptions in the steroidogenic pathway.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative chromogenic readout correlating with 3β-Hsd enzymatic activity in intact tissues.
- Operational Value: Compatible with whole-mount imaging and sectioning for multiplexed tissue analysis in single embryos.
- Scalability: Rapid staining procedure allows integration into high-throughput screening workflows for endocrine disruptor detection.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Permits co-localization of steroidogenic tissue with vascular markers to assess microenvironmental influences on hormone production.
- Operational Value: Enables sequential staining for enzyme activity followed by immunohistochemistry to map fibronectin and phosphorylated FAK in vascular niches.
- Translational Relevance: Models interrenal-adrenal axis conservation, supporting cross-species extrapolation of steroidogenesis findings.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within early discovery workflows where functional readouts of endocrine tissue maturation are required prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports interrogation of steroidogenic lineage specification and tissue morphogenesis in vivo.
- Screening: Delivers enzyme-based phenotypic readout suitable for compound library screening in zebrafish.
- Analytics: Generates spatially resolved activity maps that can be co-registered with vascular or glomerular markers.
- Translational Research: Enables analysis of tissue-stromal interactions critical for endocrine tissue maturation and vascular support.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for developmental endocrinology and toxicology applications across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in steroidogenic tissue identification through direct enzymatic detection.
- Operational Value: Standardizes whole-mount staining across laboratories using defined reagent preparation and reaction timing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early biomarker of pathway disruption in vertebrate models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on steroidogenic tissue integrity and vascular niche formation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, fixation, and whole-mount staining techniques.
- Dependent on access to vibratory microtome, confocal microscopy, and immunohistochemistry infrastructure for vascular analysis.
- Necessitates standardization of reaction timing and chromogenic development across batches for reproducible quantification.
- Adaptation to alternative model systems may require optimization of permeability and staining conditions.
- Limitation: Detects only one enzymatic step (3β-Hsd) in the steroidogenic pathway, necessitating complementary assays for full pathway assessment.
