Ontwikkeling en Identificatie van een nieuw subpopulatie van Human neutrofielen afgeleide Giant Fagocyten In Vitro

De algemene doelen van deze methode zijn om in vitro gekweekte gigantische fagocyten, afgeleid van circulerende humane neutrofielen, te genereren en identificeren voor de onderzoek naar hun rol in inflammatoire en anti-inflammatoire immuunresponsen. Deze methode kan worden gebruikt om een nieuwe subpopulatie van gigantische fagocyten te verkrijgen en identificeren die zich ontwikkelen uit humane neutrofielen om langdurige kweekcondities te onderhoud. Deze techniek kan worden gebruikt om de betekenis en functies van gigantische fagocyten verder te onderzoeken, evenals om antwoord te geven op sleutelvraagstukken over hun activering en plasticiteit.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Eva Leder, onze onderzoeksassistent, en Oksana Rogovoy, post doc, beide uit mijn laboratorium. Gebruik een steriele scalpveneset om minstens 40 milliliter veneus bloed te verkrijgen van een gezonde jonge vrijwilliger. Meng vervolgens voorzichtig het bloed in een bioveiligheidslaminal flow hood.

Verdun 10 tot 12 milliliter aliquots van de volledige bloedmonster tot een eindvolume van 24 milliliter met voorverwarmde ION-vrije PBS bevattende 2% hitte-geïnactiveerd FCS. Voeg vervolgens 12% milliliters polysucrose 1119 toe aan de bodem van één 50 milliliter steriele polypropyleen conische centrifugeerbuis per bloedmonster aliquot, gevolgd door de zorgvuldige plaatsing van 12 milliliters polysucrose 1077 bovenop de polysucrose 1119 gradiëntoplossing. Pipet voorzichtig 24 milliliters van het verdunde bloed op individuele buizen met de dichtheidsgradiëntoplossingen en scheid de cellen door centrifugatie.

Er zouden twee resulterende ondoorzichtige lagen moeten worden waargenomen. Gooi de vloeistof weg tot 0,5 centimeter boven de mononucleaire cel laag in elke buis. Breng vervolgens de mononucleaire cellen van elk monster over naar een enkele nieuwe buis.

Vervolgens gooit u de resterende vloeistof weg tot 0,5 centimeter boven de polymorf-nucleaire cel of PMN laag en brengt u de PMN's van elk monster over naar een andere nieuwe buis. Was de PMN's in een eindvolume van 30 milliliter PBS bevattende 2%hitte-geïnactiveerd FCS, gevolgd door lysis van de rode bloedcellen met drie milliliter steriele ijskoude hypotone 0,2%natriumchloride. Na 30 seconden op ijs, herstelt u de isotoniciteit met drie milliliter steriele ijskoude 1,6%natriumchloride.

Voeg vervolgens zes milliliter 37 graden Celsius RPMI 1640 Medium toe, gesupplementeerd met hitte-geïnactiveerd FCS en verzamel de cellen door centrifugatie. Resuspendeer het pellet in vier milliliter RPMI 1640 gesupplementeerd met 10% hitte-geïnactiveerd FCS. Na het tellen, pas de concentratie aan op 1,25 tot 1,5 keer 10 tot de zesde PMN per milliliter kweekmedium en plaats een milliliter cellen per putje in individuele putjes van een 24-wells plaat.

Plaats vervolgens de plaat in een bevochtigde 5% koolstofdioxide-incubator bij 37 graden Celsius, door de culturen te voeden door het voorzichtig vervangen van de helft van het medium met vers RPMI 1640 Medium gesupplementeerd met 10% hitte-geïnactiveerd FCS elke drie dagen. De neutrofielen zullen zich binnen zeven dagen kweek differentiëren tot gigantische fagocyten. Op dag zeven van de kweek verwijdert u voorzichtig de helft van het medium uit elke put.

Pipet vervolgens robuust het resterende medium om de licht aangehechte gigantische fagocyten te verwijderen. Breng de losgehechte cellen van twee tot vier putjes van elke behandelingsgroep over in individuele 15 millimeter conische buizen en verzamel de cellen door centrifugatie, waarbij de pellets worden resuspendeerd in 100 tot 120 microliters medium per buis. Rust vervolgens twee tot drie houders per behandelingsgroep uit met microscoopglazen, filterkaarten en trechters.

Voeg vervolgens het volledige volume cellen van elke buis toe aan de juiste Cytospin-trechter. Laad vervolgens de houders op een Cytospin en centrifugeer de cellen op de glazen. Laat de gecentrifugeerde glazen 10 minuten drogen.

Gebruik vervolgens een waterbestendige marker om een hydrofobe barrière rond de cellen te tekenen en fixeer de monsters met 4% paraformaldehyde onder een chemische kap bij kamertemperatuur. Na 10 minuten spoelt u de glazen kort drie keer met ongeveer 100 microliters PBS per wasbeurt. Permeabiliseer vervolgens de cellen met 0,5% Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door vijf PBS-wasbeurten zoals zojuist is aangetoond.

Blokkeer de niet-specifieke binding met 10% normaal geitenserum in RPMI 1640 Medium gedurende de geschikte tijdsperiode, gevolgd door een enkele PBS-wasbeurt. Voeg nu een kleine hoeveelheid water toe aan de doos om de vochtigheid te behouden en label vervolgens de cellen met ongeveer 100 microliters van de geschikte primaire antilichaam van belang gedurende de nacht bij vier graden Celsius in een bevochtigde donkere kamer. Voer vervolgens een enkele PBS-wasbeurt uit en voeg vervolgens het geschikte fluorescentie-geconjugeerde secundaire antilichaam toe.

Na 40 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht, was de monsters om de overtollige antilichamen te verwijderen en monteer de glazen met een druppel montagemedium per monster en een dekglas. Analyseer de glazen door confocale laserscanningfluorescentiemicroscopie binnen 30 tot 120 minuten onder een 40X immersie-olieobjectief. Bereken vervolgens de celafmetingen, fluorescentie-intensiteit en co-lokalisatie met behulp van de juiste software.

Neutrofielontwikkeling tot gigantische fagocyten binnen zeven dagen kweek kan worden waargenomen in deze afbeeldingen. Autofagie is duidelijk zichtbaar zo vroeg als 90 minuten na neutrofielenkweek met fluorescerende membraankleuringen met een sterk vergrote celafmeting die duidelijk is tussen dag vier tot zeven. Als de neutrofielenkweek echter wordt aangevuld met GM-CSF en IL-4, vertonen de cellen een algemeen kleinere diameter en cytoplasmatische uitsteeksels die lijken op dendritische cel-achtige cellen.

Tijd-lapse microscopie van de gigantische fagocyten