Name: High-throughput Robotisch Assisted Isolatie van temperatuurgevoelige Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Leer een geautomatiseerde methode voor het isoleren van temperatuurgevoelige letale mutanten in Chlamydomonas reinhardtii. Deze techniek identificeert essentiële genen en celbiologische processen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken de Cross lab leden voor advies en nuttige discussie. Dit werk werd ondersteund door PHS 5RO1-GM078153 en door een Junior Fellow award van de Simons Foundation Michal Breker.

1. UV Mutagenese <ol><li> Bereid een partij van 100-200 rechthoekige agarplaten met Tris-acetaat-fosfaat (TAP) gemiddeld 9,10. Bereid deze platen enkele dagen vóór en bewaar ze op de bank te drogen om snelle opname van de gesuspendeerde cellen te waarborgen in de volgende stappen. </li><li> Cultuur Chlamydomonas cellen tot 0,2-0,5 optische dichtheid (OD 750; ~ 2 dagen) in 100 ml vloeibaar TAP onder licht bij 25 ° C en schudden bij 100 rpm. LET OP: UV-mutagenese wordt onafhankelijk uitgevoerd in twee genetische achtergronden: Mat- Hygro r (resistentie tegen hygromycine B) en Mat + Paro r (resistentie tegen Paromomycin). Antibioticum keuze arbitrair, mits de twee parende typen complementaire Geneesmiddel resistentie. </li><li> Bekijk een monster van elk van de kweken onder de microscoop dat de cellen levensvatbaar en gezond (zwemmen en intact) en zonder vervuiling. LET OP: Overgrown culturen &quot;crash&quot; enverliest levensvatbaarheid, verschijnen als &quot;geesten&quot; in fase contrast microscopie. Bewaar geen shaker culturen gaan zodra ze verzadiging te bereiken. De &quot;geest&quot; fenomeen is gemakkelijk te detecteren in stap 1.3. </li><li> Verdun de cultuur tot 0,003 OD 750. Wikkel de fles met aluminiumfolie homogene dichtheid te verzekeren, omdat de stam beweeglijke en zwemt directioneel in reactie op licht. <ol><li> Pas de dichtheid van de suspensie op basis van de geplande dosis UV, zodat goed voor celdoding, 200 - 600 zullen overlevende kolonies vormen op de platen (figuur 1). Zie tabel 1 voor informatie over UV-blootstelling tijden. </li></ol></li><li> Bevestig een kleine buis cassette die een vloeistof afgeefinrichting past en voeren een reeks wassingen voor sterilisatie volgens de instructies van de fabrikant, om verontreiniging te voorkomen. </li><li> Met een doseerpomp 8 x 12, afzien 4 x 96 druppels 2 pi elk op rechthoekige platen (figuur 1 </strong&gt;). Tik lichtjes aan de rand van de plaat de samenvoeging van druppels te verzekeren in een dunne laag vloeistof en meteen daarna de platen om de blootstelling aan licht. <ol><li> Zeer zelfs enkele cel verspreiding waarborgen, gebruik droge platen, zoals hierboven vermeld, en snel de plaques bedekken om te voorkomen dat de cellen van het zwemmen in reactie op licht. Houd het rekenbordjes niveau en in het donker totdat alle vocht is opgenomen. </li></ol></li><li> Plaats de platen onder een kiemdodende UV-lamp (30 watt kiemdodend UV buis) gedurende tijdsperioden empirisch bepaald om een ​​optimale opbrengst aan TS- mutanten tussen de overlevenden geven. Hier gebruiken tijden van 0,5-1,5 min bij een afstand van 40 - 50 cm leiden tot 90-99,9% doding. Overlevenden bevatten 100 - 1000 UV-geïnduceerde puntmutaties, waarvan ~ 10% mutatie coderende sequenties. <ol><li> Met het oog op maximale kracht van UV-bestraling geen terugkeer te verzekeren als gevolg van licht-afhankelijke DNA-reparatie 11,12, werken in het donker bij deze stap en meteen inpakkenplaten in een donkere doos na bestraling. </li></ol></li><li> Houd de platen in het donker gedurende 8-24 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats de platen in een 21 ° C incubator met verlichting kolonies vormen. Kolonie formatie duurt ~ 10 dagen. Zorg ervoor dat de platen wrap met plastic zakken en voeg absorberend papier binnen te wissen vloeibaar condensatie. Verdamping en condensatie cycli anders vloeistoffilm routes voor verontreinigingen aan de platen voeren. </li><li> Laad de platen in de desbetreffende stapels als bronnen voor robot kolonie picking (figuur 2). Pick kolonies 384-arrays op rechthoekige platen, en ze groeien bij 21 ° C met verlichting (~ 1 week). </li><li> Condenseren 384-arrays in een 1536-arrays (4: 1) met een replica-plating robot (figuur 3), en laat de platen groeien ~ 3 dagen in de 21 ° C incubator. </li><li> Een kopie van de 1536-arrays om twee platen elkaar en plaats een in de 21 ° C incubator (permissievetemperatuur) en de ander in een 33 ° C incubator (restrictieve temperatuur). Na 24 uur, een kopie van de platen in 33 ° C om een ​​nieuwe reeks van voorverwarmde borden en leg ze in de 33 ° C incubator. OPMERKING: De reden hiervoor is dat secundaire plating ts letale mutanten kan in sommige gevallen accumuleren aanzienlijke biomassa, zelfs wanneer de cellen worden aangehouden in de eerste celcyclus na uitplaten. De secundaire replica elimineert dit signaal en verhoogt de gevoeligheid. </li><li> Fotograferen van de platen met een digitale camera na 3 dagen groei bij 33 ° C en 5 dagen kweek bij 21 ° C. Houd de platen in een vast frame. Gebruik een &quot;raster-plate&quot; gemerkt met negen alignment indicatoren die samen wordt gefotografeerd met de kweekplaten (figuur 4). Foto kweekplaten als afwisselende gepaarde 21 ° C en 33 ° C (21/33) beelden. OPMERKING: verschillende incubatietijden worden gebruikt om groei gelijk omdat de wildtype aanzienlijk groeitsneller bij 33 ° C dan bij 21 ° C. </li></ol> 2. Identificatie van de ts Mutant Kandidaten: eerste scherm <ol><li> Verwerk de gepaarde 21/33 plaat beelden met een aangepaste Matlab beeldanalyse software om de achtergrond en het segment van de afbeeldingen in een 1536-serie te elimineren. Het programma zal de gedetecteerde biomassa (totaal pixel intensiteit) in elke positie (figuur 5) te bepalen. LET OP: De software (meegeleverd in de SI samen met instructies) zal het de grid-plaat gebruiken om de locaties van cellen (individuele inzendingen) in een 1536-serie op de vergroting en de plaat alignment gebruikt te bepalen en te berekenen totale pixel intensiteit in elke cel . Deze waarden voor elke mutant worden vervolgens vergeleken met instelbare parameters om gewenste groei bepalen bij 21 ° C ten opzichte van een ts + standaard en de mate van temperatuur-gevoeligheid, gedefinieerd als: S (Mut 33) / S (WT 33) / S (Mut 21) / S (WT 21), waarbij S signaal (pixelintensiteit na achtergrond aftrek), Mut een individuele mutant en &quot;WT&quot; is een willekeurig gekozen niet-temperatuurgevoelige kolonie (gemutageniseerde stam die ts + fenotype hadden). Groei bij 21 ° C wordt gedefinieerd als S (Mut 21) / S (WT 21). In dit eerste scherm, gelden relaxed selectiecriteria (waardoor een relatief lage groei bij 21 ° C en een relatief lage mate van temperatuurgevoeligheid) om de valse negatieve rente laag te houden. </li><li> Laad de lijst van geselecteerde kolonies die door de software een instructie bestand voor de enkelvoudige kolonie picking robots (meestal in een 384-array). Bereid de bron en doel platen volgens de instructies robotica en kies kolonies array (figuur 6). LET OP: Conventionele plukkers vereisen een instructie-bestand in sommige formaat, zoals .csv, .txt of .xls. Alle plukkers zal de capaciteit hebben om bestand te zijn gedreven te hebben; verschillende formaten zullen kleine bewerking van de MATLAB-code (broncode) vereisen. </li&gt; <li> Leg het doel platen in de 21 ° C incubator voor ~ 5 dagen te groeien van een voorraad plaat. </li></ol> 3. Het identificeren van ts Mutants: Second Screen <ol><li> Herhaal stap 2.1 tot geplukt kolonies opnieuw te testen. Gewoonlijk 30 - 50% van de kolonies test opnieuw zo duidelijk ts letale mutaties, voor een opbrengst van 2% - 5% ts letale opzichte van aanvankelijke kolonies overleven UV mutagenese. </li><li> Herhaal stap 2.2 voor het plukken van twee gescreende ts letale mutaties, maar met een gewijzigde instructiebestand ontworpen array kolonies in blokken van 100 kolonies op rechthoekige platen bij een 384-dichtheid. Dit is handig voor microscopisch onderzoek in de volgende stap. De instructie bestandsindeling wordt opgegeven tijdens runtime door de MATLAB-code. </li><li> Zorg ervoor dat meerdere WT kolonies als controle omvatten en plaats de platen bij 21 ° C gedurende ~ 5 dagen. </li></ol> 4. Eerste Fenotype Bepaling <ol><li> Een kopie van de 100-blok platen bekleed met stap 3.2 en plaats ze in de 21 ° C Incubator voor ~ 2 dagen vers groeiende kolonies te verkrijgen. </li><li> Een kopie van de nieuwe kopie van de 100-blok platen (4.1) tot drie exemplaren. Plaats een exemplaar in de 21 ° C incubator en een in de 33 ° C incubator als controle. </li><li> Plaats de derde exemplaar ( &quot;screening platen&quot;) in een robot setup, en ter plaatse de kolonies met lange pinnen aangeraakt met gesteriliseerd water. LET OP: Chlamydomonas cellen vastgemaakt aan agar robot hebben de neiging om in eerste instantie het land als een vrij dichte plek van cellen, met weinig enkele cellen beschikbaar voor microscopische inspectie. Voor het optimaliseren van de kolonies van de microscoop, spot het aanvankelijk overgedragen cellen met een druppel water (de hoeveelheid water overgebracht door de robot lange pennen ~ 100 nl). Dit leidt tot dispersie van de cellen in een kleine straal (~ 1 mm) over de eerste pinning centrum met veel geïsoleerde enkelvoudige cellen. </li><li> Neem microfoto van een gebied van elke plek van de screening platen op tijdstip 0 (terwijl nog steeds single, onverdeelde cellen) (Figuur 7) en plaats de platen bij 33 ° C incuberen. Bepaal image locatie aan de handmatige fase controle van een gemodificeerde viertal dissectie microscoop ingesteld stopt bij de 4,5-mm hart op hart afstand van een 384-density matrix geven. </li><li> Verwijder de screening platen uit de 33 ° C incubator en neem microfiches, zoals in stap 4.4, op verschillende tijdstippen (10 uur, 20 uur, 48 uur). Zorg ervoor dat het podium, de plaat houder, en het podium controller zijn nauwkeurig gekalibreerd om beelden van dezelfde cellen te krijgen in elk tijdstip. Voer snel photomicrograph acquisitie (~ 10 min). </li><li> Gebruik het tweede exemplaar in de 33 ° C incubator naar de ts fenotype te verifiëren en om ervoor te zorgen dat de temperatuurschommelingen tijdens beeldacquisitie hebben geen grote invloed op ts fenotype. <ol><li> Analyseren microscopische afbeeldingen en selecteer mutanten op basis van de gewenste criteria (Figuur 8). Spot de laatste geselecteerde set in een 96-array agar plaat. Zorg ervoor dat elkeplaat bevat mutanten van hetzelfde type paring en resistentie tegen geneesmiddelen. </li><li> Voor elke plaat, voorzien van de laatste twee kolommen een positieve (vraag mutatie) en een negatieve (WT) controle voor de complementatie assay. </li></ol></li></ol> 5. Complementatie en scharniermechanisme Testen van New Mutants aan &quot;Frequent Flyer&quot; <ol><li> Transfer grote hoeveelheden van de array kolonies stikstofvrije gameet-inductiemedium 10 in 96 putjes microplaten (dichtheid van elke kolonie duurt ongeveer 0,2 OD). Incubeer de platen onder licht (13-20 W kwik lampen) voor ~ 5 uur tot gametogenese mogelijk te maken. LET OP: Deze stap kan worden uitgevoerd ofwel met een repliceren robot setup of handmatig met een eenvoudige plating apparaat. </li><li> Opschorten queries met de andere voortplantingstypes het herbergen van de alternatieve weerstand cassettes in buizen met stikstof-vrije gameet-inductie medium 10 voor gametogenese. </li><li> Meng de monsters in een doel plaat in een paring mixture volume van 20 pl (figuur 9). Na ~ 10 min onder het licht, spot 5 ul van elk putje twee keer: een keer op een TAP plaat voor koppeling testen en eenmaal op TAP + 5 uM Paro + 9 uM Hygro voor complementatie testen. </li><li> Incubeer de koppeling platen in de 21 ° C incubator &#39;s nachts, en vervolgens wikkel ze in folie. Houd ze in het donker gedurende 5 dagen om zygospore vorming mogelijk te maken. </li><li> Incubeer complementatie-testplaten voor ~ 10 dagen in het donker staan ​​bij 21 ° C. OPMERKING: De drug bedragen zijn afgestemd op overleving dubbel heterozygote diploïde mogelijk, maar nog voldoende om de dekking haploïden elimineren. Deze bedragen werden gekalibreerd voor standaard weerstand cassette integraties die in dit specifieke project; met nieuwe integraties, moet de dosis opnieuw worden gekalibreerd. De meeste biomassa wordt geverifieerd diploïde met flowcytometrie (Figuur 9), hoewel voor variërende haploïden (waarschijnlijk van meiose en groei dubbel resistentesegreganten) wordt meestal waargenomen ook. </li><li> Repliceren de-complementering testen platen in twee exemplaren voor de TS-fenotype identificatie. Plaats een kopie bij 21 ° C en een kopie bij 33 ° C gedurende ~ 5 dagen. </li><li> Test kolonies voor de TS-fenotype, zoals beschreven in paragraaf 2.1 (Figuur 5). Kolonies die geen aanvulling met de vraag vertegenwoordigen waarschijnlijk allelen van hetzelfde gen als de query (diploïden hetero-allelische mutaties in hetzelfde gen). </li><li> Voor koppeling testen, volgende stap 5.4, verschuiven de borden terug aan het licht meiose en uitgroei van haploid segreganten voor ~ 7 dagen mogelijk te maken. </li><li> Repliceren koppeling testplaten TAP + 10 pM en 10 pM Paro Hygro selecteren voor dubbele resistente nakomelingen (voorspelde 25% van de haploïde nageslacht, aangezien de cassettes gekoppelde) en incubeer bij 21 ° C gedurende een week. OPMERKING: Verhoging van de drug dosering voor dubbel resistente haploïden. </li><li> Test kolonies voor de TS-fenotype, zoals ikn stap 2.1. LET OP: Een TS-fenotype wordt verwacht (en waargenomen) voor mutanten in dezelfde complementatie groep als de query. Daarnaast is een TS-fenotype in de binding assay, een mutant die de query aanvult, kan vast verband tussen de query en de nieuwe mutatie weerspiegelen. Mutanten die de geteste query aanvulling waarschijnlijk nieuwe genen die de pijpleiding bioinformatic identificatie van de veroorzakende laesie voor verdere fenotypische analyse voeren en uiteindelijk. </li></ol>

<ol><li>Tulin, F., Cross, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microbial+avenue+to+cell+cycle+control+in+the+plant+superkingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A microbial avenue to cell cycle control in the plant superkingdom.</a> Plant Cell. 26, 4019-4038 (2014).</li>
<li>Cross, F. R., Umen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydomonas+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The Chlamydomonas cell cycle.</a> Plant J. 82, 370-392 (2015).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Indexed%2C+Mapped+Mutant+Library+Enables+Reverse+Genetics+Studies+of+Biological+Processes+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Indexed, Mapped Mutant Library Enables Reverse Genetics Studies of Biological Processes in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Cell. 28, 367-387 (2016).</li>
<li>Tulin, F., Cross, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin-Dependent+Kinase+Regulation+of+Diurnal+Transcription+in+Chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cyclin-Dependent Kinase Regulation of Diurnal Transcription in Chlamydomonas.</a> Plant Cell. 27, 2727-2742 (2015).</li>
<li>Simchen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell cycle mutants.</a> Annu. Rev. Genet. 12, 161-191 (1978).</li>
<li>Hartwell, L. H., Culotti, J., Reid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+the+cell-division+cycle+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22I.+Detection+of+mutants.+Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genetic control of the cell-division cycle in yeast.</a> I. Detection of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 66, 352-359 (1970).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+exploration+of+essential+yeast+gene+function+with+temperature-sensitive+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants.</a> Nat. Biotechnol. 29, 361-367 (2011).</li>
<li>Ben-Aroya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+temperature-sensitive+mutant+repository+of+the+essential+genes+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell. 30, 248-258 (2008).</li>
<li>Harris, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarris%2C+E+%22The+Chlamydomonas+Sourcebook%3A+Introduction+into+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use%22">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction into Chlamydomonas and Its Laboratory Use</a>. , Elsevier Academic Press. (2008).</li>
<li>Dutcher, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+and+tetrad+analysis+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mating and tetrad analysis in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Methods Cell Biol. 47, 531-540 (1995).</li>
<li>Gill, S. S., Anjum, N. A., Gill, R., Jha, M., Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+repair+in+plants+under+ultraviolet+and+ionizing+radiations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+World+J%22%5BJournal%5D)">DNA damage and repair in plants under ultraviolet and ionizing radiations.</a> Sci World J. 2015, 250158(2015).</li>
<li>Liu, Z., Wang, L., Zhong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+mechanisms+of+DNA+repair+by+photolyase%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Chem.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Dynamics and mechanisms of DNA repair by photolyase.</a> Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 11933-11949 (2015).</li>
<li>Francis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+and+plant+development.+Annual+Plant+Reviews%2C+Volume+32%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Bot%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control and plant development. Annual Plant Reviews, Volume 32.</a> Ann. Bot. 101, 1049-1050 (2008).</li>
<li>Zachariae, W., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whose+end+is+destruction%3A+cell+division+and+the+anaphase-promoting+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Whose end is destruction: cell division and the anaphase-promoting complex.</a> Genes Dev. 13, 2039-2058 (1999).</li>
<li>Merchant, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydomonas+genome+reveals+the+evolution+of+key+animal+and+plant+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions.</a> Science. 318, 245-250 (2007).</li>
<li>Ben-Aroya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+temperature-sensitive+mutant+repository+of+the+essential+genes+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. 30, 248-258 (2008).</li>
<li>Mnaimneh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+essential+gene+functions+via+titratable+promoter+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles.</a> Cell. 118, 31-44 (2004).</li>
<li>Schuldiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).</li>
<li>Jiang, W., Brueggeman, A. J., Horken, K. M., Plucinak, T. M., Weeks, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transient+expression+of+Cas9+and+single+guide+RNA+genes+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Eukaryot. Cell. 13, 1465-1469 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen grote financiële belangen.

De hier beschreven high yield isolatie van ts letale mutanten pijpleiding zodat vermoedelijk alle cellulaire essentiële routes van de Chlamydomonas genoom zijn weergegeven. De twee meest kritische stappen voor een efficiënte inzameling van potentiële celcyclus genen en voor de eliminatie van repetitieve &quot;frequent flyer&quot; allelen zijn: 1) de coherente definitie van de arrestatie fenotype kenmerken voor onvolledige cel cycli en 2) de parallelle complementatie test tegen al-geïdentificeerde opvragen genen aan de collectie met nieuw geïsoleerde degenen vergroten. Wanneer gesynchroniseerd door licht-donker cyclus, Chlamydomonas groeit fotosynthetisch overdag en een toename van celgrootte&gt; 10x zonder DNA-replicatie of celdeling 13. Ongeveer samenvalt met het begin van de nacht, cellen vervolgens aan meerdere cycli van afwisselend DNA-replicatie, mitose en celdeling (Figuur 8). Deze regelgeving scheme een natuurlijke onderscheid tussen genen primair vereist voor groei en celintegriteit en genen specifieke vereisten van de celdelingscyclus. We vonden dat de 10-uur en 20-uur tijdstippen zeer informatief voor een eerste ruwe fenotypische gesneden 1. De brede klassen van ts dodelijke mutanten die we op dit moment te herkennen, op basis van deze beelden (zie SI in Tulin en Cross, 2014) 1, zijn: Notch, Popcorn, Ronde, Small, Medium, vroeg lysis en multiple-cyclus (figuur 8 ). De drie meest relevante categorieën richten we ons op zijn Notch, Popcorn, en Round. De &quot;Notch&quot; en &quot;popcorn&quot; fenotypen werden eerder aangetoond kenmerk van de meeste celcyclus-specifiek laesies (bijvoorbeeld, mitotische cycline-afhankelijke kinase, DNA replicatie machines en topoisomerase II) 1. De verschijning van een (Notch) of meervoudige (Popcorn) schijnbare vlakken van beginnende, maar mislukte celdeling is een handige Morphological indicator van de celcyclus initiatie. Deze mutanten vertonen in het algemeen weinig of geen groei afwijkingen, met stijgingen in celvolume Soortgelijke WT op de 10-uur mark. De Notch en Popcorn fenotypes zijn evident om 10 uur en worden volledig ontwikkeld (vaak geassocieerd met cellysis) met 20 uur. &quot;Round&quot; cellen groeien vergelijkbaar met WT, maar met een veel-verminderde productie van schijnbare beginnende divisie vliegtuigen, hetgeen aldus grote, ronde gearresteerd cellen. Vorige mutanten in deze categorie zijn gevallen in componenten van het anafase bevorderen complex 14 of genen die nodig zijn voor microtubule functie (-tubuline vouwen cofactoren, gamma-tubuline ring complex) 1. Op latere tijdstippen, deze cellen vertonen vaak uitgesproken cellysis. &quot;Small&quot; en &quot;Medium&quot; cellen groeien ofwel verwaarloosbaar (Small) of aanzienlijk minder dan WT (Medium). Veel van deze mutanten die tot nu toe hebben laesies in genen waarvan de annotaties suggereren rollen in basic cellular groeiprocessen (vertaling of membraan biogenese). De belangrijkste microscopische discriminatie tussen Medium and Round rust op het bedrag van de groei bij 10 uur (Round: zoals WT; Medium: gereduceerd). Omdat de kleine en middelgrote categorieën zijn vrij groot en waarschijnlijk weerspiegelen laesies in een groot scala van cellulaire routes, zijn we niet proberen om deze categorieën te verzadigen; Maar willen we moleculair identificeren vertegenwoordigers van de klasse tot fenotypes van het verlies te begrijpen in diverse trajecten. Twee unstudied categorieën: 1) Begin-lyserende mutanten die integriteit verliezen (verlies van groene kleur verloren refractility) Door de 10-uur merk, weinig aanwijzingen dat ook de voorafgaande cel en 2) de meerdere cycli. Prolifereren vergelijkbaar met WT bij 10 en 20 uur, hoewel zij volledig onvermogen proliferatie langere termijn uit te voeren vertonen. We zijn vooral karakteriseren &quot;notch&quot;, &quot;popcorn&quot; en &quot;round&quot; en sluiten van kleine en middelgrote round cellen, evenalszo lek mutanten die volledige aantal celdelingen. Dit is hoofdzakelijk te zorgen dat de fundamentele cellulaire functies, zoals groei en membraanintegriteit, functioneel en verrijken de kans op dienstbelang genen. Deze benadering blijkt empirisch efficiënt; echter kan het zijn dat een celcyclus gen pleiotrope en heeft extra rollen eerder G1, voordat de werkelijke deling. Dergelijke gevallen, waarvan wij verwachten zeldzaam te zijn, worden gemist. Meer in het algemeen, streven we naar homogene arrestatie, die in hoge mate van waarschijnlijkheid is te wijten aan een oorzakelijke mutatie die is een volledig disfunctioneel eiwit. Echter, om dezelfde reden als hierboven beschreven, kunnen er meerdere arrestatie punten en dus enige flexibiliteit is wenselijk bij het kiezen kandidaten. Om de collectie met nieuw geïdentificeerde genen verrijken, worden de geselecteerde gegadigden getest op complementatie. Wij eisen TS-in de positieve controle (query vraag mutatie) en ts + in de negatieve controle (query tegen WT). Nieuwe mutanten in dezelfde complementatie groep als de TS-query. Het lidmaatschap in dezelfde complementatie groep weerspiegelt bijna altijd een moleculaire laesie in hetzelfde gen (dit is het geval voor elk van die genen die we hebben getest geweest). Daarom is voor &#39;frequent flyers,&#39; dit criterium is uitsluiting voor verdere karakterisering. Mutanten die niet dezelfde complementatie groepen als de geteste query waren zijn kandidaten voor nieuwe genen en worden verder gekenmerkt door bioinformatica en experimentele gereedschappen. Zeer variabel herstel van TS-allelen in verschillende complementatie groepen is een bekend verschijnsel, dat wil zeggen variabiliteit is aanmerkelijk groter dan Poisson ruis als gevolg van de grote intrinsieke variabiliteit van veranderlijkheid te TS- tussen verschillende genen. Oorzaken intrinsieke thermolabiliteit verschillen kunnen onder meer; ander eiwit maten; de aanwezigheid van een eiwit als monomeer versus een groot, stabiel complex; en mutagene hot spots. Dit is bijna zuivere nuisaNVU. Echter, een resulterende gunstige resultaat is dat de &quot;frequent flyer&quot; lijst is niet lang (met slechts een paar doelen bezetten het grootste deel van de lijst), zodat de arbeidsintensieve complementatie testen is niet een enorme onderneming, totdat de latere fasen van het project. Als een complementaire aanpak, hebben we een koppeling assay. In deze assay worden dubbel-resistente nakomelingen geselecteerd en getest op de TS-fenotype. Een TS-fenotype wordt verwacht (en waargenomen) mutanten in dezelfde complementatie groep als de vraag of nauw verbonden mutaties. Voor elk van de geteste genen, is een WT nageslacht verwacht (ts + fenotype) te verschijnen in een zekere waarschijnlijkheid afhankelijk van de genetische afstand. We schatten dat er ongeveer 100 zygospore voor elke paring in deze plaatsen. Uitgaande van 100% meiotische efficiency, resulteert dit in ongeveer 100 dubbel-resistente nageslacht uit de gekoppelde geneesmiddelresistentie cassettes (25% van de meiotische nakomelingen per vier meiose door Mendelian overerving). Dit zou ook voor TS-mutaties, waarbij 25% van de nakomelingen dubbele mutant zal zijn, en 25% zal WT als de query en test mutaties losgekoppeld. Daarom is uit de double-resistente nageslacht, zal 25% bedragen WT (ongeveer 25 cellen). Dit is het geval voor het volledig gekoppelde mutaties; echter matig koppeling (binnen ~ 20 cM, ongeveer 2 Mb of 2% van het genoom 115) sterk zal verminderen of elimineren ts + signaal. Bij koppeling van de geteste mutatie het antibioticum cassette, ts + haploïden die dubbel resistente aanwezig in zeer kleine hoeveelheden. Dit manifesteert zich als duidelijk niet recombineren met alle geteste mutanten, ondanks aanvulling alle geteste mutanten een afwijkende zodat gemakkelijk vastgesteld; in dat geval wordt terugkruisen het probleem oplossen. Zowel voorkennis en van sequentieanalyse, verwachten we celcyclus genen in de Chlamydomonas tot ongeveer 500 genen 2, hoewel most, maar waarschijnlijk niet alle, zijn van essentieel belang. We zullen de noodzaak van bijkomende mutagenese rondes als meer mutanten worden verzameld en het verzadigingsniveau stijgt evalueren. Deze procedure is speciaal ontworpen voor het bestuderen van essentiële biologische processen en de genen en eiwitten die ze uitvoeren. Andere methoden voor het genereren van verstoringen in essentiële genen bestaan (bijvoorbeeld omzetting van willekeurig gemutageniseerde allelen 16, conditioneel getranscribeerd allelen 17 of hypomorfe allelen 18). Echter, ze vereisen allemaal homologe recombinatie, die sterk wordt onderdrukt tijdens vegetatieve Chlamydomonas. De geclusterde regelmatig interspaced korte palindroom repeat (CRISPR) / Cas9 systeem is opgericht als een krachtig hulpmiddel voor genetische modificatie 19; Het is echter nog niet efficiënt in Chlamydomonas 20 werken. Kritisch, al deze werkwijzen voorkennis van het doel nodig. Dit is een ernstige beperkingals men wil de mogelijkheid om iets nieuws te leren! Onze aanpak zal mutaties identificeren van essentiële genen, onafhankelijk van enige voorkennis op. Daarom is op het huidige niveau van de technologie, isolatie van willekeurige ts mutaties gevolgd door gen-identificatie door diepe sequencing kan de meest efficiënte methode van het verkrijgen van snelle inwerkingtreding microbiële celbiologie in de plant superkingdom zijn. Identificatie van causale mutaties (uit ~ 100-coderende-sequentie veranderen mutaties in elke kloon) valt buiten het bestek van dit artikel. Deep sequencing van tankmelk segregant zwembaden 1 is effectief, maar arbeidsintensief. Een combinatorische zwembad strategie voor de bepaling van mutaties in een groot aantal stammen, na sequentiëren een klein aantal pools, is zeer arbeidsintensief en kosten- effectief. Een nieuwe strategie voor combinatorische tankmelk segregant sequencing is in ontwikkeling, dat de identificatie van de oorzakelijke mutaties in tientallen mutanten sim zal toestaanultaneously in één sequencing run (in voorbereiding). De rendementen zijn bijzonder belangrijk dat de kritische gen identificatiestap gelijke tred houden met de snelle accumulatie van mutanten die mogelijk wordt gemaakt door de hier beschreven procedures.

Fenotypische karakterisering van systematische mutant collecties van model organismen is een bewezen aanpak voor het ontleden van cellulaire complexiteit. De haploïde ééncellige groene alg Chlamydomonas reinhardtii heeft een fabriek-achtig gen set, maar het afweken van landplanten voor meerdere genoomduplicaties in het land fabriek lijn 2. In principe is het ontbreken van gen duplicatie en een voornamelijk haploïde levenscyclus vergemakkelijkt aanzienlijk verlies-van-functie genetische benaderingen. Echter, gerichte verstoring van genen van belang bijna onmogelijk door het gebrek aan efficiënte homologe genomische integratie. Een willekeurige insertie verstoring bibliotheek is in aanbouw, in combinatie met de identificatie van de verstoorde site, tot nu toe waardoor een bekleed set van 1935 in kaart gebracht verstoringen die 1562 genen 3. Deze benadering (naar verwachting in het algemeen null mutaties) geldt niet essentiële genen. Temperatuur-gevoelige (ts) mutaties kunnen worden recovered in essentiële genen, en recente werkwijzen maken efficiënte identificatie van het gemuteerde gen en de veroorzakende lesie. Fenotypische analyse bij hoge temperatuur verschaft vervolgens direct informatie over de functie van het gemuteerde gen. We verslag uit over de isolatie en karakterisering van ts letale mutaties in ~ 70 essentiële genen in Chlamydomonas, met bijzondere aandacht voor genen betrokken bij celcyclus progressie en controle 1,4. Ts dodelijke schermen hebben een steunpilaar van genetische analyse is in microorganismen decennia 5,6. In principe kan een gewenst kenmerk is &quot;verzadiging&quot;, wat betekent dat alle genen kunnen muteren tot letaliteit ts worden geïdentificeerd door ten minste één mutant, waardoor een volledige analyse benaderen. Echter, in de praktijk een aantal factoren beperken de aanpak verzadiging. Eerst, terwijl bijna alle genen worden gemuteerd om verlies van activiteit bij hoge temperatuur, de efficiëntie van terugwinning van dergelijke mutanten varieert over ten minsteeen orde van grootte 7,8. Daarom begint een willekeurig scherm op te halen terugkerende hits in &quot;frequent flyers&quot;, lang voordat de verzadiging is benaderd. Ten tweede, terwijl ts mutaties meestal resulteren in vermindering van de functie, ze niet waar zijn nullen op een restrictieve temperatuur (en omgekeerd, vaak niet volledig functioneel bij een permissieve temperatuur). Dit probleem kan worden aangepakt deels door het vergelijken van meerdere allelen; dat deze allemaal een gemeenschappelijk fenotype delen, dit is waarschijnlijk een gevolg van de eenvoudige inactivering van het gen weerspiegelen. Meerdere allelen zijn ook zeer nuttig zijn voor de definitieve moleculaire identificatie van de veroorzakende letsel 1. Echter, de &quot;frequent flyer&quot; probleem betekent dat meerdere allelen in zelden getroffen genen die moeilijk te herstellen zijn. Om deze redenen hebben we de ontwikkeling van een verbeterde pijplijn te isoleren en fenotypisch karakteriseren ts mutanten. We hebben meer dan 3000 ts-mutanten tot nu toe verzameld, including ongeveer 200 nieuwe kandidaat celcyclus mutaties. Moleculaire en fenotypische analyse van deze collectie, die al waarschijnlijk omvat mutaties in de meeste of alle cel-essentiële trajecten moeten nieuwe inzichten en hypotheses in plantaardige celbiologie bieden. Belangrijk, kan deze leiding worden toegepast op elk micro-organisme dat groeit op agar ts mutant collecties efficiënt te construeren. Een opmerking over uitrusting: twee robots zijn erg belangrijk voor de efficiëntie in deze procedure (een kolonie picker en een combinatie replica Plater / hoogwerker). Plukkers hebben meestal metalen pinnen. Geplukt kolonies worden gehouden in de lucht op deze pinnen voor een bepaalde periode (seconden tot minuten, afhankelijk van het model). Chlamydomonas sterft in ongeveer 20 seconden op een metalen pin in de lucht. Dit beperkt model keuze voor het organisme. Nauwkeurigheid zaken. Onze kolonie picker is redelijk nauwkeurig; echter enigszins gewelddadig haar optreden en heeft enkele mogelijkheid met sprays kruisbesmetting. Het is niet te hooger is dan de 384 dichtheid (4,5 mm midden-hart gemeten); Dit dichtheid, de nauwkeurigheid is volledig acceptabel. De replica plating / cherry picking robot (verschillende uitrusting gebruikt voor deze toepassingen) veel langzamer op plukken, maar is nauwkeurig genoeg voor de 1536 densiteit (6144 is een uitdaging, zelfs voor deze zeer nauwkeurige robot, we deze dichtheid geëvalueerd maar niet gekozen te gebruiken vanwege de verschillende moeilijkheden). De robot zal niet goed werken als platen ongelijk worden geladen, enz. Het is belangrijk om ter plaatse te controleren om zeker te zijn van de juiste dingen gebeuren; Uiteraard zal de robot zonder toezicht en in het algemeen alle gaat veel als de eerste paar platen correct waren.

<table><tbody><tr><td>Uitrusting:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hudson RapidPick colony picker</td><td>Hudson Robotics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiDrop Combi Reagent Dispenser</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Small tube metal tip cassette</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Singer RotoR replica-plating robot</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td>Zeer essentieel voor het proces. Voor screenings op kleinere schaal kunt u een intern handmatig gereedschap gebruiken</td></tr><tr><td>Singer single-colony picking attachment (&lsquo;Stinger&rsquo;)</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td>Kan handmatig worden gekozen, maar voor grote schalen is het bijna onmogelijk</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Materialen:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green Nucleic Acid Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput robotisch assisted isolatie van temperatuurgevoelige lethal mutants in<em&gt; chlamydomonas reinhardtii</em

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematische identificatie en karakterisering van genetische verstoringen zijn nuttig gebleken om genfunctie en cellulaire routes te ontcijferen. Echter, de conventionele benaderingen van permanente gendeletie kunnen niet worden toegepast op essentiële genen. We hebben een unieke collectie van ongeveer 70 temperatuurgevoelige (ts) lethale mutanten gepionierd voor het bestuderen van celcyclusregulatie in de eencellige groene algen Chlamydomonas reinhardtii1. Deze mutaties identificeren essentiële genen en de ts-allelen kunnen conditioneel worden geïnactiveerd door temperatuurverandering, wat waardevolle hulpmiddelen biedt om essentiële functies te identificeren en te analyseren. Mutantencollecties zijn veel waardevoller als ze bijna volledig zijn, aangezien willekeurige collecties belangrijke componenten kunnen missen. Dit vereist echter de efficiënte verzameling van een groot aantal mutanten, vooral bij een breed-doelwitscreen. Hier beschrijven we een robotica-gebaseerde pipeline voor het genereren van ts-letale mutanten en het analyseren van hun fenotype in Chlamydomonas. Deze techniek kan worden toegepast op elk micro-organisme dat op agar groeit. We hebben meer dan 3000 ts-mutanten verzameld, waarschijnlijk inclusief mutaties in de meeste of alle cel-essentiële routes, inclusief ongeveer 200 nieuwe kandidaat-celcyclusmutaties. Verdere moleculaire en cellulaire karakterisering van deze mutanten zou nieuwe inzichten in plantencelbiologie moeten opleveren; een uitgebreide mutantencollectie is een essentiële voorwaarde om dekking van een breed scala aan biologische routes te garanderen. Deze methoden zijn geïntegreerd met downstream genetica en bioinformaticaprocedures voor efficiënte mapping en identificatie van de oorzakelijke mutaties die buiten het bereik van dit manuscript vallen.

We tonen een versnelde pijpleiding voor het isoleren van ts-mutanten in Chlamydomonas. Cellen worden afgegeven op agarplaten, en kort daarna snel validering onder de microscoop voor eenmalig celdichtheid, platen UV bestraald (figuur 1). Typische bestraalde kolonies worden geïdentificeerd en opgepikt in een array format na 10 dagen kweek bij een permissieve temperatuur (figuur 2). De resulterende platen in de vorm 384 worden gecombineerd in een 1536-array (figuur 3). Uit deze eerste stappen van het verzamelen van bestraalde kolonies, hebben we gekleed ~ 200.000 kolonies tot nu toe. De dichtheid van de suspensie wordt aangepast op basis van de geplande dosis UV zodat goed voor dood, 200-600 overlevende kolonies op de platen vormen. Drie UV belichtingstijden (1,5 min, 1 min en 0,5 min) en drie dichtheden dienovereenkomstig getest (Tabel 1). Empirisch de 1,5 min belichtingstijd leverde meeste ts- Mutanten (~ 50%); Verreweg, 1 min leverde meeste celcyclus kandidaten. Daarom werden geen UV mutagenese ronden gedaan met slechts 1 min. Een belangrijk aandachtspunt is het spetteren tijdens de eerste plukken en de kruisbesmetting (vooral in de high-density formats). Dit kan leiden tot duplicatie en verdere fenotypering van dezelfde mutant tweemaal. Om de kans op een dergelijk scenario te minimaliseren, zorg om kolonies te halen bij de optimale grootte, en zorg ervoor dat aangrenzende kolonies niet in de eerste test worden geplukt. Vervolgens twee opeenvolgende TS-fenotype assays (figuur 5) uitgevoerd, en ongeveer 3000 TS-mutanten werden geïsoleerd en fenotypisch gekarakteriseerd door time-lapse microscopie (Figuur 8). Als gevolg van de biologische focus op het bestuderen van de celcyclus van interesse in fenotypes die aan bepaalde criteria voldoen, we zijn niet geïnteresseerd in het verzamelen van meer dan twee allelen in elke doelgroep gene. Daarom voerden we complementatie en koppeling immuniteitsonderzoek met reeds kenmerk genen met meer dan twee allelen (Query) tegen nieuw verzamelde kandidaten sterk terugkerende genen van de stroomafwaartse leiding (Figuur 9) te verwijderen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig1.jpg" /> Figuur 1: Uniform Verspreiding van gemutageniseerde cellen en UV-mutagenese. (a) 384 x 2 pl druppels worden afgegeven op een agarplaat zonder reagens dispenser. (b) Willekeurig platen onderzocht onder de microscoop eencellige density verifiëren en UV bestraald met een 1-min blootstelling. Schaal bar = 50 micrometer. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54831 / 54831fig2.jpg&quot; /&gt; Figuur 2. UV-gemutageniseerde Kolonies pakte voor de 384-arrays. (a) één UV-bestraalde cellen worden gekweekt ~ 10 dagen van zichtbare kolonies. Schaal bar = 2 cm. (b) Beeldanalyse programma herkent scheiden kolonies op basis van bepaalde parameters en robot arrays ze in 384 platen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig3.jpg" /> Figuur 3. samenvoegen tot de 1536-serie. Vier 384-formaat platen worden samengevoegd tot een 1536-plaat; eenmaal plaatsvinden, worden ze weer herhaald om te testen op de TS-fenotype. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om te bekijken</a>grotere versie van dit cijfer. <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig4.jpg" /> Figuur 4. Imaging voor kwantificering. (a) De platen worden vastgehouden in een frame onder een document photography stand zodat alle platen in een reeks zijn gefotografeerd bij dezelfde vergroting en positionering. (b) Het eerste beeld is van een 1536-well microtiterplaat met rode stippen geplaatst op de hoeken en middelpunten. Dit &quot;net-plate&quot; beeld bepaalt de positie van de array. (c) Voorbeeld van een 1536-serie na incubatie. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig5.jpg" /> Figuur 5. Identificatie van de TS-fenotype Semi-automated Image Analysis. Plate beelden worden geanalyseerd door aangepaste MATLAB software (meegeleverd in het SI). Het beeld wordt automatisch gesegmenteerd in cel arrays (96, 384 of 1536), en het signaal in elke cel wordt gekwantificeerd. Groei bij 21 ° C wordt aangegeven in blauw, en groei bij 33 ° C wordt geel gemarkeerd. Kolonies vertoont significant hogere groei bij 21 ° C vergeleken met 33 ° C (gestandaardiseerd ts +) gekozen en gemerkt zwarte vierkanten met een groene stip. Deze keuzes kunnen handmatig worden bewerkt. Definitieve selecties worden overgebracht naar een bestand dat wordt gebruikt door de kolonie-picking robot. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 6" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig6.jpg" /> Figuur 6. Robotic Plukken van de eerste ronde ts Lethal Kandidaten. De cherry-picking robot volgt instructies van een bestand gegenereerd zoals beschreven in stap 2.1 kandidaten kies een nieuwe array. Het bovenste paneel toont het laden van een gesteriliseerde pin. Het onderste paneel toont de precieze plukken van een bepaalde kolonie in de bron plaat. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 7" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig7.jpg" /> Figuur 7. Time-lapse Screening voor Initial sorteren van ts Lethal Phenotypes. Klonen die de twee rondes van screening protocol in figuur 5 doorgegeven worden gerepliceerd naar platen bij een celdichtheid zodat individuele cellen microscopisch worden opgelost. Een gewijzigde tetrad dissectie microscoop wordt gebruikt om posities waarop microfoto&#39;s worden genomen na 0 uur, 10 uur en 20 uur incubaties een identificeren<html> t 33 ° C. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig8.jpg" /> Figuur 8: De Chlamydomonas celcyclus mutanten geïdentificeerd door Time-Lapse Microscopie. (a) Illustratie van de Chlamydomonas unieke celcyclus beschrijft de lange G1 fase gekenmerkt door cellulaire groei, gevolgd door splitsing SM cycli, die eindigen met het uitkomen van de pasgeboren dochter cellen. (b) Microscopische beelden tonen WT cellen tijdens de celcyclus en de identificatie van typische celcyclus mutanten die niet aan mitose voltooien. Schaal bar = 50 micrometer. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="figuur 9" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig9.jpg" /> Figuur 9: Complementatie en scharniermechanisme Test. (a) Een antibioticum resistent (bijv Hygro) vraag met een regelmatig herhalend gemuteerd gen stak in een 96-wells plaat met een aantal mutanten van de tegengestelde mating dat een tweede antibioticum resistentie cassette (bijvoorbeeld Paro) haven. Complementatie platen op grote fractie diploïde zaden zoals blijkt uit het nucleïnezuur kleuring en analyse flowcytometrie (linksonder in a). (b) De paring mengsel wordt getest zowel complementering in diploïde en koppeling in dubbel-resistente meiotische nageslacht. De positieve controle is de query zelf in tegengestelde mating type, en, zoals verwacht, geeft de TS-fenotype bij 33 ° C, terwijl de negatieve controle en toont de WT + ts fenotype. De omcirkelde koloniën tonen geen complementering met de vraag en zijn daarom new TS-allelen voor de query-gen. Deze zijn over het algemeen uitgesloten van verdere karakterisering, omdat alleen &#39;frequent flyers&#39; zijn in de complementatie test set. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Tijd </td><td> OD </td><td> Kolonies opgepikt (#) </td><td> TS-fenotype </td><td> Celcyclus kandidaten </td></tr><tr><td> 1.5 &#39; </td><td> 0,012 </td><td> 6000 (Gem = ~ 200) </td><td> 200 (3,3%) </td><td> 7 (3,5%) </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1 &#39; </td><td rowspan="2"> 0,003 </td><td> 11.000 </td><td rowspan="2"> 131 (1,19%) </td><td rowspan="2"> 15 (11,4%) </td></tr><tr><td> (Gem = ~ 360) </td></tr><tr> &lt;td rowspan = &quot;2&quot;&gt; 0,5 &#39; </td><td rowspan="2"> 6E-04 </td><td> 9000 </td><td rowspan="2"> 40 (0,45%) </td><td rowspan="2"> 1 (2,5%) </td></tr><tr><td> (Gem = ~ 300) </td></tr></tbody></table> Tabel 1: De kalibratie van Bestraling Times om de opbrengst van de celcyclus Mutant Kandidaten maximaliseren. Drie bestraling tijden werden getest (30 platen elk) met bijbehorende ODS te overleven kolonie nummers (200-600) te waarborgen.

Temperatuurgevoelige (ts) letale mutanten zijn waardevolle hulpmiddelen om essentiële functies te identificeren en te analyseren. Hier beschrijven we methoden om ts letale mutanten op grote schaal te genereren en te classificeren.

High-throughput Robotisch Assisted Isolatie van temperatuurgevoelige Lethal Mutants in<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Het algemene doel van de procedure is om robotica en gestandaardiseerde assays in te zetten om de isolatie van temperatuurgevoelige letale mutaties in Chlamydomonas te stroomlijnen, om zo essentiële genen en pathways in dit organisme te bepalen. We zijn geïnteresseerd in zowel de conservatie als de divergentie van essentiële cellulaire functies in eukaryoten. De methode die we hiervoor gebruiken, is het bestuderen van mutaties die essentiële genen in deze processen verstoren.Om dit goed te laten werken, is een zeer uitgebreide collectie mutanten nodig en de methoden die u zult horen zijn onze manier om een dergelijke collectie te genereren. We werken met de groene alg Chlamydomonas reinhardtii als vertegenwoordiger van het plantenrijk. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat temperatuurgevoelige letale mutaties waarschijnlijk in elke essentiële route kunnen worden gevonden.De methode vereist geen voorkennis of gerichte mutagenese. De moleculaire functie van het gemuteerde gen kan direct worden afgeleid uit het lethale fenotype. Dit helpt ons bij het selecteren van interessante mutaties die diverse siala-paden verstoren, buiten de controle van de celcyclus.Om UV-mutagenese uit te voeren, worden Chlamydomonas-cellen gekweekt tot een OD 750 van 0,2 tot 0,5 in 100 milliliters Tris-Acetaat-Fosfaat, of TAP, onder licht bij 25 graden Celsius en schudden op 100 RPM. UV-mutagenese wordt onafhankelijk uitgevoerd in twee genetische achtergronden volgens het tekstprotocol. Controleer een monster van elke cultuur onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de cellen levensvatbaar zijn en er geen contaminatie aanwezig is.Verdun vervolgens de cultuur tot een OD 750 van 0,003 en wikkel de fles in aluminiumfolie om een homogene dichtheid te garanderen, aangezien de stam modaal is en directioneel zwemt als reactie op licht. Nadat de dichtheid van de suspensie conform het tekstprotocol is aangepast, bevestigt u een kleine tube-cassette die past op een vloeistofdispenser en voert u een reeks spoelingen uit voor sterilisatie, volgens de instructies van de fabrikant, om contaminatie te voorkomen. Gebruik een vloeistofdispenser-cassette voor acht spuiten om vier keer 96 druppels van elk twee microliters cultuur op droge rechthoekige platen te dispenseren.Tik voorzichtig tegen de rand van de plaat om ervoor te zorgen dat alle druppels samensmelten tot een dunne vloeistoflaag en dek de platen onmiddellijk af om blootstelling aan licht te voorkomen. Plaats de platen na het drogen onder een germicide UV-lamp gedurende perioden die empirisch zijn bepaald om een optimale opbrengst van ts-mutanten onder de overlevers te verkrijgen. Plaats de platen vervolgens gedurende acht tot 24 uur bij kamertemperatuur in het donker.Plaats de platen vervolgens in een incubator van 21 °C met verlichting. Na ongeveer 10 dagen, wanneer de kolonies zijn gegroeid maar nog niet zijn samengevloeid, worden de platen in de betreffende stapel geladen als bronnen voor robotgestuurde koloniepicking. Pick vervolgens kolonies voor 384-arrays op rechthoekige platen en kweek deze ongeveer een week bij 21 °C met verlichting.Gebruik een replica plating-robot om de 384-arrays te condenseren tot een 1536-array en laat de platen ongeveer drie dagen groeien in de incubator bij 21 °C. Repliceer de 1536-arrays naar telkens twee platen en plaats er één in de incubator bij 21 °C en de andere in een incubator bij 33 °C. Na 24 uur bij 33 °C worden de platen uit de incubator bij 33 °C gerepliceerd naar een nieuwe set voorverwarmde platen en vervolgens in de incubator bij 33 °C geplaatst.Na drie dagen groei bij 33 graden Celsius en vijf dagen groei bij 21 graden Celsius, wordt een digitale camera gebruikt om een roosterplaat te fotograferen die is gemarkeerd met negen uitlijningsindicatoren. Fotografeer vervolgens de platen, waarbij wordt afgewisseld tussen platen van 21 graden Celsius gevolgd door de corresponderende platen van 33 graden Celsius, waarbij alle platen in een vast frame worden geplaatst om de exacte oriëntatie te behouden. Verwerk de gekoppelde beelden van de 21 en 33 graden platen met een aangepaste matte lab-beeldanalysesoftware om de achtergrond te verwijderen en de beelden te segmenteren in een array van 1536.Het programma bepaalt de gedetecteerde biomassa als de totale pixelintensiteit in elke positie. Laad de door de software gegenereerde lijst met geselecteerde kolonies als instructiebestand voor de robotica voor het plukken van enkele kolonies. Bereid vervolgens de bron- en doelplaten voor volgens de instructies van de robotica en laat de robot de geselecteerde kolonies naar een array plukken.Plaats de doelplaten gedurende ongeveer vijf dagen in de incubator bij 21 °C om een stockplaat te laten groeien. Nadat een tweede biomassa-accumulatie-assay is uitgevoerd en 100 blokplaten volgens het tekstprotocol zijn gerepliceerd, worden de verse kopieën van de 100 blokplaten gerepliceerd naar drie kopieën. Nadat de derde plaat in de robot is geplaatst en de kolonies zijn gespot, worden er op tijdstip nul fotomicrografieën gemaakt van een regio van elke spot op de screeningplaten, waarna de platen voor incubatie bij 33 °C worden geplaatst.Maak op verschillende tijdstippen na het verwijderen van de screeningplaten uit de incubator van 33 °C snel fotomicrografieën, waarbij u ervoor zorgt dat de platenhouder en de tafelcontroller nauwkeurig zijn gekalibreerd om beelden van dezelfde cellen op elk tijdstip te verkrijgen. Analyseer de microscopische beelden en selecteer mutanten op basis van de gewenste criteria. Spot de uiteindelijke geselecteerde set in een 96-wells array-agarplaat, waarbij u er zeker van bent dat elke plaat mutanten van hetzelfde paringstype en dezelfde drugresistentie bevat.Breng grote hoeveelheden van de gearrangeerde kolonies over naar stikstofvrij gameten-inductiemedium op 96-well microplaten. Incubeer de platen onder licht gedurende ongeveer vijf uur om gametogenese mogelijk te maken. Suspendeer queries met de tegenovergestelde paringstypen die de alternatieve resistentiecassettes bevatten in buisjes met stikstofvrij gameten-inductiemedium voor gametogenese.Meng de monsters van een doelplaat in een paringsmengselvolume van 20 µL. Na ongeveer 10 minuten onder het licht, spot vijf µL uit elke put twee keer. Eén keer op een TAP-plaat voor koppelingstesten en één keer op een TAP-plaat aangevuld met vijf µmol paro plus negen µmol hygro voor complementatietesten.Na incubatie van de platen voor de complementatietest worden de platen gereproduceerd in twee kopieën voor de identificatie van het ts-fenotype. Test de koloniën op het ts-fenotype volgens het tekstprotocol. Na bestraling van individuele cellen van Chlamydomonas krijgen de cellen tien dagen de tijd om te groeien bij een permissieve temperatuur, waarna ze in een array-formaat worden uitgeplukt, zoals hier te zien is.De resulterende platen in het 384-formaat worden samengevoegd tot een array van 1536. Er werden drie UV-belichtingstijden getest om Chlamydomonas ts-mutanten te genereren. Empirisch gezien leverde de belichtingstijd van 1,5 minuut de meeste ts-mutanten op.Echter leverde de blootstellingstijd van één minuut bij verre het meeste aantal kandidaten voor de celcyclus op. In dit experiment werden twee opeenvolgende assays voor het ts-fenotype uitgevoerd en werden ongeveer 3000 ts-mutanten geïsoleerd en fenotypisch gekarakteriseerd via time-lapse microscopie. Zoals hier te zien is, werden complementatie- en koppelingstesten met reeds gekarakteriseerde genen met meer dan twee allelen uitgevoerd op de nieuw verzamelde kandidaten om zeer frequent voorkomende genen uit de verdere pijplijn te verwijderen.Deze kolonies vertonen geen complementatie met de query en vormen daarom nieuwe ts-allelen voor het onderzochte gen. Deze worden over het algemeen uitgesloten van verdere karakterisering. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze met een hoge doorvoersnelheid worden uitgevoerd.Duizenden ts-mutanten kunnen in slechts twee of drie mutageneserondes worden geïsoleerd. Een cruciale stap na de isolatie van de ts-mutanten is het selecteren van een subset voor verder onderzoek, waarbij het zeer interessant is om het scala aan lethale fenotypes te observeren. Fenotypering geeft aanwijzingen over de moleculaire functie en helpt ons bovendien bij het prioriteren van mutanten voor nader onderzoek.Houd er rekening mee dat de mutanten honderden of duizenden mutaties in hun genomen kunnen hebben. Meestal is er slechts één causaal, hoewel er soms twee mutaties nodig zijn voor het ts-fenotype; dit kan worden vastgesteld via tetra-analyse. Na deze procedure kunnen causale mutaties worden geïdentificeerd door next-generation sequencing-analyse van pools. De geïdentificeerde genen bevatten soms mutaties die iets over de functie suggereren, of het kunnen nieuwe, onbekende sequenties zijn, wat interessant en opwindend is.Chlamydomonas is een uitstekend modelsysteem geweest voor het bestuderen van de celbiologie binnen het plantenrijk. De beschreven procedures zouden het onderzoek naar dit organisme moeten ontsluiten voor essentiële processen die relatief weinig zijn onderzocht, en we hopen dat de resultaten ook relevant zullen zijn voor het bredere plantenrijk.

high-throughput-robotically-assisted-isolation-temperature-sensitive

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Paring en tetrade scheiding nodig zijn voor genetische analyse...

Paring en Viertal Scheiding van Chlamydomonas reinhardtii Voor Genetische analyse

We beschrijven een methode om genetische analyse in Chlamydia op basis van chemische mutagenese en hele genoom sequencing uitvoeren. Bovendien wordt een systeem voor het uitwisselen van DNA in geïnfecteerde cellen beschreven die kunnen worden gebruikt voor genetische mapping. Deze methode kan breed toepasbaar microbiële systemen ontbreekt transformatiesystemen en moleculair genetische hulpmiddelen.

Forward Genetische technieken in<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Elektroporatie is een algemeen gebruikte werkwijze voor het introduceren van DNA in bacteriën in een proces dat transformatie. Traditionele protocollen voor de bereiding van elektrocompetente cellen tijdrovend en arbeidsintensief. Dit artikel beschrijft een alternatieve, snelle en efficiënte werkwijze voor de bereiding van elektrocompetente cellen thans werkzaam sommige laboratoria.

Rapid protocol voor de bereiding van Elektrocompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En<em&gt; Vibrio cholerae</em

Een high-throughput, geautomatiseerde, tabak protoplast productie en transformatie methode is beschreven. Het robotsysteem maakt massively parallel genexpressie en ontdekking in het model BY-2 systeem dat vertaalbaar naar niet-model gewassen zou moeten zijn.

Een Robotic Platform voor High-throughput protoplastisola- en Transformatie

We hebben een strategie om te zuiveren en het beeld van een groot aantal centrioles in verschillende richtingen vatbaar voor super-resolutie microscopie en single-deeltje gemiddeld ontwikkeld.

Isolatie en fluorescentie Imaging voor Single-deeltje wederopbouw van Chlamydomonas Centrioles

Systeembrede analyse van meerdere biomoleules is cruciaal om functionele en mechanistische inzichten in biologische processen te krijgen. Hierbij wordt een uitgebreid protocol beschreven voor een hoge doorvoer extractie van lipiden, metabolieten, eiwitten en zetmeel uit een enkel monster geoogst uit gesynchroniseerde Chlamydomonas-cultuur.

Een multi-omics extractiemethode voor de diepgaande analyse van gesynchroniseerde culturen van de groene Alga Chlamydomonas Chlamydomonas

Hier beschreven is een methode voor gerichte, markerless gen verwijdering in Chlamydia trachomatis met behulp van floxed cassette allelic uitwisseling mutagenese, FLAEM.

Markerless Gene Deletion door Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Dit protocol maakt gebruik van fluorescerende promotor-verslaggevers, live-cel microscopie, en individuele opname extractie in een gerichte voorwaartse genetische benadering te identificeren en isoleren van ontwikkelingsmutanten van Chlamydia trachomatis.

Live-Cell Forward Genetische Benadering voor identificeren en isoleren developmental mutanten in Chlamydia trachomatis

De in vitro reactivering van beweeglijke cellen is een cruciaal experiment in het begrijpen van de mechanismen van celmotiliteit. Het protocol beschrijft het reactiveren van de gedemembraneerde celmodellen van Chlamydomonas reinhardtii, een modelorganisme om trilharen/flagellen te bestuderen.

Reactivering van gedemembraneerde celmodellen in Chlamydomonas reinhardtii

De meeste zwemmende fotoautotrofe organismen vertonen foto-geïnduceerde gedragsveranderingen (fotogedrag). Het huidige protocol observeert het genoemde fotogedrag in het modelorganisme Chlamydomonas reinhardtii.

Observatie van Photobehavior in Chlamydomonas reinhardtii

Hier presenteren we een experimenteel evolutieprotocol voor aanpassing bij thermofielen met behulp van goedkope, energiezuinige bench-top thermomixers als incubatoren. De techniek wordt gedemonstreerd door de karakterisering van temperatuuraanpassing in Sulfolobus acidocaldarius, een archaeon met een optimale groeitemperatuur van 75 °C.

Aanpassing aan de uitersten van het leven: experimentele evolutie met de extremofiele Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

Leer een geautomatiseerde methode voor het isoleren van temperatuurgevoelige letale mutanten in Chlamydomonas reinhardtii. Deze techniek identificeert essentiële genen en celbiologische processen.

High-throughput Robotisch Assisted Isolatie van temperatuurgevoelige Lethal Mutants in

Meer video's verkennen