Name: Een platform van de Anti-biofilm Testen geschikt voor de exploratie van natuurlijke verbinding Bibliotheken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Verken een nieuw screeningsplatform voor anti-biofilmonderzoek met Staphylococcus aureus. Deze methode combineert viabiliteits-, biomassa- en matrixbepalingen voor effectieve identificatie van natuurlijke verbindingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken professor Paul Cos en LMPH, Universiteit Antwerpen, België voor zijn steun tijdens de opnames proces in zijn laboratorium. Dit werk werd gefinancierd door de Academie van Finland projecten (projecten 272.266 en 282.981) en Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finland. De technische bijdrage van MSc Janni Kujala worden erkend.

1. Het kweken van de bacteriën <ol><li> Voorkweek de bacteriën overnacht in een tryptische soja bouillon (TSB) bij 37 ° C met 220 rpm schudden (16-18 uur). </li><li> Verdun de voorkweek 100-1000 keer (afhankelijk van de groeisnelheid van de bacteriën, hier is 1000 keer gebruikt voor S. aureus) in vers TSB en laten groeien bij 37 ° C en 200 rpm te bereiken exponentiële groei (optische dichtheid bij 595 nm (OD 595) tussen 0,2 en 0,6). OPMERKING: Deze stap vereist stam-specifieke optimalisatie. </li></ol> 2. Biofilm Formation: Pre- en Post-exposure <ol><li> Verdun de exponentieel gegroeid kweek 100 maal (dit komt overeen met circa 10 6 kolonievormende eenheden per milliliter (CFU / ml)). </li><li> Pre-exposure protocol <ol><li> Voor onbehandelde controlemonsters, voeg 200 ul van de verdunde bacteriecultuur per putje van een steriele 96-microwell plaat. </li><li> Voeg 4 pi van een testverbinding of controlantibioticum (50x voorraad-oplossing) en 196 pl van de verdunde bacteriecultuur per well. </li><li> Incubeer het op 37 ° C op een plaat schudder bij 200 rpm gedurende 18 uur. Opmerking: Hier maken we gebruik van een shaker met een 2 mm baan. </li></ol></li><li> Post-exposure protocol <ol><li> Voor alle monsters, voeg 200 ul van de verdunde bacteriecultuur per putje van een steriele 96-microwell plaat. </li><li> Incubeer het op 37 ° C op een plaat schudder bij 200 rpm gedurende 18 uur. Opmerking: Hier maken we gebruik van een shaker met een 2 mm baan. </li><li> Verwijder de gehele plankton oplossing voorzichtig, zonder het aanraken van de biofilm, met behulp van een multichannel pipet. </li><li> Voeg 4 pi van een testverbinding of een controle-antibioticum (50x voorraadoplossing) en 196 gl per putje TSB. </li><li> Incubeer het op 37 ° C op een plaat schudder bij 200 rpm gedurende nog 24 uur. Opmerking: Hier maken we gebruik van een shaker met een 2 mm baan. </li></ol></li></ol> 3. Resazurin kleuring protocol voor de levensvatbaarheid Assessment van biofilms <ol><li> Bereid een voorraadoplossing van 0,1 mg / ml resazurine (0,4 mM) in steriele PBS. Houd dit bestand steriel, beschermd tegen blootstelling aan licht, en bij 4 ° C. </li><li> Verdun de Resazurin stock 1:50 in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van 20 uM. </li><li> Breng de volledige planktonische oplossing (waarbij de biofilms in putjes) voorzichtig zonder gebruikmaking van de biofilms of luchtbellen, een afzonderlijke, schone 96-wells plaat met een multichannel pipet. </li><li> Was de biofilms eenmaal met steriel PBS door het toevoegen van 200 pl per putje, en verwijder voorzichtig met een multichannel pipet. </li><li> Voeg 200 ul van de verdunde resazurin per putje van de biofilm plaat met behulp van een multichannel pipet. </li><li> Incubeer in het donker bij kamertemperatuur (KT) en 200 rpm schudden gedurende ongeveer 20 min tot onbehandelde controles biofilm gelijkmatig roze. </li><li> Meet de fluorescentie bijλ exc = 560 nm en λ em = 590 nm met een plaatlezer (top lezing). </li></ol> 4. Crystal Violet kleuring Protocol voor Biomassa Kwantificering van biofilms met dezelfde plaat als in stap 3 <ol><li> Verwijder de Resazurin vlek voorzichtig uit de putjes met een multichannel pipet. </li><li> Bevestig de biofilms met 200 pl methanol gedurende 15 min. </li><li> Laat de plaat drogen aan de lucht gedurende 10 minuten. </li><li> Voeg 190 ul van 0,02% (vol / vol, verdund in gedeïoniseerd water) kristalviolet oplossing voorzichtig met een meerkanaalspipet. Vermijd het aanraken van de zijkanten van de putten met de vlek terwijl pipetteren en te voorkomen dat de vorming van luchtbellen door niet drukken op de pipet om blow-out te voltooien. </li><li> Incubeer het voor 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de vlek zorgvuldig met een multichannel pipet. </li><li> Was het twee keer met gedemineraliseerd water (200 ui per keer). </li><li> Laat de putjes drogen 5 minuten bij kamertemperatuur en los de resterende vlekin 96% ethanol en 33% azijnzuur. </li><li> Incubeer gedurende 1 uur bij KT en lees absorptie bij 595 nm. </li></ol> 5. Evaluatie van het bacteriedodend effect op Planktonische Bacteriën Met behulp van hetzelfde monster Plate als voor de Biofilms <ol><li> Meet de troebelheid bij 595 nm van de plaat met de plankton oplossing van 3,3. </li><li> Vlekken op de planktonische bacteriën resazurin door toevoeging van 10 ul van de resazurin voorraad per putje. Meng goed door pipetteren. </li><li> Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 5 min, totdat de onbehandelde controles zijn gelijkmatig roze. </li><li> Meet de fluorescentie bij λ = 560 nm exc en λ em = 590 nm. </li></ol> 6. tarwekiemagglutinine kleuring voor Matrix kwantificering en fluorescentiemicroscopie Imaging van biofilms <ol><li> matrix kwantificering <ol><li> Bereid een 5 ug / ml oplossing van WGA sonde in steriele PBS. </li><li> Gebruik een parallelle sample plaTE voor deze vlekken. Verwijder het plankton uit de putjes en een keer wassen met steriele PBS (200 pi per putje), voorzichtig met een multichannel pipet zonder het aanraken van de biofilms. </li><li> Voeg 200 ul van WGA-oplossing per putje te worden gemerkt. </li><li> Incubeer in het donker bij 4 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Verwijder de ongebonden vlek door het wassen van de putjes met 200 pl PBS driemaal. </li><li> Laat de plaat drogen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Los het gebonden vlek in 33% azijnzuur, gebruikt 200 gl per putje. </li><li> Verzegeling van de putten met strip caps en ultrasone trillingen ze met behulp van een waterbad ultrasoonapparaat gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur en 40 kHz. </li><li> Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij KT. </li><li> Herhaal stap sonicatie. De putten kunnen verzegeld blijven tussen de sonicatie stappen. </li><li> Meet de fluorescentie bij λ ex = 495 nm en λ em = 520 nm met een plaatlezer (top lezing). </li></ol></li><li> Het visualiseren van de matrix metfluorescentie microscopie <ol><li> Gebruik hetzelfde protocol als hierboven totdat stap 6.1.6. </li><li> Na de droogstap, visualiseren monsters met een fluorescentiemicroscoop, met een FITC filter (of een andere geschikte groen opwekkingsfilter). </li></ol></li></ol> 7. kleuring Levende en dode cellen binnen de biofilms for Imaging met fluorescentiemicroscopie en kwantificatie van het signaal voor de Green-to-rood-ratio (G / R) <ol><li> Beeldvorming met fluorescentie microscopie <ol><li> Bereid een oplossing van elke probe (een kleuring levensvatbare cellen en de ander kleuring dode cellen), volgens de richtlijnen van de fabrikant. </li><li> Verwijder het plankton uit de putjes en eenmaal wassen met steriele PBS (200 ul per putje) met een multichannel pipet. </li><li> Voeg 6 ul van de kleuroplossing per putje. </li><li> Incubeer de plaat in het donker gedurende 15 minuten. </li><li> Voor de microscopie, verwijder de overtollige vloeistof manually met behulp van een multichannel pipet. </li><li> Vastleggen van de beelden met behulp van een fluorescentiemicroscoop, met behulp van bijvoorbeeld een FITC-filter (voor groene fluorescentie, levensvatbare cellen) of een TRITC filter (rode fluorescentie, dode cellen). </li></ol></li><li> Kwantificering van het signaal als een groen-naar-rood-fluorescentieverhouding (G / R) <ol><li> Volg hetzelfde protocol als in de stappen 7.1.1 en 7.1.2. </li><li> Voeg 200 ul van de kleuroplossing per putje en incubeer ze gedurende 15 minuten in het donker. </li><li> Meet de fluorescentie met een bord lezer bij excitatie / emissie golflengten 485/535 nm en 485/635 voor groene en rode fluorescentie, respectievelijk (top lezing). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Dufour, D., Leung, V., Lévesque, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilm%3A+structure%2C+fuction%2C+and+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Endodontic+Topics%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance.</a> Endodontic Topics. 22, 2-16 (2012).</li>
<li>Donne, J., Dewilde, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Challenging+World+of+Biofilm+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Microb.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Challenging World of Biofilm Physiology.</a> Adv. Microb. Physiol. 67, 235-292 (2015).</li>
<li>Otto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+infections%3A+mechanisms+of+biofilm+maturation+and+detachment+as+critical+determinants+of+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Med%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity.</a> Annu. Rev. Med. 64, 175-188 (2013).</li>
<li>Cos, P., Tote, K., Horemans, T., Maes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+extra+hurdle+for+effective+antimicrobial%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an extra hurdle for effective antimicrobial.</a> Curr. Pharm. Des. 16, 2279-2295 (2010).</li>
<li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The in vivo biofilm.</a> Trends Microbiol. 21, 466-474 (2013).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Persister cells.</a> Annu. Rev. Microbiol. 64, 357-372 (2010).</li>
<li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+strains+producing+high+levels+of+persister+cells+in+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis.</a> J. Bacteriol. 192, 6191-6199 (2010).</li>
<li>Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+biofilm+disinfectant+efficacy+tests%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests.</a> J. Microbiol. Methods. 70, 236-244 (2007).</li>
<li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+growing+a+biofilm+under+low+shear+at+the+air-liquid+interface+using+the+drip+flow+biofilm+reactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor.</a> Nat. Protoc. 4, 783-788 (2009).</li>
<li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+assessment+of+a+laboratory+method+for+growing+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms.</a> Microbiology. 151, 757-762 (2005).</li>
<li>Parker, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruggedness+and+reproducibility+of+the+MBEC+biofilm+disinfectant+efficacy+test%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test.</a> J. Microbiol. Methods. 102, 55-64 (2014).</li>
<li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Calgary+Biofilm+Device%3A+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li>
<li>Harrison, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+susceptibility+testing+of+microbes+growing+on+peg+lids%3A+a+miniaturized+biofilm+model+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening.</a> Nat. Protoc. 5, 1236-1254 (2010).</li>
<li>Konrat, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bead+Assay+for+Biofilms%3A+A+Quick%2C+Easy+and+Robust+Method+for+Testing+Disinfectants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Bead Assay for Biofilms: A Quick, Easy and Robust Method for Testing Disinfectants.</a> PLoS One. 11, e0157663(2016).</li>
<li>Cragg, G. M., Newman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+products%3A+A+continuing+source+of+novel+drug+leads%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Natural products: A continuing source of novel drug leads.</a> Biochim Biophys Acta. 1830, 3670-3695 (2013).</li>
<li>Sandberg, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pros+and+cons+of+using+resazurin+staining+for+quantification+of+viable+Staphylococcus+aureus+biofilms+in+a+screening+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay.</a> J. Microbiol. Methods. 78, 104-106 (2009).</li>
<li>Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R., Carnero-Varo, M., Fernandez-Crehuet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+assay+based+on+resazurin+for+detection+of+activity+of+disinfectants+against+bacterial+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 773-783 (2009).</li>
<li>Peeters, E., Nelis, H., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> J. Microbiol. Methods. 72, 157-165 (2008).</li>
<li>Pettit, R., Weber, C., Pettit, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+high+throughput+Alamar+blue+biofilm+susceptibility+assay+to+Staphylococcus+aureus+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Clin.+Microbiol.+Antimicrob%22%5BJournal%5D)">Application of a high throughput Alamar blue biofilm susceptibility assay to Staphylococcus aureus biofilms.</a> Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8 (28), (2009).</li>
<li>Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+microtiter-plate+test+for+quantification+of+staphylococcal+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation.</a> J. Microbiol. Methods. 40, 175-179 (2000).</li>
<li>Stiefel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+biofilm+removal+properly+assessed%3F+Comparison+of+different+quantification+methods+in+a+96-well+plate+system%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Is biofilm removal properly assessed? Comparison of different quantification methods in a 96-well plate system.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2016).</li>
<li>Sandberg, M., Määttänen, A., Peltonen, J., Vuorela, P. M., Fallarero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automating+a+96-well+microtitre+plate+model+for+Staphylococcus+aureus+biofilms%3A+an+approach+to+screening+of+natural+antimicrobial+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Antimicrob.+Agents%22%5BJournal%5D)">Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 32, 233-240 (2008).</li>
<li>Thomas, V. L., Sanford, B. A., Moreno, R., Ramsay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+lectinsorbent+assay+measures+N-acetyl-D-glucosamine+in+matrix+of+biofilm+produced+by+Staphylococcus+epidermidis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked lectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphylococcus epidermidis.</a> Curr. Microbiol. 35, 249-254 (1997).</li>
<li>Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microplate+spectrofluorometric+assay+for+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ind.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms.</a> J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, 1-4 (2007).</li>
<li>Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+biofilm+matrix+measurements+with+biomass+and+viability+assays+in+susceptibility+assessments+of+antimicrobials+against+Staphylococcus+aureus+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot.+Tokyo%22%5BJournal%5D)">Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms.</a> J. Antibiot. Tokyo. 65, 453-459 (2012).</li>
<li>Skogman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+antibacterial+and+anti-biofilm+activities+of+cinchona+alkaloid+derivatives+against+Staphylococcus+aureus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prod.+Commun%22%5BJournal%5D)">Evaluation of antibacterial and anti-biofilm activities of cinchona alkaloid derivatives against Staphylococcus aureus).</a> Nat. Prod. Commun. 7, 1173-1176 (2012).</li>
<li>Fallarero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28%2B%29-+Dehydroabietic+Acid%2C+an+Abietane-Type+Diterpene%2C+Inhibits+Staphylococcus+aureus+Biofilms+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">(+)- Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro.</a> Int J Mol Sci. 14, 12054-12072 (2013).</li>
<li>Manner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+derivatives+of+dehydroabietic+acid+target+planktonic+and+biofilm+bacteria+in+Staphylococcusaureus+and+effectively+disrupt+bacterial+membrane+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">New derivatives of dehydroabietic acid target planktonic and biofilm bacteria in Staphylococcusaureus and effectively disrupt bacterial membrane integrity.</a> Eur. J. Med. Chem. 102, 68-79 (2015).</li>
<li>Muller, G., Kramer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+index+of+antiseptic+agents+by+parallel+assessment+of+antimicrobial+activity+and+cellular+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity.</a> J. Antimicrob. Chemother. 61, 1281-1287 (2008).</li>
<li>Toté, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+efficacy+of+various+antibiotics+on+matrix+and+viable+mass+of+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Antimicrob.+Agents%22%5BJournal%5D)">Inhibitory efficacy of various antibiotics on matrix and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 525-531 (2009).</li>
<li>Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+plate+assay+for+assessment+of+Listeria+monocytogenes+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 2950-2958 (2002).</li>
<li>Li, X., Yan, Z., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+variation+of+biofilms+among+strains+in+natural+populations+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiolog%22%5BJournal%5D)">Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans.</a> Microbiolog. 149, 353-362 (2003).</li>
<li>Barbosa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+and+simple+micro+assay+for+sulfated+glycosaminoglycans+quantification+in+biological+extracts+and+its+use+in+skin+and+muscle+tissue+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies.</a> Glycobiology. 13, 647-653 (2003).</li>
<li>Toté, K., Vanden Berghe, D., Maes, L., Cos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+colorimetric+microtitre+model+for+the+detection+of+Staphylococcus+aureus+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Lett.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms.</a> Lett. Appl. Microbiol. 46, 249-254 (2008).</li>
<li>Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharide+intercellular+adhesin+in+biofilm%3A+structural+and+regulatory+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects.</a> Front Cell Infect Microbiol. 5 (7), (2015).</li>
<li>Ausbacher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+biofilm+susceptibility+to+small+and+potent+beta%282%2C2%29-amino+acid+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus biofilm susceptibility to small and potent beta(2,2)-amino acid derivatives.</a> Biofouling. 30, 81-93 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Er is geen enkele methode die tegelijkertijd het effect van een verbinding op de levensvatbaarheid, biomassa en biofilm matrix kan meten. Daarom is er een behoefte voor het combineren assays om een ​​effect te detecteren op de drie eindpunten, bij voorkeur bij een primaire screening fase. Resazurin is een zeer eenvoudige kleuringsprotocol waarop uitsluitend de toevoeging van de redox probe. De vaststelling van de optimale incubatietijd van de biofilms met Resazurin is cruciaal voor het succe...

Bacteriën kunnen schakelen tussen twee zeer verschillende levensstijlen, plankton en zittend, waarvan een biofilm is de meest voorkomende voorbeeld. In biofilms, bacteriën vormen gestructureerde gemeenschappen ingebed in een zelfgeproduceerde matrix 1. Dit zelf geproduceerde matrix is ​​een barrière tussen de bacteriën en hun externe omgeving, en het beschermt de microbiële cellen, waardoor ze in de buurt. De samenstelling van de biofilm matrix varieert tussen en zelfs binnen soorten, maar bestaat voornamelijk uit een dicht netwerk van lipopolysacchariden, extracellulair DNA en eiwitten. De matrix dient als een fysieke barrière remmen van de ingang van schadelijke stoffen, maar beschermt ook de biofilm tegen uitdroging en voorkomt voedingsstoffen ontsnapt de cel 2. Biofilms worden beschouwd als een van de meest uitdagende onderwerpen moderne biogeneeskunde en ze ogenschijnlijk verantwoordelijk voor meer dan 80% van antibiotica-tolerante infecties 3. ze displegt een inherent hoge tolerantie tegen externe bedreigingen vochtigheidsgraad, osmotische druk, mechanische belasting 4, warmte, UV straling 5, desinfecterende middelen, antimicrobiële middelen en gastheerimmuunsysteem 1. Zo heeft de vereiste antimicrobiële middel concentratie vereist om een ​​biofilm te doden aangetoond tot 1000 maal hoger in vergelijking met die welke vereist is planktonische bacteriën te doden. De verklaring voor deze hogere tolerantie lijkt multifactorieel. De matrix bevat een fysieke barrière die het binnendringen van antibiotica vermindert in de biofilm. Ook cellen binnen de biofilms zijn fenotypisch divers; zij overgang tussen verschillende metabolische toestanden als gevolg van een bestaande gradiënt van zuurstof, voedingsstoffen en metabolieten tussen de binnenste en buitenste delen van de biofilm 6. Dus in sommige biofilm gebieden, zoals de kern, bacteriën zijn verstoken van zuurstof en voedingsstoffen en in een metabolisch minder actieve of volledig rusttoestand <sup&gt; 7. De volledig slapende cellen worden aangeduid als persistorcellen, en ze zijn ongevoelig voor conventionele antimicrobiële behandelingen 8. Derhalve is het waarschijnlijk dat biofilm veerkracht ontstaat door een combinatie van de momenteel voorgesteld en andere, nog onbekende mechanismen. Staphylococcus spp. nog steeds tot de meest problematische gram-positieve bacteriën, waardoor ernstige, vaak biofilm-gerelateerde infecties 4. Wordt voorgesteld dat tot 99% van alle bacteriën zijn geassocieerd in biofilms, waardoor het de overheersende bacteriële levensstijl 3. Alle op de nog bestaande antibiotica zijn ontwikkeld tegen eencellige (planktonische) bacteriën. Momenteel werkt een zeer beperkte repertoire van moleculen bestaat die selectief werken op rijpe biofilms. Deze situatie heeft een progressieve paradigmaverschuiving in drug discovery, waarin op zoek naar anti-biofilms werd aangespoord om een ​​meer prominente plaats innemen gereden. Vanuit methodological perspectief, extra uitdagingen bestaan, aangezien slechts een beperkt aantal biofilm methoden zijn ontwikkeld door normalisatie-organisaties, met name die van toepassing zijn op de high-throughput screening van chemische bibliotheken. Alle gestandaardiseerde assays (op één uitzondering na) zijn gebaseerd op biofilmreactoren, en deze werkwijzen vereisen grote hoeveelheden werk- en grote hoeveelheden van te onderzoeken verbindingen, die gewoonlijk beschikbaar tijdens de vroege experimentele stadium 9-12. De enige bestaande gestandaardiseerde screening-toepassing test is de zogenaamde Calgary Biofilm apparaat, waaruit de handel verkrijgbare minimale biofilm elimineren concentratie (MBEC) systeem ontwikkeld 13-15. De beperking van deze test is dat de biofilms worden geteeld op pennen, en niet elke bacteriële species of stammen binnen dezelfde soort kunnen biofilms deze inrichting te vormen. Bovendien methoden die met name kunnen worden toegepast op de exploratie van natuurlijke verbindingennodig. Natuurlijke producten zijn de belangrijkste bron voor innovatie in antimicrobiële drug discovery in de afgelopen eeuw 16 geweest. Ze kunnen nieuwe anti-biofilm verbindingen te voorzien van unieke werkingsmechanismen die ook effectief tegen persistorcellen kan zijn. Zo is de exploratie van natuurlijke en natuurlijk geïnspireerd bibliotheken heeft een hoge kans op het produceren van veelbelovende en unieke anti-biofilm leads. Hier presenteren we de experimentele gegevens van een platform van assays die is ontwikkeld voor het screenen van chemische anti-biofilm verbindingen met behulp van drie tests om de effecten op de levensvatbaarheid, totale biomassa en matrix van Staphylococcus aureus biofilms meten. De eerste assay meet biofilm levensvatbaarheid en het is gebaseerd op resazurin kleuring. Resazurin is een redox vlek die is blauw en niet-fluorescerende in zijn geoxideerde toestand en kleurt roze, sterk fluorescerende resorufine wanneer het gereduceerd door metabolische activiteit van de bacteriën. Het is een zeer eenvoudige en snelle methode geschikt voor primaire screenings 17-20. De tweede test, op basis van kristalviolet kleuring, meet totale biofilm massa. Crystal violet is een veel gebruikte vlek voor het bestuderen van bacteriën en bacteriën in biofilms 19,21-23. De test is gebaseerd op goedkope reagentia en heeft een eenvoudige absorptie eindpunt lezen. Het derde onderzoek richt de extracellulaire polymere stoffen (EPS) -matrix van de biofilm via tarwekiem agglutinine (WGA), dat specifiek bindt aan N-acetyl-glucosamine residuen (PNAG) aanwezig in de matrix op Staphylococcus biofilms 24 poly-. De WGA is geconjugeerd met een fluorofoor die kan worden gedetecteerd via fluorescentie-intensiteit lezers 25. Wij presenteren hier de reden en de details van het platform dat we ontwikkeld, met inbegrip van voorbeelden van toepassingen.

<table><tbody><tr><td>Resazurin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7017</td><td></td></tr><tr><td>Crystal violet</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT90132&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W11261</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD BacLight&nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>L7012</td><td>SYTO 9 voor het kleuren van levensvatbare cellen groen en propidiumjodide voor het kleuren van dode cellen rood</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptone soy agar</td><td>Lab M, Neogen</td><td>LAB011</td><td></td></tr><tr><td>Tryptine soy broth</td><td>Lab M, Neogen</td><td>LAB004</td><td></td></tr><tr><td>F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>161093</td><td></td></tr><tr><td>BRAND caps, strips of 8</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BR781413-300EA</td><td></td></tr><tr><td>Branson CPX series ultrasonic bath</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z769428-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Multipipette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multidrop dispenser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biomek 3000</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Varioskan Flash Multiplate reader</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>25923</td><td></td></tr></tbody></table>

een platform van de anti-biofilm testen geschikt voor de exploratie van natuurlijke verbinding bibliotheken

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Biofilms worden beschouwd als een van de meest uitdagende onderwerpen moderne biogeneeskunde en het potentieel verantwoordelijk voor meer dan 80% van antibiotica-tolerante infecties. Biofilms hebben een uitzonderlijk hoge tolerantie voor chemotherapie, waarvan wordt gedacht multifactoriële te zijn weergegeven. Bijvoorbeeld, de matrix levert een fysieke barrière die het binnendringen van antibiotica vermindert in de biofilm. Ook cellen in de biofilm fenotypisch verschillend. Waarschijnlijk biofilm veerkracht ontstaat door een combinatie van deze en andere, nog onbekende mechanismen. Alle momenteel bestaande antibiotica zijn ontwikkeld tegen één-cellen (planktonische) bacteriën. Derhalve tot nu toe een zeer beperkte repertoire van moleculen bestaat die selectief werken op rijpe biofilms. Deze situatie heeft een progressieve paradigmaverschuiving in drug discovery, waarin op zoek naar anti-biofilms werd aangespoord om een ​​meer prominente plaats innemen gereden. Een bijkomend probleem is dat er eenzeer beperkt aantal gestandaardiseerde biofilm onderzoek, met name die kan worden gebruikt voor grote verwerkingscapaciteit screenen van chemische bibliotheken. Hier wordt een experimentele anti-biofilm platform voor chemische screening gepresenteerd. Het maakt gebruik van drie bepalingen om biofilm levensvatbaarheid (met Resazurin kleuring), totale biomassa (met kristalviolet kleuring) en biofilm matrix (gemeten met behulp van een tarwekiem agglutinine, WGA-fluorescentie-gebaseerde kleuring van het poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG , fractie). Alle testen werden ontwikkeld met behulp van Staphylococcus aureus bacteriën als model. Voorbeelden van het platform kan worden gebruikt voor primaire screening en voor functionele karakterisering van geïdentificeerde anti-biofilm hits worden gepresenteerd. Deze experimentele sequentie verder zorgt voor de indeling van de treffers op basis van de gemeten eindpunten. Het biedt ook informatie over hun werkingsmechanisme, vooral op lange termijn versus korte termijn chemotherapeutische effecten. Het is dus zeer Advantageous voor de snelle identificatie van hoogwaardige hit verbindingen die als uitgangspunt kunnen dienen voor diverse biomedische toepassingen.

In het voorgestelde platform, worden de effecten op de levensvatbaarheid, biomassa en biofilm matrix gekwantificeerd. In de werkende sequentie (figuur 1), wordt één monster plaat gekleurd met resazurin en vervolgens met kristalviolet om de effecten op bacteriële biofilm levensvatbaarheid en totale biofilm biomassa gelijktijdig evalueren. Beide testen kunnen achtereenvolgens worden uitgevoerd in dezelfde plaat omdat werd aangetoond eerder dat een eerste kleuring met resaz...

Biofilm-infecties vertonen een hoge tolerantie voor chemotherapie. Geen enkele test legt de complexiteit van biofilms vast. In plaats daarvan zijn aanvullende tests nodig. We presenteren een screeningsplatform (ontwikkeld voor S. aureus) dat assays voor levensvatbaarheid, biomassa en biofilmmatrix combineert. Het maakt ontdekking van anti-biofilm medicijnen mogelijk, inclusief de beoordeling van langdurige chemotherapeutische effecten.

Een platform van de Anti-biofilm Testen geschikt voor de exploratie van natuurlijke verbinding Bibliotheken

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Het algemene doel van dit assayplatform is om een betekenisvolle screeningswerkstroom te bieden die drie relevante eindpunten combineert, levensvatbaarheid, biomassa en biofilmmatrix, voor identificatie en karakterisering van nieuwe, anti-biofilm verbindingen. Dit platform kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van antibiofilm agentontdekking, door een vroege onderscheiding van korte versus lange termijn chemotherapeutische effecten mogelijk te maken op een snelle, verklarende manier. Het belangrijkste voordeel van dit ontwikkelde platform is dat het verschillende assays combineert om een vollediger beeld te geven van de anti-biofilm effecten van chemische bibliotheken, vooral van natuurlijke verbindingen.Om het experiment te beginnen, bereid onbehandelde, controlemonsters voor met 200 microliter van 10 tot de zesde CFU per milliliter bacteriecultuur per putje van een steriele, 96 putjesplaat. Neem mediacontroles zonder bacteriecultuur mee. Vervolgens, op dezelfde 96-putjesplaten, bereid monsters voor met vier microliters van een 50x antibioticum stockoplossing en 196 microliters van de bacteriecultuur per putje, en incubeer vervolgens de culturen.Ga door m

a-platform-anti-biofilm-assays-suited-to-exploration-natural-compound

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates an assay for screening antimicrobial compounds that efficiently eliminate biofilms using a peg-plate. The methodology monitors the biofilm's metabolic state after treatment with antimicrobial compounds, facilitating the determination of the minimum biofilm eradication concentration.

A Peg Plate Biofilm Assay for Screening Antibacterial Agents

The video demonstrates a solid-phase adherence assay for assessing biofilm formation. In a multi-well plate, bacteria in bile salt-supplemented media adhere to solid surfaces, forming biofilms, which is confirmed by colorimetry through crystal violet staining and ethanol treatment.

A Solid Phase Adherence Assay to Assess Biofilm Formation

The video showcases a biofilm dispersion assay using a multi-well plate. Buffer and glucose treatment disassemble the biofilm, releasing bacteria, while bile salts induce stress, retaining bacteria in the protective extracellular polymeric substance. Higher dispersion with buffer and glucose confirms successful biofilm disassembly, estimated by colony forming units measurement.

Detection of Biofilm Disassembly Through a Dispersion Assay

We bieden een methode om gelijktijdig een bibliotheek van antilichaamfragmenten te screenen op bindingsaffiniteit en cytoplasmatische oplosbaarheid door gebruik te maken van de Escherichia coli twin-arginine translocatieroute, die een inherente kwaliteitscontrolemechanisme heeft voor intracellulaire eiwitvouwing, om de antilichaamfragmenten op het binnenmembraan weer te geven.

Bacteriële Inner-membraan Display voor het screenen van een bibliotheek van antilichaamfragmenten

We presenteren in de huidige studie een nieuwe fluorescentie gebaseerde assay middels lymfocyten afkomstig van een transgene muis. Deze test is geschikt voor high-throughput screening (HTS) van kleine moleculen begiftigd met de hoedanigheid van het remmen of bevorderen van lymfocyt activering.

Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

We beschrijven hier protocollen voor het meten van antilichaam-antigeen-bindende affiniteit en kinetiek met vier gebruikelijke biosensor platforms.

Bepaling van antilichaam met hoge affiniteit antigeen-bindend Kinetics met behulp van vier Biosensor Platforms

Biopanning bacteriële display bibliotheken is een bewezen techniek voor ontdekking van peptide affiniteit reagentia, een robuust alternatief voor antilichamen. De semi-automatische sorteermethode hierin heeft gestroomlijnd biopanning als u wilt verkleinen van het optreden van valse positieven. We illustreren hier het denkproces en de technieken toegepast in de beoordeling van kandidaten en het minimaliseren van de downstream-analyse.

Semi-automatische Biopanning van bacteriële Display bibliotheken voor Peptide affiniteit reagens detectie en analyse van de resulterende isolaten

Hier presenteren we een protocol bij scherm extracellulaire proteïne microarrays voor de identificatie van nieuwe receptor-ligand interacties in hoge-doorvoer. Ook beschrijven we een methode ter verbetering van de opsporing van voorbijgaande eiwit-eiwitinteractie met behulp van eiwit-microbead complexen.

Extracellulaire eiwit Microarray technologie voor detectie van High Throughput van lage affiniteit Receptor-Ligand interacties

Deze studie was gericht op het presenteren van een strategie voor het identificeren van drug-peptide interacties. De strategie omvat het biopanning van drug-herkennende korte peptiden op basis van een kwarts-kristal microbalans (QCM) biosensor, gevolgd door bioinformatica analyse voor het kwantitatief beoordelen van de informatie verkregen voor de drugherkenning en annotatie van de drug-bindende sites op eiwitten.

Biosensor-gebaseerde high throughput biopanning en bioinformatica analyse strategie voor de wereldwijde validatie van drug-eiwit interacties

Splijtingsgist wordt hier gebruikt als een heterologe gastheer om bacteriële cytoskeletale eiwitten zoals FtsZ en MreB tot expressie te brengen als translationele fusie-eiwitten met GFP om hun polymerisatie te visualiseren. Ook worden verbindingen die de polymerisatie beïnvloeden geïdentificeerd door beeldvorming met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Splijtingsgist als platform voor antibacteriële geneesmiddelenschermen gericht op bacteriële cytoskeleteiwitten

Verken een nieuw screeningsplatform voor anti-biofilmonderzoek met Staphylococcus aureus. Deze methode combineert viabiliteits-, biomassa- en matrixbepalingen voor effectieve identificatie van natuurlijke verbindingen.

Een platform van de Anti-biofilm Testen geschikt voor de exploratie van natuurlijke verbinding Bibliotheken

Meer video's verkennen