High-throughput Robotisch Assisted Isolatie van temperatuurgevoelige Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Het algemene doel van de procedure is om robotica en gestandaardiseerde tests te gebruiken om de isolatie van temperatuurgevoelige dodelijke mutaties in Chlamydomonas te stroomlijnen om essentiële genen en paden in dit organisme te bepalen. We zijn geïnteresseerd in zowel conservatie als divergentie van essentiële cellulaire functies in eukaryoten. En de manier waarop we dat willen bestuderen is met mutaties die essentiële genen in deze processen verstoren.

Om dat goed te laten werken, heb je een echt uitgebreide verzameling mutanten nodig en de methoden die je zult horen, zijn onze manier om zo'n verzameling te genereren. We werken met de groene algen Chlamydomonas reinhardtii als vertegenwoordiger van het plantenrijk. Het grote voordeel van deze techniek is dat de temperatuurgevoelige dodelijke mutaties waarschijnlijk in elke essentiële route te vinden zijn.

De methode vereist geen voorkennis of gerichte mutagenese. Moleculaire functie van het gemuteerde gen wordt onmiddellijk gesuggereerd door het dodelijke fenotype. Dit helpt ons om interessante mutaties te selecteren die verschillende siala-routes verstoren, voorbij de celcycluscontrole.

Om UV-mutagenese uit te voeren, kweek Chlamydomonas-cellen tot een OD 750 van 0,2 tot 0,5 in 100 milliliter Tris-Acetaat-Fosfaat, of TAP, onder licht bij 25 graden Celsius en schudden bij 100 RPM. UV-mutagenese wordt onafhankelijk uitgevoerd in twee genetische achtergronden volgens het tekstprotocol. Controleer een monster van elke cultuur onder de microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen levensvatbaar zijn en vrij van besmetting.

Verdun vervolgens de cultuur tot een OD 750 van 0,003 en wikkel de fles in aluminiumfolie om een homogene dichtheid te garanderen, omdat de stam modaal is en directioneel zwemt als reactie op licht. Na het aanpassen van de dichtheid van de suspensie volgens het tekstprotocol, bevestigt u een kleine buiscassette die past op een vloeistofdispenser en voert u een reeks wasbeurten uit voor sterilisatie, volgens de instructies van de fabrikant, om besmetting te voorkomen. Gebruik een vloeistofdispensercassette met acht spuiten en verdeel vier per 96 druppels van twee microliters van elke cultuur op droge rechthoekige platen.

Tik zachtjes aan de rand van de plaat om ervoor te zorgen dat alle druppels samenvloeien tot een dunne laag vloeistof en bedek de platen onmiddellijk om blootstelling aan licht te voorkomen. Wanneer gedroogd, plaats de platen onder een germicide UV-lamp gedurende perioden die empirisch bepaald zijn om een optimale opbrengst van ts-mutanten onder de overlevenden te geven. Breng vervolgens de platen in het donker gedurende acht tot 24 uur bij kamertemperatuur.

Plaats vervolgens de platen in een 21 graden Celsius incubator met verlichting. Na ongeveer 10 dagen, wanneer de kolonies zijn gegroeid maar niet zijn samengevoegd, laad de platen in de relevante stack als bronnen voor robotische kolonie-picking. Selecteer vervolgens kolonies voor 384 arrays op rechthoekige platen en laat ze groeien bij 21 graden Celsius met verlichting gedurende ongeveer een week.

Gebruik een replica-plateringsrobot om de 384 arrays samen te vatten tot een 1536 array en laat de platen groeien in de 21 graden Celsius incubator gedurende ongeveer drie dagen. Repliceer de 1536 arrays naar twee platen elk en plaats er een in de 21 graden Celsius incubator en de andere in een 33 graden Celsius incubator. Na 24 uur bij 33 graden Celsius, repliceer de platen van de 33 graden Celsius incubator naar een nieuwe set voorverwarmde platen en plaats ze in de 33 graden Celsius incubator.

Na drie dagen groei bij 33 graden Celsius en vijf dagen groei bij 21 graden Celsius, gebruik een digitale camera om een rasterplaat te fotograferen die is gemarkeerd met negen uitlijningsindicatoren. Fotografeer vervolgens de platen, afwisselend 21 graden Celsius platen gevolgd door de corresponderende 33 graden Celsius platen, met alle platen in een vaste frame geplaatst om de exacte oriëntatie te behouden. Verwerk de gekoppelde 21, 33 plaatbeelden met een aangepaste matte lab beeldanalysesoftware om de achtergrond te elimineren en om de afbeeldingen in 1536 array te segmenteren.

Het programma zal de gedetecteerde bio-massa bepalen als totale pixelintensiteit op elke positie. Laad de lijst met geselecteerde kolonies die door de software is gegenereerd als een instructiebestand voor de robotica van enkele kolonie-picking. Bereid vervolgens de bron- en doelplaten voor volgens de robotica-instructies en laat de robot de geselecteerde kolonies naar een array kiezen.

Plaats de doelplaten ongeveer vijf dagen in de 21 graden Celsius incubator om een stockplaat te laten groeien. Na het uitvoeren van een tweede bio-massa-accumulatie-assay en het repliceren van 100 blokplaten volgens het tekstprotocol, repliceer de verse kopie van de 100 blokplaten naar drie exemplaren. Na de installatie van de derde plaat in de robot en het spotten van de kolonies, maak fotomicrografieën van een gebied van elk spot van de screeningsplaten op tijd nul en plaats de platen op 33 graden Celsius voor incubatie.

Op verschillende tijdstippen na het verwijderen van de screeningsplaten uit de 33 graden Celsius incubator, neem snel fotomicrografieën, zorg ervoor dat de plaathouder en de stagecontroller nauwkeurig zijn gekalibreerd om afbeeldingen van dezelfde cellen op elk tijdstip te krijgen. Analyseer microscopische beelden en selecteer mutanten op basis van de gewenste criteria. Spot de laatste geselecteerde set in een 96-arrayed agarplaat, zorg ervoor dat elke plaat mutanten van hetzelfde paringstype en geneesmiddelweerstand bevat.

Breng grote hoeveelheden van de arrayed kolonies over naar Stikstof-vrij gameteninductiemedium op 96-well microplates. Incubeer de platen onder licht gedurende ongeveer vijf uur om gametogenese mogelijk te maken. Suspensie vragen met de tegengestelde paringstypen die de alternatieve resistentiecassettes herbergen in buizen met Stikstof-vrij gameteninductiemedium voor gametogenese.

Meng de monsters van een doelplaat in een paringsmixvolume van 20 microliter. Na ongeveer 10 minuten onder licht, spot vijf microliter uit elk putje t