High-throughput Robotisch Assisted Isolatie van temperatuurgevoelige Lethal Mutants in

Het algemene doel van de procedure is om robotica en gestandaardiseerde assays in te zetten om de isolatie van temperatuurgevoelige letale mutaties in Chlamydomonas te stroomlijnen, om zo essentiële genen en pathways in dit organisme te bepalen. We zijn geïnteresseerd in zowel de conservatie als de divergentie van essentiële cellulaire functies in eukaryoten. De methode die we hiervoor gebruiken, is het bestuderen van mutaties die essentiële genen in deze processen verstoren.

Om dit goed te laten werken, is een zeer uitgebreide collectie mutanten nodig en de methoden die u zult horen zijn onze manier om een dergelijke collectie te genereren. We werken met de groene alg Chlamydomonas reinhardtii als vertegenwoordiger van het plantenrijk. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat temperatuurgevoelige letale mutaties waarschijnlijk in elke essentiële route kunnen worden gevonden.

De methode vereist geen voorkennis of gerichte mutagenese. De moleculaire functie van het gemuteerde gen kan direct worden afgeleid uit het lethale fenotype. Dit helpt ons bij het selecteren van interessante mutaties die diverse siala-paden verstoren, buiten de controle van de celcyclus.

Om UV-mutagenese uit te voeren, worden Chlamydomonas-cellen gekweekt tot een OD 750 van 0,2 tot 0,5 in 100 milliliters Tris-Acetaat-Fosfaat, of TAP, onder licht bij 25 graden Celsius en schudden op 100 RPM. UV-mutagenese wordt onafhankelijk uitgevoerd in twee genetische achtergronden volgens het tekstprotocol. Controleer een monster van elke cultuur onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de cellen levensvatbaar zijn en er geen contaminatie aanwezig is.

Verdun vervolgens de cultuur tot een OD 750 van 0,003 en wikkel de fles in aluminiumfolie om een homogene dichtheid te garanderen, aangezien de stam modaal is en directioneel zwemt als reactie op licht. Nadat de dichtheid van de suspensie conform het tekstprotocol is aangepast, bevestigt u een kleine tube-cassette die past op een vloeistofdispenser en voert u een reeks spoelingen uit voor sterilisatie, volgens de instructies van de fabrikant, om contaminatie te voorkomen. Gebruik een vloeistofdispenser-cassette voor acht spuiten om vier keer 96 druppels van elk twee microliters cultuur op droge rechthoekige platen te dispenseren.

Tik voorzichtig tegen de rand van de plaat om ervoor te zorgen dat alle druppels samensmelten tot een dunne vloeistoflaag en dek de platen onmiddellijk af om blootstelling aan licht te voorkomen. Plaats de platen na het drogen onder een germicide UV-lamp gedurende perioden die empirisch zijn bepaald om een optimale opbrengst van ts-mutanten onder de overlevers te verkrijgen. Plaats de platen vervolgens gedurende acht tot 24 uur bij kamertemperatuur in het donker.

Plaats de platen vervolgens in een incubator van 21 °C met verlichting. Na ongeveer 10 dagen, wanneer de kolonies zijn gegroeid maar nog niet zijn samengevloeid, worden de platen in de betreffende stapel geladen als bronnen voor robotgestuurde koloniepicking. Pick vervolgens kolonies voor 384-arrays op rechthoekige platen en kweek deze ongeveer een week bij 21 °C met verlichting.

Gebruik een replica plating-robot om de 384-arrays te condenseren tot een 1536-array en laat de platen ongeveer drie dagen groeien in de incubator bij 21 °C. Repliceer de 1536-arrays naar telkens twee platen en plaats er één in de incubator bij 21 °C en de andere in een incubator bij 33 °C. Na 24 uur bij 33 °C worden de platen uit de incubator bij 33 °C gerepliceerd naar een nieuwe set voorverwarmde platen en vervolgens in de incubator bij 33 °C geplaatst.

Na drie dagen groei bij 33 graden Celsius en vijf dagen groei bij 21 graden Celsius, wordt een digitale camera gebruikt om een roosterplaat te fotograferen die is gemarkeerd met negen uitlijningsindicatoren. Fotografeer vervolgens de platen, waarbij wordt afgewisseld tussen platen van 21 graden Celsius gevolgd door de corresponderende platen van 33 graden Celsius, waarbij alle platen in een vast frame worden geplaatst om de exacte oriëntatie te behouden. Verwerk de gekoppelde beelden van de 21 en 33 graden platen met een aangepaste matte lab-beeldanalysesoftware om de achtergrond te verwijderen en de beelden te segmenteren in een array van 1536.

Het programma bepaalt de gedetecteerde biomassa als de totale pixelintensiteit in elke positie. Laad de door de software gegenereerde lijst met geselecteerde kolonies als instructiebestand voor de robotica voor het plukken van enkele kolonies. Bereid vervolgens de bron- en doelplaten voor volgens de instructies van de robotica en laat de robot de geselecteerde kolonies naar een array plukken.

Plaats de doelplaten gedurende ongeveer vijf dagen in de incubator bij 21 °C om een stockplaat te laten groeien. Nadat een tweede biomassa-accumulatie-assay is uitgevoerd en 100 blokplaten volgens het tekstprotocol zijn gerepliceerd, worden de verse kopieën van de 100 blokplaten gerepliceerd naar drie kopieën. Nadat de derde plaat in de robot is geplaatst en de kolonies zijn gespot, worden er op tijdstip nul fotomicrografieën gemaakt van een regio van elke spot op de screeningplaten, waarna de platen voor incubatie bij 33 °C worden geplaatst.

Maak op verschillende tijdstippen na het verwijderen van de screeningplaten uit de incubator van 33 °C snel fotomicrografieën, waarbij u ervoor zorgt dat de platenhouder en de tafelcontroller nauwkeurig zijn gekalibreerd om beelden van dezelfde cellen op elk tijdstip te verkrijgen. Analyseer de microscopische beelden en selecteer mutanten op basis van de gewenste criteria. Spot de uiteindelijke geselecteerde set in een 96-wells array-agarplaat, waarbij u er zeker van bent dat elke plaat mutanten van hetzelfde paringstype en dezelfde drugresistentie bevat.

Breng grote hoeveelheden van de gearrangeerde kolonies over naar stikstofvrij gameten-inductiemedium op 96-well microplaten. Incubeer de platen onder licht gedurende ongeveer vijf uur om gametogenese mogelijk te maken. Suspendeer queries met de tegenovergestelde paringstypen die de alternatieve resistentiecassettes bevatten in buisjes met stikstofvrij gameten-inductiemedium voor gametogenese.

Meng de monsters van een doelplaat in een paringsmengselvolume van 20 µL. Na ongeveer 10 minuten onder het licht, spot vijf µL uit elke put twee keer. Eén keer op een TAP-plaat voor koppelingstesten en één keer op een TAP-plaat aangevuld met vijf µmol paro plus negen µmol hygro voor complementatietesten.

Na incubatie van de platen voor de complementatietest worden de platen gereproduceerd in twee kopieën voor de identificatie van het ts-fenotype. Test de koloniën op het ts-fenotype volgens het tekstprotocol. Na bestraling van individuele cellen van Chlamydomonas krijgen de cellen tien dagen de tijd om te groeien bij een permissieve temperatuur, waarna ze in een array-formaat worden uitgeplukt, zoals hier te zien is.

De resulterende platen in het 384-formaat worden samengevoegd tot een array van 1536. Er werden drie UV-belichtingstijden getest om Chlamydomonas ts-mutanten te genereren. Empirisch gezien leverde de belichtingstijd van 1,5 minuut de meeste ts-mutanten op.

Echter leverde de blootstellingstijd van één minuut bij verre het meeste aantal kandidaten voor de celcyclus op. In dit experiment werden twee opeenvolgende assays voor het ts-fenotype uitgevoerd en werden ongeveer 3000 ts-mutanten geïsoleerd en fenotypisch gekarakteriseerd via time-lapse microscopie. Zoals hier te zien is, werden complementatie- en koppelingstesten met reeds gekarakteriseerde genen met meer dan twee allelen uitgevoerd op de nieuw verzamelde kandidaten om zeer frequent voorkomende genen uit de verdere pijplijn te verwijderen.

Deze kolonies vertonen geen complementatie met de query en vormen daarom nieuwe ts-allelen voor het onderzochte gen. Deze worden over het algemeen uitgesloten van verdere karakterisering. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze met een hoge doorvoersnelheid worden uitgevoerd.

Duizenden ts-mutanten kunnen in slechts twee of drie mutageneserondes worden geïsoleerd. Een cruciale stap na de isolatie van de ts-mutanten is het selecteren van een subset voor verder onderzoek, waarbij het zeer interessant is om het scala aan lethale fenotypes te observeren. Fenotypering geeft aanwijzingen over de moleculaire functie en helpt ons bovendien bij het prioriteren van mutanten voor nader onderzoek.

Houd er rekening mee dat de mutanten honderden of duizenden mutaties in hun genomen kunnen hebben. Meestal is er slechts één causaal, hoewel er soms twee mutaties nodig zijn voor het ts-fenotype; dit kan worden vastgesteld via tetra-analyse. Na deze procedure kunnen causale mutaties worden geïdentificeerd door next-generation sequencing-analyse van pools. De geïdentificeerde genen bevatten soms mutaties die iets over de functie suggereren, of het kunnen nieuwe, onbekende sequenties zijn, wat interessant en opwindend is.

Chlamydomonas is een uitstekend modelsysteem geweest voor het bestuderen van de celbiologie binnen het plantenrijk. De beschreven procedures zouden het onderzoek naar dit organisme moeten ontsluiten voor essentiële processen die relatief weinig zijn onderzocht, en we hopen dat de resultaten ook relevant zullen zijn voor het bredere plantenrijk.